引用本文： 滿忠松, 趙鑫, 欒立鵬, 張喆, 孫明兵, 張海濤, 陳冰心. B7S1 在胃癌中的表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(3): 284-290. doi: 10.7507/1007-9424.201908019 復制
胃癌是最常見消化道惡性腫瘤之一，預后不良。根據全球癌癥數據顯示，2018 年胃癌新發病例約 100.3 萬例，約 78.3 萬例死亡，位于惡性腫瘤發病率第 5 位，死亡率第 2 位[1]。雖然胃癌的綜合治療水平不斷提高，但療效仍不盡人意。
腫瘤免疫學的發展，使抗腫瘤免疫治療成為胃癌治療新措施。B7 家族是調節免疫應答的主要共刺激分子，在調節效應 T 淋巴細胞免疫應答、機體炎癥和腫瘤進展方面起著重要的作用[2-4]。免疫逃逸是腫瘤惡性進展的主要機制之一，而 B7 家族中的一些成員則介導腫瘤免疫逃逸[5-7]。B7S1 是新發現的 B7 家族負性共刺激分子，隨著對抗腫瘤免疫研究的進展，B7S1 在腫瘤中的作用已引起學者們的廣泛關注。B7S1 mRNA 廣泛表達于外周組織和人體器官，但 B7S1 蛋白卻很少在正常組織器官中被檢測，其分布于多種腫瘤細胞及其癌細胞所處微環境[8-10]和腫瘤患者外周血液中[11-12]。然而，關于 B7S1 在胃癌中的表達及與患者臨床病理特征及預后的相關性，仍有待進一步研究。本研究通過 RT-PCR 和免疫組化法檢測 B7S1 在胃癌和相對應癌旁組織中的表達，分析 B7S1 表達與胃癌患者臨床病理特征和預后之間的關系。
1 資料與方法
1.1 研究對象
1.1.1 納入標準
① 所有患者術前均未接受放療、化療、免疫治療和靶向治療；② 所有患者術后均經病理學檢查證實為胃癌；③ 本研究所有內容均獲得蘇州大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準。
1.1.2 排除標準
① 合并其他惡性腫瘤患者；② 術后隨訪失聯患者；③ 不同意簽署知情同意書患者。
1.1.3 病例資料
回顧性分析蘇州大學附屬第一醫院普外科 2013 年 1 月年至 2014 年 3 月期間手術切除的 78 例胃癌標本和對應癌旁組織 78 例（距離癌組織>2 cm、<5 cm）。于標本離體 30 min 內，無菌條件下采集癌組織和相應癌旁組織各 2 份，1 份石蠟包埋固定，另 1 份于–80 ℃ 冰箱內留存備檢。78 例患者臨床資料特征如下：男 60 例，女 18 例；年齡 29～90 歲，平均年齡 62.9 歲，≤60 歲者 27 例，>60 歲者 51 例；腫瘤直徑≤5 cm 者 48 例，>5 cm 者 30 例；有淋巴結轉移 52 例，無淋巴結轉移 26 例；根據 TNM 分期，Ⅰ期 11 例，Ⅱ期 27 例，Ⅲ期 35 例，Ⅳ期 5 例（依照第 8 版 AJCC 癌癥分期進行）[13]。
1.2 方法
1.2.1 胃癌組織及其癌旁組織中 B7S1 mRNA 表達檢測
采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測。取碾磨至細粉末狀的胃癌組織及癌旁組織標本，使用 Trizol-氯仿-異丙醇方法提取 RNA。按照 Prime Script RT Master 說明書流程逆轉錄。用提取的總 RNA 作為模板，逆轉錄成 cDNA。然后以 cDNA 為模板，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，反應程序為 95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環，進行 PCR 擴增，檢測胃癌組織和癌旁組織中 B7S1 mRNA 的相對表達量。計算 3 次實驗平均值作為每個樣本的實際值。Trizol 試劑購于美國 Invitrogrn 公司。
1.2.2 胃癌組織及其癌旁組織中 B7S1 蛋白表達檢測
采用免疫組織化學 SP 法檢測胃癌組織及其癌旁組織中 B7S1 蛋白的表達及分布。取蠟塊包埋的胃癌組織及其癌旁組織，切片、烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、枸櫞酸緩沖液中煮沸抗原修復、5%BSA 封閉、加抗體孵育過夜、蘇木精染色、二甲苯透明化、中性樹脂封片、顯微鏡下觀察（具體步驟參照 SP 染色試劑盒說明書）。B7S1 抗體購于美國 Abcam 公司。
1.2.3 結果判讀
免疫組化陽性結果判讀：B7S1 陽性染色定位于細胞膜或（和）細胞漿，染色為黃褐色或棕褐色；在 400 倍光鏡下對每張切片隨機選擇 5 個視野行陽性細胞計數，染色陽性細胞按<10%、10%～50%、50%～75%及>75% 分別計 1、2、3 和 4 分。B7S1 染色強度判定標準：對每張切片細胞染色強度按無染色、染色弱（淡黃色）、染色中等（棕黃色）和染色強（棕褐色）分別計 0、1、2 和 3 分。然后根據上述 2 項計分的乘積作為最終的判斷結果，計分數<3 分為陰性表達，≥3 分為陽性表達。
1.3 隨訪
本組 78 例患者的隨訪時間為 3～74 個月，隨訪時間截止至 2019 年 4 月 1 日。生存時間為患者手術當日至隨訪截止日期或至患者死亡日期；術后 2 年內每 3 個月隨訪 1 次，術后 2～5 年每 6 個月隨訪 1 次，術后 5 年以上每 12 個月隨訪 1 次。隨訪方式為門診復診和電話詢問。
1.4 統計學方法
應用 SPSS22.0 統計軟件進行相關資料分析。計量結果以均數±標準差（
±s）表示，B7S1 表達與臨床病理特征的關系采用 χ2 檢驗或秩和檢驗；腫瘤與癌旁組織 B7S1 mRNA 的相對表達分析采用 t 檢驗；采用 Kaplan-Meier 法進行生存率計算和繪制生存曲線，各組生存曲線的比較采用 log-rank 檢驗；采用 Cox 回歸分析模型進行分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 B7S1 mRNA 在胃癌及其癌旁組織中表達檢測結果
B7S1 mRNA 在胃癌組織中的相對表達量高于癌旁組織，其差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1a。
圖1
示 B7S1 mRNA 和蛋白在胃癌及其癌旁組織中的表達
a：B7S1 mRNA 在胃癌及其癌旁組織中的相對表達量；b：B7S1 蛋白在癌旁組織中呈低表達（SP ×400）；c：B7S1 蛋白在胃癌組織中呈高表達（SP ×400）
2.2 B7S1 蛋白在胃癌和癌旁組織中表達檢測結果
胃癌組織中 B7S1 陽性染色定位于細胞膜或（和）細胞漿，染色為黃褐色或棕褐色。78 例患者中 58 例胃癌組織中 B7S1 表達陽性，20 例表達陰性，表達陽性率為 74.36%；在癌旁組織中 B7S1 蛋白不表達或呈弱陽性表達，表達陽性者 9 例，表達陽性率為 11.54%。免疫組化結果顯示 B7S1 在胃癌組織中的表達陽性率顯著高于癌旁組織，其差異有統計學意義（P=0.001），見圖 1b 和 1c。
2.3 B7S1 蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征相關性分析結果
為評估 B7S1 蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系，采用卡方檢驗分析胃癌腫瘤組織中 B7S1 蛋白表達與患者臨床病理特征相關性。結果顯示：B7S1 蛋白的表達與腫瘤直徑存在相關性（χ2=9.205，P=0.006）；B7S1 蛋白的表達與胃癌病理分期存在相關性（χ2=12.177，P=0.002），分期晚，患者 B7S1 蛋白表達陽性率高；與 T 分期存在相關性（χ2=6.509，P=0.011），腫瘤浸潤深度深，B7S1 蛋白表達陽性表達率高；與淋巴結轉移存在相關性（χ2=10.789，P=0.001），有淋巴結轉移者 B7S1 蛋白表達陽性率高；與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤分化程度以及遠處轉移均無相關性（P>0.05），見表 1。該結果提示：B7S1 蛋白陽性表達與胃癌患者不良病理學特征存在相關性。
表1
胃癌組織中 B7S1 蛋白的表達與患者臨床病理因素相關性
2.4 B7S1 蛋白表達與胃癌患者預后相關性分析結果
本組患者均獲隨訪，隨訪時間 3～74 個月，中位生存時間 56 個月。本組 78 例胃癌患者的預后與 B7S1 蛋白表達及其臨床病理資料的相關性的單因素分析和多因素分析結果見表 2 和表 3。單因素分析結果顯示：年齡（P=0.003）、腫瘤直徑（P=0.007）、病理分期（P=0.003）、T 分期（P=0.001）、N 分期（P=0.001）、M 分期（P=0.010）、化療（P=0.002）和 B7S1 表達（P=0.012）對患者的預后有影響。調整 性別、年齡、腫瘤部位、病理分期等相關臨床資料后，COX 多因素分析結果顯示性別（P=0.035）、年齡（P=0.019）、病理分期（P=0.031）、化療（P=0.013）和 B7S1 表達（P=0.037）是影響胃癌患者預后的因素。采用 Kaplan-Meier 法進行生存分析繪制的生存曲線（圖 2）顯示：B7S1 蛋白表達陽性者的總生存率低于表達陰性者（P=0.012）。該結果提示：B7S1 蛋白陽性表達為胃癌患者預后不良的危險因素。
表2
胃癌患者預后與其臨床病理特征和 B7S1 蛋白表達的單因素分析結果
圖2
示胃癌組織中 B7S1 蛋白不同表達情況患者的生存曲線
表3
胃癌患者預后與其臨床病理特征和 B7S1 蛋白表達 COX 多因素分析結果
3 討論
根治性外科手術，術后輔以放化療是胃癌患者常規的治療方式，但放化療在殺死腫瘤細胞的同時，對正常組織和細胞造成巨大毒性和損傷，對許多患者而言，術后放化療并不是最佳治療方案[14-15]。腫瘤治療過程中 T 淋巴細胞增殖能力減弱、衰竭，細胞因子分泌功能障礙和細胞周期進展阻滯是免疫逃逸的主要原因[16-17]。近年，腫瘤生物治療備受關注和研究，有研究[18-19]表明，B7S1 在介導 T 細胞衰竭中起重要作用。
B7S1 也稱 B7-H4 或 B7x，是 Sica 等[18]于 2003 年發現的隸屬于 B7 家族的新型共刺激分子，位于人染色體 1p11.1，cDNA 約 1.8 kb，在基因組上跨越 66 kbp，由 6 個外顯子和 5 個內含子組成。人 B7S1 蛋白結構包括信號肽區、免疫球蛋白功能區、羧基末端疏水性跨膜區和 1 對 V、C 免疫球蛋白胞外區，屬于 I 型跨膜糖蛋白，通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）鉚釘在細胞膜上[18-19]。GPI 這一結構使得 B7S1 有利于接近主要組織相容性復合體（MHC），產生負性共刺激介導[20-21]。
本研究采用免疫組織化學法和 RT-PCR 法檢測 B7S1 蛋白和 mRNA 在胃癌及其癌旁組織中的表達分布，其結果顯示：B7S1 mRNA 在胃癌組織中的相對表達量高于癌旁組織，B7S1 蛋白在胃癌組織中的表達陽性率也高于癌旁組織，且與胃癌的臨床病理特征存在相關性。胃癌組織中 B7S1 蛋白表達陽性率越高，患者的 T 分期和病理分期越晚，淋巴結轉移率越高。Guo 等[22]研究顯示，B7S1 的表達與腫瘤免疫浸潤中的基質細胞相關，表達與腫瘤病理分期正相關。也有學者[23]通過沉默 B7S1，發現胃癌細胞的致瘤性減弱，B7S1 表達與淋巴結轉移和病理分期正相關。本研究生存分析結果顯示，B7S1 為胃癌患者不良預后的風險因素，相比 B7S1 蛋白陰性表達患者，B7S1 蛋白陽性表達患者生存率降低。Jiang 等[10]通過對 156 例胃癌患者分析顯示，B7S1 在胃癌中陽性表達率為 44.9%，相比 B7S1 低表達患者，高表達患者死亡風險增加 1.25 倍，與本研究結果基本一致。
B7S1 與其他消化系統腫瘤的關系已被廣泛報道。B7S1 在胰腺癌組織中高表達，其表達與有淋巴結轉移、T 分期和病理分期相關，相比 B7S1 低表達患者，高表達患者預后不良（P<0.01）[8, 24]。相比健康志愿者，結直腸癌患者血漿中 B7S1 水平顯著升高，且 B7S1 表達與腫瘤浸潤深度、腫瘤直徑和淋巴結轉移密切相關，高表達意味著患者不良預后[25]。Zhang 等[26]研究結果顯示，B7S1 在肝癌患者血清中高表達，與 AFP 水平和腫瘤病理分期呈正相關，而且相比低表達患者，B7S1 高表達患者有著更低的 5 年生存率。B7S1 可使肝癌細胞發生免疫逃逸，特異性阻斷 B7S1 可在一定程度上抑制 T 細胞的衰竭和增殖阻滯[27]。B7S1 在食管癌組織中高表達，與不良病理特征相關，而且 B7S1 與食管癌中 CD3+和 CD8+浸潤的細胞數目呈負相關[28]。
大量研究[22, 27-30]顯示，B7S1 在腫瘤微環境中為負性調節因子，關系著腫瘤惡性進展，與患者不良預后相關，特異性阻斷其信號通路顯示出了強大的抗腫瘤免疫效應。Zang 等[16]研究結果顯示，B7S1 Ig 可抑制 T 淋巴細胞增殖和 IL-2 分泌。Choi 等[20]研究結果顯示，B7S1 通過抗 CD3 激活而阻滯 T 細胞周期循環。另有多項研究表明，B7S1 陽性表達與多種惡性腫瘤的惡性進展密切相關，如乳腺癌[8, 31]、卵巢癌[32]、肺癌[33-34]、腎癌[35]等。與表達在腫瘤細胞中的 PD-L1 不同，B7S1 主要表達于抗原遞呈細胞，其潛在受體（B7S1R）與 PD-1 共表達于 CD4+和 CD8+ T 細胞表面[25]。PD-1 是抗腫瘤免疫阻滯劑，通過防止 T 淋巴細胞衰竭和重新激活腫瘤組織中 T 淋巴細胞起免疫殺傷作用。然而，臨床抗 PD-1 治療中，未顯示出完美的療效，即使在最初對 PD1-PDL1 治療有良好反應的患者中，部分患者仍存在高的復發率，這表明存在可繞過 PD1 信號傳導而抑制 T 細胞活化的信號通路[24,36]。B7S1 及其受體 B7S1R 通過降低腫瘤細胞中 CD8+ T 細胞顆粒酶 B 和穿孔素抑制 T 細胞增殖，可能是 PD1 治療過程中抵抗的潛在因素[27]。阻斷 CD8+ T 細胞 B7S1-B7S1R 信號通路，顯示出良好的抑腫瘤效應，聯合抗 PD1 和 B7S1 通路，顯示出強大的抗腫瘤效應[28]。據此，我們推測 B7S1 在介導腫瘤免疫逃逸過程中既存在單獨的信號通路，也可能存在與 PD1 協同作用通路促使 T 細胞衰竭。
B7S1 在胃癌中的復雜信號調節網絡仍有待進一步研究，調控 B7S1 表達有可能成為腫瘤治療的新策略。本研究結果顯示：B7S1 在胃癌組織中高表達，其表達與腫瘤直徑、T 分期、淋巴結轉移和病理分期相關；生存分析結果顯示：B7S1 為胃癌患者預后不良的風險因素。基于本研究和以上討論，我們推測 B7S1 促進胃癌的惡性進展。深入研究 B7S1 在腫瘤中的作用機制可為腫瘤免疫治療提供新的線索。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：滿忠松負責研究的具體實施與數據分析、論文撰寫；陳冰心負責實驗設計；趙鑫、孫明兵負責標本切片、免疫組化染色；欒立鵬、張喆負責收集患者資料、隨訪。
倫理聲明：本研究通過了蘇州大學附屬第一醫院倫理委員會審批。
胃癌是最常見消化道惡性腫瘤之一，預后不良。根據全球癌癥數據顯示，2018 年胃癌新發病例約 100.3 萬例，約 78.3 萬例死亡，位于惡性腫瘤發病率第 5 位，死亡率第 2 位[1]。雖然胃癌的綜合治療水平不斷提高，但療效仍不盡人意。
腫瘤免疫學的發展，使抗腫瘤免疫治療成為胃癌治療新措施。B7 家族是調節免疫應答的主要共刺激分子，在調節效應 T 淋巴細胞免疫應答、機體炎癥和腫瘤進展方面起著重要的作用[2-4]。免疫逃逸是腫瘤惡性進展的主要機制之一，而 B7 家族中的一些成員則介導腫瘤免疫逃逸[5-7]。B7S1 是新發現的 B7 家族負性共刺激分子，隨著對抗腫瘤免疫研究的進展，B7S1 在腫瘤中的作用已引起學者們的廣泛關注。B7S1 mRNA 廣泛表達于外周組織和人體器官，但 B7S1 蛋白卻很少在正常組織器官中被檢測，其分布于多種腫瘤細胞及其癌細胞所處微環境[8-10]和腫瘤患者外周血液中[11-12]。然而，關于 B7S1 在胃癌中的表達及與患者臨床病理特征及預后的相關性，仍有待進一步研究。本研究通過 RT-PCR 和免疫組化法檢測 B7S1 在胃癌和相對應癌旁組織中的表達，分析 B7S1 表達與胃癌患者臨床病理特征和預后之間的關系。
1 資料與方法
1.1 研究對象
1.1.1 納入標準
① 所有患者術前均未接受放療、化療、免疫治療和靶向治療；② 所有患者術后均經病理學檢查證實為胃癌；③ 本研究所有內容均獲得蘇州大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準。
1.1.2 排除標準
① 合并其他惡性腫瘤患者；② 術后隨訪失聯患者；③ 不同意簽署知情同意書患者。
1.1.3 病例資料
回顧性分析蘇州大學附屬第一醫院普外科 2013 年 1 月年至 2014 年 3 月期間手術切除的 78 例胃癌標本和對應癌旁組織 78 例（距離癌組織>2 cm、<5 cm）。于標本離體 30 min 內，無菌條件下采集癌組織和相應癌旁組織各 2 份，1 份石蠟包埋固定，另 1 份于–80 ℃ 冰箱內留存備檢。78 例患者臨床資料特征如下：男 60 例，女 18 例；年齡 29～90 歲，平均年齡 62.9 歲，≤60 歲者 27 例，>60 歲者 51 例；腫瘤直徑≤5 cm 者 48 例，>5 cm 者 30 例；有淋巴結轉移 52 例，無淋巴結轉移 26 例；根據 TNM 分期，Ⅰ期 11 例，Ⅱ期 27 例，Ⅲ期 35 例，Ⅳ期 5 例（依照第 8 版 AJCC 癌癥分期進行）[13]。
1.2 方法
1.2.1 胃癌組織及其癌旁組織中 B7S1 mRNA 表達檢測
采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測。取碾磨至細粉末狀的胃癌組織及癌旁組織標本，使用 Trizol-氯仿-異丙醇方法提取 RNA。按照 Prime Script RT Master 說明書流程逆轉錄。用提取的總 RNA 作為模板，逆轉錄成 cDNA。然后以 cDNA 為模板，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，反應程序為 95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環，進行 PCR 擴增，檢測胃癌組織和癌旁組織中 B7S1 mRNA 的相對表達量。計算 3 次實驗平均值作為每個樣本的實際值。Trizol 試劑購于美國 Invitrogrn 公司。
1.2.2 胃癌組織及其癌旁組織中 B7S1 蛋白表達檢測
采用免疫組織化學 SP 法檢測胃癌組織及其癌旁組織中 B7S1 蛋白的表達及分布。取蠟塊包埋的胃癌組織及其癌旁組織，切片、烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、枸櫞酸緩沖液中煮沸抗原修復、5%BSA 封閉、加抗體孵育過夜、蘇木精染色、二甲苯透明化、中性樹脂封片、顯微鏡下觀察（具體步驟參照 SP 染色試劑盒說明書）。B7S1 抗體購于美國 Abcam 公司。
1.2.3 結果判讀
免疫組化陽性結果判讀：B7S1 陽性染色定位于細胞膜或（和）細胞漿，染色為黃褐色或棕褐色；在 400 倍光鏡下對每張切片隨機選擇 5 個視野行陽性細胞計數，染色陽性細胞按<10%、10%～50%、50%～75%及>75% 分別計 1、2、3 和 4 分。B7S1 染色強度判定標準：對每張切片細胞染色強度按無染色、染色弱（淡黃色）、染色中等（棕黃色）和染色強（棕褐色）分別計 0、1、2 和 3 分。然后根據上述 2 項計分的乘積作為最終的判斷結果，計分數<3 分為陰性表達，≥3 分為陽性表達。
1.3 隨訪
本組 78 例患者的隨訪時間為 3～74 個月，隨訪時間截止至 2019 年 4 月 1 日。生存時間為患者手術當日至隨訪截止日期或至患者死亡日期；術后 2 年內每 3 個月隨訪 1 次，術后 2～5 年每 6 個月隨訪 1 次，術后 5 年以上每 12 個月隨訪 1 次。隨訪方式為門診復診和電話詢問。
1.4 統計學方法
應用 SPSS22.0 統計軟件進行相關資料分析。計量結果以均數±標準差（±s）表示，B7S1 表達與臨床病理特征的關系采用 χ2 檢驗或秩和檢驗；腫瘤與癌旁組織 B7S1 mRNA 的相對表達分析采用 t 檢驗；采用 Kaplan-Meier 法進行生存率計算和繪制生存曲線，各組生存曲線的比較采用 log-rank 檢驗；采用 Cox 回歸分析模型進行分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 B7S1 mRNA 在胃癌及其癌旁組織中表達檢測結果
B7S1 mRNA 在胃癌組織中的相對表達量高于癌旁組織，其差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1a。
圖1
示 B7S1 mRNA 和蛋白在胃癌及其癌旁組織中的表達
a：B7S1 mRNA 在胃癌及其癌旁組織中的相對表達量；b：B7S1 蛋白在癌旁組織中呈低表達（SP ×400）；c：B7S1 蛋白在胃癌組織中呈高表達（SP ×400）
2.2 B7S1 蛋白在胃癌和癌旁組織中表達檢測結果
胃癌組織中 B7S1 陽性染色定位于細胞膜或（和）細胞漿，染色為黃褐色或棕褐色。78 例患者中 58 例胃癌組織中 B7S1 表達陽性，20 例表達陰性，表達陽性率為 74.36%；在癌旁組織中 B7S1 蛋白不表達或呈弱陽性表達，表達陽性者 9 例，表達陽性率為 11.54%。免疫組化結果顯示 B7S1 在胃癌組織中的表達陽性率顯著高于癌旁組織，其差異有統計學意義（P=0.001），見圖 1b 和 1c。
2.3 B7S1 蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征相關性分析結果
為評估 B7S1 蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系，采用卡方檢驗分析胃癌腫瘤組織中 B7S1 蛋白表達與患者臨床病理特征相關性。結果顯示：B7S1 蛋白的表達與腫瘤直徑存在相關性（χ2=9.205，P=0.006）；B7S1 蛋白的表達與胃癌病理分期存在相關性（χ2=12.177，P=0.002），分期晚，患者 B7S1 蛋白表達陽性率高；與 T 分期存在相關性（χ2=6.509，P=0.011），腫瘤浸潤深度深，B7S1 蛋白表達陽性表達率高；與淋巴結轉移存在相關性（χ2=10.789，P=0.001），有淋巴結轉移者 B7S1 蛋白表達陽性率高；與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤分化程度以及遠處轉移均無相關性（P>0.05），見表 1。該結果提示：B7S1 蛋白陽性表達與胃癌患者不良病理學特征存在相關性。
表1
胃癌組織中 B7S1 蛋白的表達與患者臨床病理因素相關性
2.4 B7S1 蛋白表達與胃癌患者預后相關性分析結果
本組患者均獲隨訪，隨訪時間 3～74 個月，中位生存時間 56 個月。本組 78 例胃癌患者的預后與 B7S1 蛋白表達及其臨床病理資料的相關性的單因素分析和多因素分析結果見表 2 和表 3。單因素分析結果顯示：年齡（P=0.003）、腫瘤直徑（P=0.007）、病理分期（P=0.003）、T 分期（P=0.001）、N 分期（P=0.001）、M 分期（P=0.010）、化療（P=0.002）和 B7S1 表達（P=0.012）對患者的預后有影響。調整 性別、年齡、腫瘤部位、病理分期等相關臨床資料后，COX 多因素分析結果顯示性別（P=0.035）、年齡（P=0.019）、病理分期（P=0.031）、化療（P=0.013）和 B7S1 表達（P=0.037）是影響胃癌患者預后的因素。采用 Kaplan-Meier 法進行生存分析繪制的生存曲線（圖 2）顯示：B7S1 蛋白表達陽性者的總生存率低于表達陰性者（P=0.012）。該結果提示：B7S1 蛋白陽性表達為胃癌患者預后不良的危險因素。
表2
胃癌患者預后與其臨床病理特征和 B7S1 蛋白表達的單因素分析結果
圖2
示胃癌組織中 B7S1 蛋白不同表達情況患者的生存曲線
表3
胃癌患者預后與其臨床病理特征和 B7S1 蛋白表達 COX 多因素分析結果
3 討論
根治性外科手術，術后輔以放化療是胃癌患者常規的治療方式，但放化療在殺死腫瘤細胞的同時，對正常組織和細胞造成巨大毒性和損傷，對許多患者而言，術后放化療并不是最佳治療方案[14-15]。腫瘤治療過程中 T 淋巴細胞增殖能力減弱、衰竭，細胞因子分泌功能障礙和細胞周期進展阻滯是免疫逃逸的主要原因[16-17]。近年，腫瘤生物治療備受關注和研究，有研究[18-19]表明，B7S1 在介導 T 細胞衰竭中起重要作用。
B7S1 也稱 B7-H4 或 B7x，是 Sica 等[18]于 2003 年發現的隸屬于 B7 家族的新型共刺激分子，位于人染色體 1p11.1，cDNA 約 1.8 kb，在基因組上跨越 66 kbp，由 6 個外顯子和 5 個內含子組成。人 B7S1 蛋白結構包括信號肽區、免疫球蛋白功能區、羧基末端疏水性跨膜區和 1 對 V、C 免疫球蛋白胞外區，屬于 I 型跨膜糖蛋白，通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）鉚釘在細胞膜上[18-19]。GPI 這一結構使得 B7S1 有利于接近主要組織相容性復合體（MHC），產生負性共刺激介導[20-21]。
本研究采用免疫組織化學法和 RT-PCR 法檢測 B7S1 蛋白和 mRNA 在胃癌及其癌旁組織中的表達分布，其結果顯示：B7S1 mRNA 在胃癌組織中的相對表達量高于癌旁組織，B7S1 蛋白在胃癌組織中的表達陽性率也高于癌旁組織，且與胃癌的臨床病理特征存在相關性。胃癌組織中 B7S1 蛋白表達陽性率越高，患者的 T 分期和病理分期越晚，淋巴結轉移率越高。Guo 等[22]研究顯示，B7S1 的表達與腫瘤免疫浸潤中的基質細胞相關，表達與腫瘤病理分期正相關。也有學者[23]通過沉默 B7S1，發現胃癌細胞的致瘤性減弱，B7S1 表達與淋巴結轉移和病理分期正相關。本研究生存分析結果顯示，B7S1 為胃癌患者不良預后的風險因素，相比 B7S1 蛋白陰性表達患者，B7S1 蛋白陽性表達患者生存率降低。Jiang 等[10]通過對 156 例胃癌患者分析顯示，B7S1 在胃癌中陽性表達率為 44.9%，相比 B7S1 低表達患者，高表達患者死亡風險增加 1.25 倍，與本研究結果基本一致。
B7S1 與其他消化系統腫瘤的關系已被廣泛報道。B7S1 在胰腺癌組織中高表達，其表達與有淋巴結轉移、T 分期和病理分期相關，相比 B7S1 低表達患者，高表達患者預后不良（P<0.01）[8, 24]。相比健康志愿者，結直腸癌患者血漿中 B7S1 水平顯著升高，且 B7S1 表達與腫瘤浸潤深度、腫瘤直徑和淋巴結轉移密切相關，高表達意味著患者不良預后[25]。Zhang 等[26]研究結果顯示，B7S1 在肝癌患者血清中高表達，與 AFP 水平和腫瘤病理分期呈正相關，而且相比低表達患者，B7S1 高表達患者有著更低的 5 年生存率。B7S1 可使肝癌細胞發生免疫逃逸，特異性阻斷 B7S1 可在一定程度上抑制 T 細胞的衰竭和增殖阻滯[27]。B7S1 在食管癌組織中高表達，與不良病理特征相關，而且 B7S1 與食管癌中 CD3+和 CD8+浸潤的細胞數目呈負相關[28]。
大量研究[22, 27-30]顯示，B7S1 在腫瘤微環境中為負性調節因子，關系著腫瘤惡性進展，與患者不良預后相關，特異性阻斷其信號通路顯示出了強大的抗腫瘤免疫效應。Zang 等[16]研究結果顯示，B7S1 Ig 可抑制 T 淋巴細胞增殖和 IL-2 分泌。Choi 等[20]研究結果顯示，B7S1 通過抗 CD3 激活而阻滯 T 細胞周期循環。另有多項研究表明，B7S1 陽性表達與多種惡性腫瘤的惡性進展密切相關，如乳腺癌[8, 31]、卵巢癌[32]、肺癌[33-34]、腎癌[35]等。與表達在腫瘤細胞中的 PD-L1 不同，B7S1 主要表達于抗原遞呈細胞，其潛在受體（B7S1R）與 PD-1 共表達于 CD4+和 CD8+ T 細胞表面[25]。PD-1 是抗腫瘤免疫阻滯劑，通過防止 T 淋巴細胞衰竭和重新激活腫瘤組織中 T 淋巴細胞起免疫殺傷作用。然而，臨床抗 PD-1 治療中，未顯示出完美的療效，即使在最初對 PD1-PDL1 治療有良好反應的患者中，部分患者仍存在高的復發率，這表明存在可繞過 PD1 信號傳導而抑制 T 細胞活化的信號通路[24,36]。B7S1 及其受體 B7S1R 通過降低腫瘤細胞中 CD8+ T 細胞顆粒酶 B 和穿孔素抑制 T 細胞增殖，可能是 PD1 治療過程中抵抗的潛在因素[27]。阻斷 CD8+ T 細胞 B7S1-B7S1R 信號通路，顯示出良好的抑腫瘤效應，聯合抗 PD1 和 B7S1 通路，顯示出強大的抗腫瘤效應[28]。據此，我們推測 B7S1 在介導腫瘤免疫逃逸過程中既存在單獨的信號通路，也可能存在與 PD1 協同作用通路促使 T 細胞衰竭。
B7S1 在胃癌中的復雜信號調節網絡仍有待進一步研究，調控 B7S1 表達有可能成為腫瘤治療的新策略。本研究結果顯示：B7S1 在胃癌組織中高表達，其表達與腫瘤直徑、T 分期、淋巴結轉移和病理分期相關；生存分析結果顯示：B7S1 為胃癌患者預后不良的風險因素。基于本研究和以上討論，我們推測 B7S1 促進胃癌的惡性進展。深入研究 B7S1 在腫瘤中的作用機制可為腫瘤免疫治療提供新的線索。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：滿忠松負責研究的具體實施與數據分析、論文撰寫；陳冰心負責實驗設計；趙鑫、孫明兵負責標本切片、免疫組化染色；欒立鵬、張喆負責收集患者資料、隨訪。
倫理聲明：本研究通過了蘇州大學附屬第一醫院倫理委員會審批。
