引用本文： 陳擁華, 李程, 梁艷, 周利, 楊楨, 劉續寶. 腫瘤相關成纖維細胞促進原代胰腺癌細胞生長及人源性異種移植瘤模型體內成瘤. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(3): 278-283. doi: 10.7507/1007-9424.201907116 復制
胰腺癌，尤其是胰腺導管癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC），作為最致命的惡性腫瘤形式之一，其占比約 90%，病情進展迅速，病死率極高，被醫學界譽為“癌癥之王”[1-2]。當 PDAC 一旦確診，大多數已無法手術切除，即便少數（不到 20%）適于手術治療，最終多數患者還是會死于轉移性癌，因此，以化療為核心的輔助治療成為 PDAC 治療的關鍵[3-5]。然而不同患者對化療藥物的反應不一，化療普遍耐藥，整體療效并不理想[6]。腫瘤個體化藥物治療的實現很大程度上依賴于高效藥物敏感性的檢測，但目前臨床尚缺乏有效的可靠檢測方法，尤其是 PDAC[7]。首先，原代 PDAC 細胞培養成功率比較低，構建個性化人源 PDAC 細胞庫困難；其次，現有人源性異種移植瘤（patient-derived xenograft，PDX）模型具有明顯的局限性[7-9]，如建模成瘤率及穩定傳代率較低，建模評價周期長（半年以上），在臨床應用受到極大限制[10-11]。上述問題突顯了 PDAC 個體化藥物敏感性篩查研究的復雜性及艱巨性，反映了對于 PDAC 治療耐藥機制以及藥物篩選系統認識不足的客觀現實，亟需更全面、多角度的研究進行揭示。腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）是 PDAC 腫瘤微環境中非常重要的間質成分，其對 PDAC 的發生、發展、轉移甚至耐藥具有至關重要的促進作用[12-16]。但目前相關研究[13, 17-18]主要運用已建成的 PDAC 細胞系，而 CAFs 對于原代 PDAC 細胞培養以及 PDX 模型構建是否有促進作用鮮見報道。本研究擬通過優化人原代 PDAC 細胞及 CAFs 分離培養方法，以驗證 CAFs 對原代 PDAC 細胞的體外生長以及其對高度免疫缺陷模型 NOG 小鼠體內成瘤的影響，以探索 PDAC PDX 模型構建新方法。
1 材料與方法
1.1 細胞培養主要試劑
高糖培養基（DMEM-H），美國 Sigma 公司；胎牛血清，以色列 BI 公司；0.25% 胰蛋白酶和抗生素均為 Gibco 公司。
1.2 組織標本來源
采集四川大學華西醫院胰腺外科 2015 年 1 月至 2017 年 6 月期間的 15 例手術切除后冰凍切片病理證實的 PDAC 標本，置于預冷無菌液（DMEM-H 含 1% 青霉素鏈霉素雙抗，0.1% 胎牛血清）中，冷藏冰盒運送至實驗室。所有標本采集均得到四川大學華西醫院倫理委員會的批準并簽署患者知情同意書。患者男 9 例，女 6 例；年齡 45～70 歲。
1.3 組織處理及組織塊原代培養
清洗（DMEM-H 含 1% 青霉素鏈霉素雙抗，0.1% 胎牛血清）組織塊 3 次，去除血塊及脂肪組織，再用手術刀片充分切碎至體積 0.5～1.0 mm3 見方的小組織塊，再次清洗去除脫落細胞。用鑷子將組織塊逐塊放入無菌培養皿，組織塊間距約 0.3 cm，吸凈液體后置于 37 ℃、5% CO2 培養箱 2 h，待其貼壁牢固后加入少量培養液靜置培養。1～2 d 后首次換液，以后每 2～3 d 換液，待組織塊周圍長滿細胞后去除組織塊繼續培養細胞。
1.4 細胞的傳代與純化
待混合生長的原代 PDAC 細胞及 CAFs 基本鋪滿時，胰蛋白酶液消化傳代。自第 2 次傳代起，根據 CAFs 與原代 PDAC 細胞生長速度及貼壁能力的差異，用酶差速消化法聯合差速貼壁法分離純化 CAFs 及 PDAC 細胞，主要步驟如下：① 混合生長的原代培養細胞去培養液后 PBS 洗滌，加入約 1～2 mL 胰蛋白酶液室溫消化 1～2 min 后，在顯微鏡下可見長梭形 CAFs 變為橢圓形并逐漸從培養皿底部脫落，而原代 PDAC 細胞對胰蛋白酶消化反應差（5～6 min），仍貼壁于培養皿（圖 1a、1b）。② 此時加入含有胎牛血清的 DMEM 液中止消化，吸取細胞懸液離心，培養基重懸細胞后轉移至另一無菌培養瓶中，于 37 ℃、5% CO2 培養箱靜置 15 min 待 CAFs 貼壁后，在顯微鏡下可見 CAFs 已開始貼壁牢固且細胞伸展鋪開，而混雜的原代 PDAC 細胞仍然呈圓形懸浮狀，此時棄去培養液，再次加入培養基洗滌 2 遍，去除混雜的 PDAC 細胞，貼壁的純化 CAFs 細胞加培養基繼續培養（圖 1c、1d）。③ 將前述第 ① 步培養皿中未充分消化的原代 PDAC 細胞用 PBS 洗滌 2 次，再次加入胰蛋白酶液 1～2 mL，徹底消化 PDAC 細胞 4～5 min 后，再用含有胎牛血清的 DMEM 培養液終止消化，離心、重懸細胞后轉移至另一無菌培養瓶中，于 37 ℃、5% CO2 培養箱靜置 30 min， 待 CAFs 貼壁，顯微鏡下可見 PDAC 細胞仍然呈圓形懸浮狀，而混雜的 CAFs 已開始貼壁牢固并細胞伸展鋪開，將未貼壁的 PDAC 細胞懸液轉移至新培養瓶繼續培養。將純化后的細胞（第 ② 步獲得的 CAFs，第 ③ 步獲得的 PDAC 細胞）繼續培養，此后每 3～5 d 同法進行純化、傳代 1 次。傳代 3 次左右即可得到純化的 CAFs 以及 PDAC 細胞。
圖1
示主要實驗結果
a：消化前混合培養的 CAFs（白箭）及原代 PDAC（黑箭）細胞（ ×20）；b：酶差速消化法聯合差速貼壁法混合培養的 CAFs（白箭）及原代 PDAC（黑箭）細胞（ ×20）；c：貼壁 10 min 時 CAFs（白箭）已貼壁（ ×20）；d：貼壁 15 min 后去除 PDAC（黑箭， ×20）；e：貼壁的 PDAC 組織塊（黑箭）周圍可見大量細胞長出（ ×10）；f：去除組織塊后混合成長的第 1 代 CAFs（白箭）及原代 PDAC（黑箭）細胞（ ×10）；g：α-SMA 熒光染色的 CAFs 細胞（ ×40）；h：CK-19 熒光染色的 CAFs 細胞（ ×40）；i：vimentin 熒光染色 CAFs 細胞（ ×40）；j：α-SMA 熒光染色的 PDAC 細胞（ ×40）；k：CK-19 熒光染色的 PDAC 細胞（ ×40）；l：vimentin 熒光染色的 PDAC 細胞（ ×40）；m：共培養的 PDAC 與 CAFs（白箭：CAFs；黑箭 PDAC 細胞； ×20）；n：單獨培養的 PDAC（黑箭， ×20）；o：NOG 小鼠移植瘤標本（白箭）；p：NOG 小鼠移植瘤組織病理學結果（黑箭：PDAC 浸潤；HE 染色 ×40）；q：患者 PDAC 組織病理學結果（黑箭：PDAC 浸潤；HE 染色 ×40）；r：PDAC 細胞與 CAFs 混合注射組和單一 PDAC 細胞注射組培養不同時相的腫瘤體積曲線（與單一 PDAC 細胞注射組相應時間點比較，*
1.5 原代 PDAC 細胞及 CAFs 細胞免疫熒光染色
將純化后的原代 PDAC 細胞及 CAFs 分別接種于 8 孔可移除插件培養載玻片（德國 Ibidi 公司），培養 24 h 后棄去培養液，PBS 洗滌后 4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 清洗后山羊血清封閉液（含 0.3% Triton X-100）室溫孵育 1 h，隨后按 1∶400 加入如下兔抗人一抗（均為美國 Abcam 公司）：波形蛋白（vimentin）或細胞角蛋白（CK-19）或 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），4 ℃ 過夜孵育。次日 PBS 清洗，再分別加入稀釋后的熒光標記的二抗 37 ℃ 避光孵育 1 h。PBS 洗滌后常規 DAPI（Sigma 公司）染核，玻片用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察蛋白表達情況。
1.6 體內成瘤實驗
將混合培養的原代 PDAC 細胞及 CAFs 采用酶差速消化法聯合差速貼壁法分離并計數細胞后分別培養，即原代 PDAC 細胞、CAFs 及混合培養細胞（原代 PDAC 細胞+CAFs）培養。當細胞達到 80%～90% 融合時，胰酶消化并細胞計數，混懸于 Matrigel 基質膠，然后分別將原代 PDAC 細胞、CAFs 及混合細胞（2∶1）按細胞數量為 1×106/只注射于 NOG 小鼠肩胛部皮下，觀察其成瘤情況，從第 2 周開始，每 2 周測量 1 次腫瘤體積，連續測量 8 周并繪制腫瘤生長曲線。
1.7 統計學方法
使用 IBM SPSS Statistics 25 軟件包對數據進行分析。計數資料使用 χ2 檢驗，計量資料使用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 原代細胞
PDAC 組織塊原代培養最快 5～7 d 即可見細胞從組織塊周邊長出，然后不斷地向四周擴散鋪開，此時成纖維樣細胞和上皮樣細胞混雜存在。上皮樣細胞成團分布，成纖維樣細胞圍繞上皮細胞成放射狀排列（圖 1e、1f）。15 例 PDAC 患者的標本，除 1 例患者的 PDAC 組織塊貼壁培養 10 d 仍無細胞長出外，其余 14 例患者的 PDAC 組織塊均成功培養出細胞，并且均成功細胞傳代。
2.2 免疫熒光鑒定分離的原代 PDAC 細胞及 CAFs
采用 vimentin、CK-19、α-SMA 免疫熒光可鑒定分辨所培養的原代 PDAC 細胞及 CAFs。CK-19 陰性而 vimentin 陽性，表明其為間質來源，證實為 CAFs，且 α-SMA 陽性為 CAFs 特異性蛋白，進一步驗證了其為 CAFs（圖 1g-1i）；CK-19 陽性而 vimentin 陰性，表明其為上皮來源，證實為原代 PDAC 細胞（圖 1j-1l）。
2.3 傳代培養的 PDAC 細胞形態學觀察結果
原代 PDAC 和 CAFs 共培養（圖 1m），在傳代過程中 PDAC 細胞呈鵝卵石樣貼壁生長，形態飽滿，折光度好，可分散生長。按原代 PDAC 細胞∶CAFs為 2∶1 的比例共培養，細胞生長活性最好，體外培養至第 10 代，生長活性仍無明顯減弱。與 CAFs 分離后，單獨培養的原代 PDAC 細胞（圖 1n）在傳代過程中形態學從之前的鵝卵石樣貼壁生長逐漸變得扁平，折光度下降，生長緩慢，并且貼壁能力明顯減弱，最終失去貼壁能力停止生長，多數在傳至 5 代以內停止生長，其中第 2 代停止生長者 2 例，第 3 代停止生長者 3 例，第 4 代停止生長者 5 例，第 5 代停止生長者 4 例。結果提示，CAFs 共培養對原代 PDAC 細胞適應新環境的生長可以起到促進作用，說明混合培養法（混合培養法是將原代 PDAC 細胞及 CAFs 按細胞比例共培養）有助于提高原代 PDAC 細胞培養成功率。
2.4 體內成瘤實驗結果
NOG 小鼠體內注射原代 PDAC 細胞可成功建立 PDX 模型（圖 1o），經過 HE 染色病理（圖 1p）證實，此法構建的 PDX 模型的腫瘤組織病理特征與 PDAC 患者的組織病理特征（圖 1q）相似；NOG 小鼠體內單獨注射 CAFs 無腫瘤形成；NOG 小鼠體內注射原代 PDAC 細胞及混合細胞（原代 PDAC 細胞+CAFs）建模 2～3 周即可形成腫瘤。原代 PDAC 細胞及 CAFs 培養成功的 14 例均用于 NOG 小鼠體內注射構建 PDX 模型，混合細胞注射法構建的 PDX 模型有 13 例（92.9%）成瘤，單一腫瘤細胞注射法構建的 PDX 模型有 9 例（64.3%）成瘤，可能因樣本量過少，二者間成瘤率比較差異無統計學（χ2=1.909，P=0.167）。經連續測量，腫瘤細胞注射后 2、4、6、8 周時混合細胞注射法建模者的腫瘤體積均明顯大于單一腫瘤細胞注射法建模者對應觀察時間點的腫瘤體積，二者比較差異均具有統計學意義（P<0.01），見圖 1r。
3 討論
在當前多學科診療模式下，以化療為核心的輔助治療對改善 PDAC 預后起到了至關重要的作用[3, 19-20]。然而 PDAC 患者普遍耐藥，整體療效極不理想，其原因見前言介紹。
原代腫瘤細胞比細胞系更加近似患者腫瘤，原代腫瘤細胞保留了原腫瘤的關鍵遺傳特性，還可模擬原始腫瘤的行為。大量研究[21-23]證實，腫瘤細胞原代培養的遺傳突變與對應腫瘤活組織標本中的突變高度匹配，繼承了來源腫瘤的基因組特征。2014 年底首次報道在實驗室利用來自于轉移性前列腺癌患者的活檢組織培育出三維腫瘤類器官，開啟了腫瘤個體化治療新紀元[24]。緊接著冷泉港實驗室也成功培育 PDAC 類器官模型[25]。基于以腫瘤類器官研究為代表的最新研究成果有望構建以廉價、快速和適宜高通量為特點的新興藥物篩選系統，為我們提供了更真實的環境來同時測試新的和現有的藥物以及探討聯合療法[26-28]，這是邁向個性化精準醫療的一個重要步驟，正如奧巴馬總統提議的新的精準醫學所述，在未來，反映患者個體獨特生物學的器官模型可用于藥物篩選。由此可見，建立 PDAC 活體生物銀行、完善并豐富現有的 PDAC 生物信息庫，是通向個體化療法抗擊腫瘤的新途徑，將為探尋腫瘤的信號通路及尋找新的藥物靶點的強大新型工具[29-30]。然而現有 PDAC 類器官培育技術尚不成熟，培育條件培養液所需蛋白因子數量眾多，技術要求高，成本高昂，難以推廣應用。
腫瘤與鄰近細胞（腫瘤微環境）的相互作用對它的生物學行為至關重要[31]。有研究[32]表明，腫瘤與間質細胞共培養體系較單一腫瘤細胞培養體系在腫瘤遺傳發育、侵襲、轉移等方面更能真實地反映腫瘤的生物學特性。CAFs 是 PDAC 組織中的主要間質細胞，在促進 PDAC 進展、轉移以及誘發耐藥方面起了關鍵作用[13-14]。因為傳統方法原代 PDAC 細胞培養成功率低，本研究在原有方法基礎上進一步優化采用 CAFs 與原代 PDAC 細胞混合培養法，以期望提高原代 PDAC 細胞培養成功率，研究結果證實，CAFs 對原代 PDAC 細胞適應培養環境的生長起到明顯的促進生長作用，且原代 PDAC 細胞與 CAFs 共培養法可顯著提高原代 PDAC 細胞穩定傳代成功率。
組織塊貼壁長出法、酶消化法是分離獲取原代細胞常用方法[33-34]。酶消化法使用的膠原酶等消化酶可對組織細胞（特別是 CAFs）造成損害，導致細胞活性下降；此外，酶消化法所得細胞混雜難以純化，適合對細胞純度要求不高的實驗研究或者模擬腫瘤微環境研究，比如三維培育腫瘤類器官通常采用酶消化法[28]。結合前期胰腺成纖維細胞培養經驗及細胞學特性，本研究采用組織塊貼壁長出法培養原代 PDAC 細胞及 CAFs，輔以含有生長因子的條件培養液，原代細胞培養成功率高。組織塊長出法可發揮組織細胞的旁分泌效應，促進細胞生長[35]。與此同時，組織塊長出法相對較經濟，僅需較少的組織塊便可進行細胞原代培養，適合于腔鏡或內鏡取材的小塊組織。
目前普遍認為 CAFs 具有促進 PDAC 細胞增值、抗凋亡等多種腫瘤協同作用。基于此，本研究將原代 PDAC 細胞與 CAFs 共培養，以提高原代 PDAC 細胞的培養成功率，結果表明，CAFs 共培養對原代 PDAC 細胞適應新環境的生長可以起到促進作用，共培養法有助于提高原代 PDAC 細胞培養成功率。將原代 PDAC 細胞與 CAFs 共培養有助于通過旁分泌效應及接觸作用發揮腫瘤-間質相互作用，促進細胞增殖生長，確切機制有待進一步研究證實。
基于 CAFs 共培養對原代 PDAC 細胞生長的促進作用，本研究進一步探索混合細胞（原代 PDAC 細胞+CAFs）注射法構建 PDX 模型的優勢，結果顯示，此法構建的 PDX 模型腫瘤病理特征與臨床樣本相似；混合細胞（原代 PDAC 細胞+CAFs）法較腫瘤細胞單一法成瘤更早及建模成功率更高，與新近 Ehrenberg 等[11]報道的成功率接近，PDAC 為 86.3%（19/22）。對于混合注射法中 CAFs 在 NOG 小鼠體內去向以及其通過何種機制促進原代 PDAC 細胞體內增殖并進而致瘤仍需深入研究，我們推測混懸于 Matrigel 基質膠中的混合細胞（原代 PDAC 細胞+CAFs）可能更有助于形成利于腫瘤細胞增殖生長的微環境。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：陳擁華、劉續寶負責實驗設計；陳擁華實施原代細胞培養體外試驗及移植瘤模型構建；李程負責實驗動物及移植瘤測量；陳擁華、梁艷、周利、楊楨同時負責 HE 病理切片、免疫熒光染色及圖像處理。
倫理聲明：本研究通過了四川大學華西醫院臨床試驗與生物醫學倫理專委會審批（批文編號：2014 年 審（37）號）。
致謝：感謝四川大學華西醫院胰腺外科對本研究的大力支持！四川大學華西醫院公共實驗技術中心張杰高級實驗師提供的技術指導和幫助。
胰腺癌，尤其是胰腺導管癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC），作為最致命的惡性腫瘤形式之一，其占比約 90%，病情進展迅速，病死率極高，被醫學界譽為“癌癥之王”[1-2]。當 PDAC 一旦確診，大多數已無法手術切除，即便少數（不到 20%）適于手術治療，最終多數患者還是會死于轉移性癌，因此，以化療為核心的輔助治療成為 PDAC 治療的關鍵[3-5]。然而不同患者對化療藥物的反應不一，化療普遍耐藥，整體療效并不理想[6]。腫瘤個體化藥物治療的實現很大程度上依賴于高效藥物敏感性的檢測，但目前臨床尚缺乏有效的可靠檢測方法，尤其是 PDAC[7]。首先，原代 PDAC 細胞培養成功率比較低，構建個性化人源 PDAC 細胞庫困難；其次，現有人源性異種移植瘤（patient-derived xenograft，PDX）模型具有明顯的局限性[7-9]，如建模成瘤率及穩定傳代率較低，建模評價周期長（半年以上），在臨床應用受到極大限制[10-11]。上述問題突顯了 PDAC 個體化藥物敏感性篩查研究的復雜性及艱巨性，反映了對于 PDAC 治療耐藥機制以及藥物篩選系統認識不足的客觀現實，亟需更全面、多角度的研究進行揭示。腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）是 PDAC 腫瘤微環境中非常重要的間質成分，其對 PDAC 的發生、發展、轉移甚至耐藥具有至關重要的促進作用[12-16]。但目前相關研究[13, 17-18]主要運用已建成的 PDAC 細胞系，而 CAFs 對于原代 PDAC 細胞培養以及 PDX 模型構建是否有促進作用鮮見報道。本研究擬通過優化人原代 PDAC 細胞及 CAFs 分離培養方法，以驗證 CAFs 對原代 PDAC 細胞的體外生長以及其對高度免疫缺陷模型 NOG 小鼠體內成瘤的影響，以探索 PDAC PDX 模型構建新方法。
1 材料與方法
1.1 細胞培養主要試劑
高糖培養基（DMEM-H），美國 Sigma 公司；胎牛血清，以色列 BI 公司；0.25% 胰蛋白酶和抗生素均為 Gibco 公司。
1.2 組織標本來源
采集四川大學華西醫院胰腺外科 2015 年 1 月至 2017 年 6 月期間的 15 例手術切除后冰凍切片病理證實的 PDAC 標本，置于預冷無菌液（DMEM-H 含 1% 青霉素鏈霉素雙抗，0.1% 胎牛血清）中，冷藏冰盒運送至實驗室。所有標本采集均得到四川大學華西醫院倫理委員會的批準并簽署患者知情同意書。患者男 9 例，女 6 例；年齡 45～70 歲。
1.3 組織處理及組織塊原代培養
清洗（DMEM-H 含 1% 青霉素鏈霉素雙抗，0.1% 胎牛血清）組織塊 3 次，去除血塊及脂肪組織，再用手術刀片充分切碎至體積 0.5～1.0 mm3 見方的小組織塊，再次清洗去除脫落細胞。用鑷子將組織塊逐塊放入無菌培養皿，組織塊間距約 0.3 cm，吸凈液體后置于 37 ℃、5% CO2 培養箱 2 h，待其貼壁牢固后加入少量培養液靜置培養。1～2 d 后首次換液，以后每 2～3 d 換液，待組織塊周圍長滿細胞后去除組織塊繼續培養細胞。
1.4 細胞的傳代與純化
待混合生長的原代 PDAC 細胞及 CAFs 基本鋪滿時，胰蛋白酶液消化傳代。自第 2 次傳代起，根據 CAFs 與原代 PDAC 細胞生長速度及貼壁能力的差異，用酶差速消化法聯合差速貼壁法分離純化 CAFs 及 PDAC 細胞，主要步驟如下：① 混合生長的原代培養細胞去培養液后 PBS 洗滌，加入約 1～2 mL 胰蛋白酶液室溫消化 1～2 min 后，在顯微鏡下可見長梭形 CAFs 變為橢圓形并逐漸從培養皿底部脫落，而原代 PDAC 細胞對胰蛋白酶消化反應差（5～6 min），仍貼壁于培養皿（圖 1a、1b）。② 此時加入含有胎牛血清的 DMEM 液中止消化，吸取細胞懸液離心，培養基重懸細胞后轉移至另一無菌培養瓶中，于 37 ℃、5% CO2 培養箱靜置 15 min 待 CAFs 貼壁后，在顯微鏡下可見 CAFs 已開始貼壁牢固且細胞伸展鋪開，而混雜的原代 PDAC 細胞仍然呈圓形懸浮狀，此時棄去培養液，再次加入培養基洗滌 2 遍，去除混雜的 PDAC 細胞，貼壁的純化 CAFs 細胞加培養基繼續培養（圖 1c、1d）。③ 將前述第 ① 步培養皿中未充分消化的原代 PDAC 細胞用 PBS 洗滌 2 次，再次加入胰蛋白酶液 1～2 mL，徹底消化 PDAC 細胞 4～5 min 后，再用含有胎牛血清的 DMEM 培養液終止消化，離心、重懸細胞后轉移至另一無菌培養瓶中，于 37 ℃、5% CO2 培養箱靜置 30 min， 待 CAFs 貼壁，顯微鏡下可見 PDAC 細胞仍然呈圓形懸浮狀，而混雜的 CAFs 已開始貼壁牢固并細胞伸展鋪開，將未貼壁的 PDAC 細胞懸液轉移至新培養瓶繼續培養。將純化后的細胞（第 ② 步獲得的 CAFs，第 ③ 步獲得的 PDAC 細胞）繼續培養，此后每 3～5 d 同法進行純化、傳代 1 次。傳代 3 次左右即可得到純化的 CAFs 以及 PDAC 細胞。
圖1
示主要實驗結果
a：消化前混合培養的 CAFs（白箭）及原代 PDAC（黑箭）細胞（ ×20）；b：酶差速消化法聯合差速貼壁法混合培養的 CAFs（白箭）及原代 PDAC（黑箭）細胞（ ×20）；c：貼壁 10 min 時 CAFs（白箭）已貼壁（ ×20）；d：貼壁 15 min 后去除 PDAC（黑箭， ×20）；e：貼壁的 PDAC 組織塊（黑箭）周圍可見大量細胞長出（ ×10）；f：去除組織塊后混合成長的第 1 代 CAFs（白箭）及原代 PDAC（黑箭）細胞（ ×10）；g：α-SMA 熒光染色的 CAFs 細胞（ ×40）；h：CK-19 熒光染色的 CAFs 細胞（ ×40）；i：vimentin 熒光染色 CAFs 細胞（ ×40）；j：α-SMA 熒光染色的 PDAC 細胞（ ×40）；k：CK-19 熒光染色的 PDAC 細胞（ ×40）；l：vimentin 熒光染色的 PDAC 細胞（ ×40）；m：共培養的 PDAC 與 CAFs（白箭：CAFs；黑箭 PDAC 細胞； ×20）；n：單獨培養的 PDAC（黑箭， ×20）；o：NOG 小鼠移植瘤標本（白箭）；p：NOG 小鼠移植瘤組織病理學結果（黑箭：PDAC 浸潤；HE 染色 ×40）；q：患者 PDAC 組織病理學結果（黑箭：PDAC 浸潤；HE 染色 ×40）；r：PDAC 細胞與 CAFs 混合注射組和單一 PDAC 細胞注射組培養不同時相的腫瘤體積曲線（與單一 PDAC 細胞注射組相應時間點比較，*
1.5 原代 PDAC 細胞及 CAFs 細胞免疫熒光染色
將純化后的原代 PDAC 細胞及 CAFs 分別接種于 8 孔可移除插件培養載玻片（德國 Ibidi 公司），培養 24 h 后棄去培養液，PBS 洗滌后 4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 清洗后山羊血清封閉液（含 0.3% Triton X-100）室溫孵育 1 h，隨后按 1∶400 加入如下兔抗人一抗（均為美國 Abcam 公司）：波形蛋白（vimentin）或細胞角蛋白（CK-19）或 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），4 ℃ 過夜孵育。次日 PBS 清洗，再分別加入稀釋后的熒光標記的二抗 37 ℃ 避光孵育 1 h。PBS 洗滌后常規 DAPI（Sigma 公司）染核，玻片用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察蛋白表達情況。
1.6 體內成瘤實驗
將混合培養的原代 PDAC 細胞及 CAFs 采用酶差速消化法聯合差速貼壁法分離并計數細胞后分別培養，即原代 PDAC 細胞、CAFs 及混合培養細胞（原代 PDAC 細胞+CAFs）培養。當細胞達到 80%～90% 融合時，胰酶消化并細胞計數，混懸于 Matrigel 基質膠，然后分別將原代 PDAC 細胞、CAFs 及混合細胞（2∶1）按細胞數量為 1×106/只注射于 NOG 小鼠肩胛部皮下，觀察其成瘤情況，從第 2 周開始，每 2 周測量 1 次腫瘤體積，連續測量 8 周并繪制腫瘤生長曲線。
1.7 統計學方法
使用 IBM SPSS Statistics 25 軟件包對數據進行分析。計數資料使用 χ2 檢驗，計量資料使用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 原代細胞
PDAC 組織塊原代培養最快 5～7 d 即可見細胞從組織塊周邊長出，然后不斷地向四周擴散鋪開，此時成纖維樣細胞和上皮樣細胞混雜存在。上皮樣細胞成團分布，成纖維樣細胞圍繞上皮細胞成放射狀排列（圖 1e、1f）。15 例 PDAC 患者的標本，除 1 例患者的 PDAC 組織塊貼壁培養 10 d 仍無細胞長出外，其余 14 例患者的 PDAC 組織塊均成功培養出細胞，并且均成功細胞傳代。
2.2 免疫熒光鑒定分離的原代 PDAC 細胞及 CAFs
采用 vimentin、CK-19、α-SMA 免疫熒光可鑒定分辨所培養的原代 PDAC 細胞及 CAFs。CK-19 陰性而 vimentin 陽性，表明其為間質來源，證實為 CAFs，且 α-SMA 陽性為 CAFs 特異性蛋白，進一步驗證了其為 CAFs（圖 1g-1i）；CK-19 陽性而 vimentin 陰性，表明其為上皮來源，證實為原代 PDAC 細胞（圖 1j-1l）。
2.3 傳代培養的 PDAC 細胞形態學觀察結果
原代 PDAC 和 CAFs 共培養（圖 1m），在傳代過程中 PDAC 細胞呈鵝卵石樣貼壁生長，形態飽滿，折光度好，可分散生長。按原代 PDAC 細胞∶CAFs為 2∶1 的比例共培養，細胞生長活性最好，體外培養至第 10 代，生長活性仍無明顯減弱。與 CAFs 分離后，單獨培養的原代 PDAC 細胞（圖 1n）在傳代過程中形態學從之前的鵝卵石樣貼壁生長逐漸變得扁平，折光度下降，生長緩慢，并且貼壁能力明顯減弱，最終失去貼壁能力停止生長，多數在傳至 5 代以內停止生長，其中第 2 代停止生長者 2 例，第 3 代停止生長者 3 例，第 4 代停止生長者 5 例，第 5 代停止生長者 4 例。結果提示，CAFs 共培養對原代 PDAC 細胞適應新環境的生長可以起到促進作用，說明混合培養法（混合培養法是將原代 PDAC 細胞及 CAFs 按細胞比例共培養）有助于提高原代 PDAC 細胞培養成功率。
2.4 體內成瘤實驗結果
NOG 小鼠體內注射原代 PDAC 細胞可成功建立 PDX 模型（圖 1o），經過 HE 染色病理（圖 1p）證實，此法構建的 PDX 模型的腫瘤組織病理特征與 PDAC 患者的組織病理特征（圖 1q）相似；NOG 小鼠體內單獨注射 CAFs 無腫瘤形成；NOG 小鼠體內注射原代 PDAC 細胞及混合細胞（原代 PDAC 細胞+CAFs）建模 2～3 周即可形成腫瘤。原代 PDAC 細胞及 CAFs 培養成功的 14 例均用于 NOG 小鼠體內注射構建 PDX 模型，混合細胞注射法構建的 PDX 模型有 13 例（92.9%）成瘤，單一腫瘤細胞注射法構建的 PDX 模型有 9 例（64.3%）成瘤，可能因樣本量過少，二者間成瘤率比較差異無統計學（χ2=1.909，P=0.167）。經連續測量，腫瘤細胞注射后 2、4、6、8 周時混合細胞注射法建模者的腫瘤體積均明顯大于單一腫瘤細胞注射法建模者對應觀察時間點的腫瘤體積，二者比較差異均具有統計學意義（P<0.01），見圖 1r。
3 討論
在當前多學科診療模式下，以化療為核心的輔助治療對改善 PDAC 預后起到了至關重要的作用[3, 19-20]。然而 PDAC 患者普遍耐藥，整體療效極不理想，其原因見前言介紹。
原代腫瘤細胞比細胞系更加近似患者腫瘤，原代腫瘤細胞保留了原腫瘤的關鍵遺傳特性，還可模擬原始腫瘤的行為。大量研究[21-23]證實，腫瘤細胞原代培養的遺傳突變與對應腫瘤活組織標本中的突變高度匹配，繼承了來源腫瘤的基因組特征。2014 年底首次報道在實驗室利用來自于轉移性前列腺癌患者的活檢組織培育出三維腫瘤類器官，開啟了腫瘤個體化治療新紀元[24]。緊接著冷泉港實驗室也成功培育 PDAC 類器官模型[25]。基于以腫瘤類器官研究為代表的最新研究成果有望構建以廉價、快速和適宜高通量為特點的新興藥物篩選系統，為我們提供了更真實的環境來同時測試新的和現有的藥物以及探討聯合療法[26-28]，這是邁向個性化精準醫療的一個重要步驟，正如奧巴馬總統提議的新的精準醫學所述，在未來，反映患者個體獨特生物學的器官模型可用于藥物篩選。由此可見，建立 PDAC 活體生物銀行、完善并豐富現有的 PDAC 生物信息庫，是通向個體化療法抗擊腫瘤的新途徑，將為探尋腫瘤的信號通路及尋找新的藥物靶點的強大新型工具[29-30]。然而現有 PDAC 類器官培育技術尚不成熟，培育條件培養液所需蛋白因子數量眾多，技術要求高，成本高昂，難以推廣應用。
腫瘤與鄰近細胞（腫瘤微環境）的相互作用對它的生物學行為至關重要[31]。有研究[32]表明，腫瘤與間質細胞共培養體系較單一腫瘤細胞培養體系在腫瘤遺傳發育、侵襲、轉移等方面更能真實地反映腫瘤的生物學特性。CAFs 是 PDAC 組織中的主要間質細胞，在促進 PDAC 進展、轉移以及誘發耐藥方面起了關鍵作用[13-14]。因為傳統方法原代 PDAC 細胞培養成功率低，本研究在原有方法基礎上進一步優化采用 CAFs 與原代 PDAC 細胞混合培養法，以期望提高原代 PDAC 細胞培養成功率，研究結果證實，CAFs 對原代 PDAC 細胞適應培養環境的生長起到明顯的促進生長作用，且原代 PDAC 細胞與 CAFs 共培養法可顯著提高原代 PDAC 細胞穩定傳代成功率。
組織塊貼壁長出法、酶消化法是分離獲取原代細胞常用方法[33-34]。酶消化法使用的膠原酶等消化酶可對組織細胞（特別是 CAFs）造成損害，導致細胞活性下降；此外，酶消化法所得細胞混雜難以純化，適合對細胞純度要求不高的實驗研究或者模擬腫瘤微環境研究，比如三維培育腫瘤類器官通常采用酶消化法[28]。結合前期胰腺成纖維細胞培養經驗及細胞學特性，本研究采用組織塊貼壁長出法培養原代 PDAC 細胞及 CAFs，輔以含有生長因子的條件培養液，原代細胞培養成功率高。組織塊長出法可發揮組織細胞的旁分泌效應，促進細胞生長[35]。與此同時，組織塊長出法相對較經濟，僅需較少的組織塊便可進行細胞原代培養，適合于腔鏡或內鏡取材的小塊組織。
目前普遍認為 CAFs 具有促進 PDAC 細胞增值、抗凋亡等多種腫瘤協同作用。基于此，本研究將原代 PDAC 細胞與 CAFs 共培養，以提高原代 PDAC 細胞的培養成功率，結果表明，CAFs 共培養對原代 PDAC 細胞適應新環境的生長可以起到促進作用，共培養法有助于提高原代 PDAC 細胞培養成功率。將原代 PDAC 細胞與 CAFs 共培養有助于通過旁分泌效應及接觸作用發揮腫瘤-間質相互作用，促進細胞增殖生長，確切機制有待進一步研究證實。
基于 CAFs 共培養對原代 PDAC 細胞生長的促進作用，本研究進一步探索混合細胞（原代 PDAC 細胞+CAFs）注射法構建 PDX 模型的優勢，結果顯示，此法構建的 PDX 模型腫瘤病理特征與臨床樣本相似；混合細胞（原代 PDAC 細胞+CAFs）法較腫瘤細胞單一法成瘤更早及建模成功率更高，與新近 Ehrenberg 等[11]報道的成功率接近，PDAC 為 86.3%（19/22）。對于混合注射法中 CAFs 在 NOG 小鼠體內去向以及其通過何種機制促進原代 PDAC 細胞體內增殖并進而致瘤仍需深入研究，我們推測混懸于 Matrigel 基質膠中的混合細胞（原代 PDAC 細胞+CAFs）可能更有助于形成利于腫瘤細胞增殖生長的微環境。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：陳擁華、劉續寶負責實驗設計；陳擁華實施原代細胞培養體外試驗及移植瘤模型構建；李程負責實驗動物及移植瘤測量；陳擁華、梁艷、周利、楊楨同時負責 HE 病理切片、免疫熒光染色及圖像處理。
倫理聲明：本研究通過了四川大學華西醫院臨床試驗與生物醫學倫理專委會審批（批文編號：2014 年 審（37）號）。
致謝：感謝四川大學華西醫院胰腺外科對本研究的大力支持！四川大學華西醫院公共實驗技術中心張杰高級實驗師提供的技術指導和幫助。
