引用本文： 唐果, 高鑫, 魏壽江. LIMK 與結直腸癌關系的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(2): 252-256. doi: 10.7507/1007-9424.201905051 復制
2018 年美國癌癥學會發布的全球癌癥統計數據顯示，結直腸癌發病率為 11%，排第 3 位，病死率為 9%，排第 2 位[1]。2015 年中國癌癥統計數據顯示，我國結直腸癌發病率、病死率在全部惡性腫瘤中均居第 5 位，其中新發病例 37.6 萬例，死亡病例 19.1 萬例，其中結腸癌的發病率上升顯著，且多數患者發現時已屬中晚期[2]。目前對于結腸癌的有效治療手段為手術及放化療，但侵襲和轉移是導致治療失敗甚至患者死亡的最重要原因。有大量研究[3-5]表明，LIM 激酶（LIMK）及其各通路上下游因子參與了細胞周期進展、腫瘤新生血管生成及腫瘤細胞侵襲、遷移、增殖等多種細胞生物學行為，其一直以來都被作為腫瘤治療的靶點被廣泛研究。近來研究發現，LIMK 在結直腸癌組織中明顯高表達，其在結直腸癌的侵襲、轉移及復發過程中起著重要作用。筆者現對 LIMK 家族成員的結構功能及其抑制劑在結直腸癌治療中的最新研究進展進行綜述。
1 LIMK 的結構及生理學意義
1.1 LIMK 家族成員
LIMK 家族中有 LIMK1 和 LIMK2 兩大成員，它們是調節肌動蛋白聚合和微管分解的蛋白激酶，兩者分別由不同的基因編碼。LIMK1 和 LIMK2 顯示獨特的結構排列，在 N 末端具有兩個 LIM 結構域，盤狀同源區域（PDZ 結構域）連接至富含脯氨酸/絲氨酸（Ser）的區域和 C 末端激酶結構域[6]。
1.1.1 LIMK1
LIMK1 的基因定位于 7q11.23，其由 39 499 個堿基對及 16 個外顯子組成，可在細胞質與細胞核中表達，但由于 PDZ 結構域里兩個功能性的富含亮氨酸的核轉錄信號使 LIMK1 更優先定位于細胞質。LIMK1 是一種致癌激酶，負責所有實體瘤的轉移及阿爾茨海默病的過程[7]；LIMK1 的失調會導致紡錘體缺陷和染色體異常[8]。
1.1.2 LIMK2
LIMK2 的基因定位于 22q12.2。數據庫描述人類 LIMK2 有 3 種同種型：LIMK2a、LIMK2b 和 LIMK2-1，三者的功能可能不完全重疊，其機制尚不清楚。LIMK2a 存在于細胞質和細胞核中，而 LIMK2b 與 LIMK2-1 主要定位于細胞質[9]。之前對 LIMK2 的研究主要集中在細胞骨架重組的作用上，且主要廣泛應用于神經系統。LIMK2 屬于 Rho/ROCK/LIMK2/cofilin 信號通路，其主要功能是通過肌動蛋白解聚因子（ADF）、磷酸化絲切蛋白來調節肌動蛋白絲與細胞質各種膜結構的重新組裝。LIMK2 在各種惡性腫瘤中都表現出各自不同的功能，如在神經母細胞瘤中 LIMK2 誘導耐藥性增加，在結腸癌中 LIMK2 可以限制干細胞的增殖，LIMK2 的磷酸化是乳腺癌進展和轉移的關鍵[10]。
1.2 LIMK 及其上下游分子
LIM 結構域使 LIMK 能夠直接與許多大分子配偶體相互作用，包括幾種 RhoGTP 酶如 Rac1、Cdc42、RhoA 以及它們的下游效應子 p21 活化蛋白激酶（PAK）1—4 和 ROCK1—2。已證明 ROCK1、ROCK2 及 PAK 可以磷酸化并激活 LIMK，而 LIMK 能夠特異性地使下游分子 cofilin 的 Ser3 位點磷酸化，將 cofilin 磷酸化使其失活，從而在多種腫瘤的細胞遷移、侵襲、轉移和神經發育障礙（如威廉綜合征）過程中發揮作用[11]。隨著對 LIMK 通路研究的逐漸深入，LIMK 與上游的 PAK 和 ROCK 以及其下游分子 cofilin 的相互機制逐漸清晰，下面對它們作一介紹。
1.2.1 LIMK 與 PAK
PAK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白，可促進細胞存活，抑制細胞黏附，促進不依賴貼壁的生長，是 GTP 酶 Rho/Rac 家族的下游信號傳導效應物，是 LIMK1 最重要的上游分子之一。PAK 在多種惡性腫瘤細胞的發展過程中發揮重要作用，包括癌細胞侵襲和遷移、細胞骨架信號傳導途徑、細胞周期進程、細胞存活和細胞凋亡。PAK 有 PAK1—6 這 6 種不同類型，根據其域結構的不同被分為 PAK1—3 和 PAK4—6 兩組。第一組 PAK1—3 家族已被集中研究。第二組 PAK4—6 中的 PAK4 作為第一個被鑒定和研究的成員，發現其在多種惡性腫瘤中高頻率過表達，包括胃癌、結腸癌、乳腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌和卵巢癌[12-13]；還發現其與腫瘤發生的許多標志有關，包括錨定非依賴性生長、血管生成、細胞存活增加、遷移和侵襲[14-15]。因此，PAK4 作為惡性腫瘤治療過程中極具潛力的研究靶點，許多課題組研究 PAK4 抑制劑來降低 LIMK1 的表達以期直接或間接達到治療的目的。Li 等[16]通過配對重組蛋白質分析鑒定出 LIMK1 作為體外 PAK4 的底物，PAK4 在體外和體內是致瘤的，發現其在許多癌細胞系和腫瘤中過表達或基因擴增，且經驗證 PAK4 通過 PAK4/ LIMK1/cofilin 信號通路參與細胞骨架動力學調節癌細胞遷移和侵襲[17]。
1.2.2 LIMK 與 ROCK
LIMK2 屬于 Rho/ROCK/LIMK2/cofilin 途徑，ROCK、Rho 的下游蛋白激酶。ROCK 特異性激活 LIMK2，但不激活 RhoA 下游的 LIMK1。通過與 ROCK（ROCK-Delta3）的活性形式共表達刺激 LIMK1 和 LIMK2 對 cofilin 磷酸化的活性，而 ROCK1 可以選擇性激活 LIMK2 但不激活 LIMK1。RhoA 對 LIMK2 的激活受到 ROCK 的特異性抑制劑 Y-27632 的抑制。ROCK 直接磷酸化蘇氨酸 505 并激活 RhoA 下游的 LIMK2，從而使 cofilin 失活以誘導肌動蛋白細胞骨架重組[18]。
1.2.3 LIMK 與 cofilin
cofilin 是 LIMK 下游信號分子之一，屬于 ADF/cofilin 家族，是一種存在于真核生物中的肌動蛋白，它的相對分子質量很低，只有 21 000。在哺乳動物基因中有 2 種亞型，分別編碼為 cofilin-1 和 cofilin-2，cofilin 主要依靠調節肌動蛋白的解聚和聚合來發揮生理功能。LIMK1 和 LIMK2 均能夠特異性地使 Ser3 位點磷酸化，將 cofilin 磷酸化使其失活，LIMK1 在整個腫瘤進展過程中過表達，通過 β-連環蛋白核易位與 LIMK2 產生競爭性抑制[19]。而使 cofilin 脫磷酸化的主要激活物是彈弓磷酸激酶（slingshot，SSH），它可使失活的磷酸化 cofilin 脫磷酸化而復活，以此來恢復 cofilin 的活性從而發揮其功能[20]。cofilin 通路對于體外和體內細胞運動和形態發生起至關重要的作用，肌動蛋白的核轉運、肌動蛋白骨架的重組、胞質分裂等都與磷酸化的 cofilin 蛋白相聯系，它們經 Rho/ROCK/LIMK/cofilin 通路在腫瘤細胞侵襲和轉移方面起著重要的作用[21]。cofilin 在人類惡性腫瘤中呈過表達，同時其參與調節影響結腸癌細胞中上皮間充質轉化（EMT）期間細胞-細胞黏附組織的肌動蛋白細胞骨架動力學[22]。
2 LIMK 與結直腸癌
據文獻[23]報道，大約 50% 的結直腸癌患者在疾病過程中會發生轉移，5 年生存率通常只有 55% 左右。對于結直腸癌患者，腫瘤侵襲、轉移是其死亡的主要原因，而結直腸癌侵襲、轉移又是一個多步驟、多階段、多基因參與的過程[24]。近年來的研究已涉及腫瘤侵襲、轉移的分子框架，但治療結直腸癌轉移的有效靶點卻很局限。因此，揭示結直腸癌侵襲、轉移的分子機制仍很重要。
南方醫科大學的研究團隊[25]通過免疫組織化學方法及蛋白質印跡法檢測發現，在 152 例石蠟包埋保存結腸癌組織中的 LIMK1 較癌旁正常黏膜組織呈過表達，采用免疫印跡和免疫沉淀方法確定了兩種腫瘤轉移相關蛋白 MYH9 和 ACTN4 為 LIMK1 的直接靶標，三者相互作用促進結腸癌進展。
Su 等[26]通過對 87 例手術切除的結腸癌標本和 34 例與結腸癌相鄰的正常組織陣列的免疫組織化學染色分析發現，結腸癌組織中 LIMK1 和 destrin（ADF 成員之一）呈高表達，二者高表達與結腸癌的發生和發展有關；進一步通過二烯丙基二硫（DADS，一種從大蒜素中提取的脂溶性有機硫化合物）對人結腸癌細胞系 SW480 處理后研究證明了 DADS 可以下調 LIMK1 的表達，抑制 LIMK1/cofilin 信號通路，阻礙血管生成和 EMT，抑制結腸癌的遷移和侵襲，從而驗證了 DADS 具有抗癌作用，可用于抑制腫瘤細胞遷移和侵襲。
Zhang 等[19]通過免疫組織化學和 RT-PCR 檢測 LIMK2 在結腸癌組織中下調，且發現 LIMK2 隨著腫瘤從癌前病變進展到晚期惡性腫瘤而逐漸下調，這一點與 LIMK1 持續處于過表達狀態是不同的，LIMK2 通過 G1?S 期轉換的細胞周期停滯、抑制細胞增殖，通過限制 EMT 過程抑制細胞轉移的能力，降低的 LIMK2 表達增強了 β-連環蛋白的核積累并激活了 Wnt 信號傳導途徑可導致結腸癌進展和轉移，LIMK1 和 LIMK2 的這種不均衡表達在結腸癌進展中扮演新的重要角色。但是 Aggelou 等[20]的研究結果與 Zhang 等[19]研究結果不太一致，該研究中發現，LIMK1 和 LIMK2 在人類結腸癌中都是高度表達，并且與侵襲深度、淋巴結轉移和分期呈正相關；該研究中還采用免疫組織化學方法評估了 143 例人類結腸癌樣本中 LIMK1、LIMK2 和 cofilin 明顯過表達，比癌旁的正常組織分別高了 93.7%、89.5% 和 86.7%，從而證明了 LIMK1、LIMK2 和 cofilin 三種蛋白的含量與腫瘤分級呈正相關。
Min 等[27]在結腸癌 HCT116 細胞中驗證蛋白去乙酰化酶 SIRT2 可通過熱休克蛋白 90 脫乙酰化和抑制 LIMK1/cofilin 途徑調節肌動蛋白動力學和細胞遷移而起到抑制腫瘤侵襲和進展的作用。
有研究[23]報道，在結腸癌 HT-29 細胞中 cofilin-1 可通過激活 RhoA/LIMK2/cofilin-1 信號調節肌動蛋白細胞骨架重組和細胞-細胞黏附調節從而介導 EMT，cofilin-1 和非磷酸化 cofilin-1 的亞細胞分布不均勻導致肌動蛋白聚合率增加，進而在轉化生長因子-β 誘導的 EMT 期間增強結腸癌細胞 HT-29 的遷移及侵襲。
以上研究結果提示，LIMK 及 cofilin 的表達與結直腸癌的分化程度呈正相關，并且能促進腫瘤細胞的遷移、侵襲。但是否存在其他的 LIMK 家族成員以及 LIMK1 與 LIMK2 調控的具體機制目前尚不明確，需要我們繼續探索。針對 LIMK 家族能夠促進腫瘤細胞遷移、侵襲的特點，抑制 ROCK/LIMK/cofilin 及 PAK/LIMK/cofilin 通路已成為治療惡性腫瘤的一個新出路。
3 LIMK 抑制劑與結直腸癌治療
由于 ROCK/LIMK/cofilin 及 PAK/LIMK/cofilin 信號通路的異常激活會引發惡性腫瘤的發展、侵襲和轉移，因此，可以通過干預 ROCKs、LIMKs 和 cofilin 表達或活性來調節肌動蛋白以延緩癌細胞增殖、遷移和侵襲[28]。LIMK 通過 cofilin 調節肌動蛋白及微管的動態來整合上游信號，使其與結直腸癌的遷移及侵襲密切相關[29-30]。因此，尋找能夠抑制或調節 LIMK 活性的藥物將為結直腸癌的治療提供一種新的方案。
3.1 LIMK1 抑制劑
有研究[31]發現，一種全新的 1-菲基-四氫異喹啉衍生物可以誘導人乳腺癌 MCF-7 細胞的 G1/S 期細胞周期，并通過調節 PAK4/LIMK1/cofilin 信號通路抑制 MCF-7 細胞的遷移和侵襲。Hao 等[32]通過蛋白質印跡分析等方法研究了 1-菲基-四氫異喹啉衍生物對 PAK4/LIMK1/cofilin 信號傳導途徑的影響，在用不同濃度的衍生物處理 24 h 的肺腺癌 A549 細胞中觀察到其對 LIMK1 和 cofilin 磷酸化的抑制；在肺腺癌 A549 細胞異種移植人肺癌細胞小鼠模型腫瘤形成實驗中顯示其腫瘤生長抑制率>55%（P<0.05），也證明該衍生物對腫瘤細胞顯著的抑制和抗增殖作用。
DADS 作為一種從大蒜素中提取的脂溶性有機硫化合物，可通過抑制 LIMK 作為主要靶標并影響 ROCK1/PAK1/LIMK1/cofilin 信號通路來減少結直腸癌 SW480 細胞的遷移和侵襲[29]；其還被證明可以下調胃及結腸腫瘤細胞中的 LIMK1 來抑制 EMT，從而抑制腫瘤細胞的侵襲、增殖和遷移[26]。
虎刺醛，是一種新研究的蒽醌衍生物。據文獻[33]報道，虎刺醛能通過抑制 LIMK1 的表達而達到抑制乳腺癌細胞的侵襲與遷移的作用。
Nguyen 等[34]在研究 PAK1 抑制劑時發現，含羞草堿四肽（MFFY、MFWY 和 MFYY）和高良姜提取物（hispidin）衍生物（H1-3）對 LIMK1 也具有強的抑制活性。
葫蘆素Ⅰ是一種從植物中分離的細胞毒性三萜類固醇，它們可以抑制 LIMK 對磷酸 cofilin 的激活，從而使得宮頸癌 HeLa 細胞和人結直腸腺癌細胞 Caco-2 增殖和遷移延遲[35]。葫蘆素還可以誘導肌動蛋白與磷酸肌球蛋白Ⅱ的共聚集，這種共聚集很可能是由 Rho/ROCK 途徑的刺激和在體外通過與 LIMK 的直接相互作用抑制所引起的。葫蘆素對信號轉導和肌動蛋白動力學的影響從而抑制 LIMK 途徑下調腫瘤細胞的侵襲活性，使葫蘆素Ⅰ及其衍生物有成為新型抗癌藥物可能[36]。
3.2 LIMK2 抑制劑
Park 等[37]在腦膠質瘤中驗證了 BSM-5 和葫蘆素Ⅰ是抑制膠質母細胞瘤 GBM 細胞遷移和侵襲的有效抑制劑，而 BSM-5 被證明是一種高效的 LIMK 抑制劑，可以抑制 LIMK1 和 LIMK2。
Lexicon 藥物公司開發了具有高度特異性的 LIMK2 抑制劑（一種嘧啶類化合物），計劃用于局部治療眼高壓和相關性青光眼，但該抑制劑的細胞通透性及對微管細胞骨架的影響尚未見報道[38]。
T56-LIMKi 是由特拉維夫大學發現的可透過細胞的 LIMK2 高選擇性抑制劑，其被證明在小鼠異種移植模型中抑制胰腺腫瘤細胞的生長[39]。
以上研究結果提示，由于 LIMK1 和 LIMK 2 抑制劑具有極大的治療潛力，LIMK 抑制劑的報道數量正在穩步增加，目前報道對結直腸癌有效的抑制劑為 DADS 和葫蘆素Ⅰ，其余抑制劑是否對結直腸癌具有較高的特異性與有效性目前還不得而知，理想的抑制劑應該具有高效準確及不良反應少的特點，我們可以大膽設想上述抑制劑的作用機制是否同樣可以用于結直腸癌治療，當然這需要科研人員堅持不懈的努力來進行驗證。
4 小結與展望
目前 ROCK/LIMK/cofilin 及 PAK/LIMK/cofilin 通路已經被廣泛應用于腫瘤領域的研究，其在結直腸癌的發生及發展過程中也起著重要的作用；而且 LIMK 及其上下游的關鍵因子如 PAK、confilin 共同促進結腸癌的遷移和侵襲，LIMK 抑制劑也被證實有利于抑制腫瘤細胞的侵襲、轉移，但是其作用于人體的效果暫未有相關的研究報道，還需再進一步研究。雖然全世界的醫療科研人員已經做了很多努力來治愈惡性腫瘤，但仍然存在不明確的病因和機制。在惡性腫瘤治療已經走向靶向與精準治療的今天，LIMK 位于 ROCK/LIMK/cofilin 及 PAK/LIMK/cofilin 兩條信號通路的下游，具有重要的地位，LIMK1 與 LIMK2 的高選擇抑制劑已顯示出精準治療惡性腫瘤的潛力，對于 LIMK 高表達的結直腸癌而言治療前景讓人樂觀。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：唐果起草論文初稿，高鑫對論文進行了校對及修改，魏壽江對文章內容作了批評性審閱。
2018 年美國癌癥學會發布的全球癌癥統計數據顯示，結直腸癌發病率為 11%，排第 3 位，病死率為 9%，排第 2 位[1]。2015 年中國癌癥統計數據顯示，我國結直腸癌發病率、病死率在全部惡性腫瘤中均居第 5 位，其中新發病例 37.6 萬例，死亡病例 19.1 萬例，其中結腸癌的發病率上升顯著，且多數患者發現時已屬中晚期[2]。目前對于結腸癌的有效治療手段為手術及放化療，但侵襲和轉移是導致治療失敗甚至患者死亡的最重要原因。有大量研究[3-5]表明，LIM 激酶（LIMK）及其各通路上下游因子參與了細胞周期進展、腫瘤新生血管生成及腫瘤細胞侵襲、遷移、增殖等多種細胞生物學行為，其一直以來都被作為腫瘤治療的靶點被廣泛研究。近來研究發現，LIMK 在結直腸癌組織中明顯高表達，其在結直腸癌的侵襲、轉移及復發過程中起著重要作用。筆者現對 LIMK 家族成員的結構功能及其抑制劑在結直腸癌治療中的最新研究進展進行綜述。
1 LIMK 的結構及生理學意義
1.1 LIMK 家族成員
LIMK 家族中有 LIMK1 和 LIMK2 兩大成員，它們是調節肌動蛋白聚合和微管分解的蛋白激酶，兩者分別由不同的基因編碼。LIMK1 和 LIMK2 顯示獨特的結構排列，在 N 末端具有兩個 LIM 結構域，盤狀同源區域（PDZ 結構域）連接至富含脯氨酸/絲氨酸（Ser）的區域和 C 末端激酶結構域[6]。
1.1.1 LIMK1
LIMK1 的基因定位于 7q11.23，其由 39 499 個堿基對及 16 個外顯子組成，可在細胞質與細胞核中表達，但由于 PDZ 結構域里兩個功能性的富含亮氨酸的核轉錄信號使 LIMK1 更優先定位于細胞質。LIMK1 是一種致癌激酶，負責所有實體瘤的轉移及阿爾茨海默病的過程[7]；LIMK1 的失調會導致紡錘體缺陷和染色體異常[8]。
1.1.2 LIMK2
LIMK2 的基因定位于 22q12.2。數據庫描述人類 LIMK2 有 3 種同種型：LIMK2a、LIMK2b 和 LIMK2-1，三者的功能可能不完全重疊，其機制尚不清楚。LIMK2a 存在于細胞質和細胞核中，而 LIMK2b 與 LIMK2-1 主要定位于細胞質[9]。之前對 LIMK2 的研究主要集中在細胞骨架重組的作用上，且主要廣泛應用于神經系統。LIMK2 屬于 Rho/ROCK/LIMK2/cofilin 信號通路，其主要功能是通過肌動蛋白解聚因子（ADF）、磷酸化絲切蛋白來調節肌動蛋白絲與細胞質各種膜結構的重新組裝。LIMK2 在各種惡性腫瘤中都表現出各自不同的功能，如在神經母細胞瘤中 LIMK2 誘導耐藥性增加，在結腸癌中 LIMK2 可以限制干細胞的增殖，LIMK2 的磷酸化是乳腺癌進展和轉移的關鍵[10]。
1.2 LIMK 及其上下游分子
LIM 結構域使 LIMK 能夠直接與許多大分子配偶體相互作用，包括幾種 RhoGTP 酶如 Rac1、Cdc42、RhoA 以及它們的下游效應子 p21 活化蛋白激酶（PAK）1—4 和 ROCK1—2。已證明 ROCK1、ROCK2 及 PAK 可以磷酸化并激活 LIMK，而 LIMK 能夠特異性地使下游分子 cofilin 的 Ser3 位點磷酸化，將 cofilin 磷酸化使其失活，從而在多種腫瘤的細胞遷移、侵襲、轉移和神經發育障礙（如威廉綜合征）過程中發揮作用[11]。隨著對 LIMK 通路研究的逐漸深入，LIMK 與上游的 PAK 和 ROCK 以及其下游分子 cofilin 的相互機制逐漸清晰，下面對它們作一介紹。
1.2.1 LIMK 與 PAK
PAK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白，可促進細胞存活，抑制細胞黏附，促進不依賴貼壁的生長，是 GTP 酶 Rho/Rac 家族的下游信號傳導效應物，是 LIMK1 最重要的上游分子之一。PAK 在多種惡性腫瘤細胞的發展過程中發揮重要作用，包括癌細胞侵襲和遷移、細胞骨架信號傳導途徑、細胞周期進程、細胞存活和細胞凋亡。PAK 有 PAK1—6 這 6 種不同類型，根據其域結構的不同被分為 PAK1—3 和 PAK4—6 兩組。第一組 PAK1—3 家族已被集中研究。第二組 PAK4—6 中的 PAK4 作為第一個被鑒定和研究的成員，發現其在多種惡性腫瘤中高頻率過表達，包括胃癌、結腸癌、乳腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌和卵巢癌[12-13]；還發現其與腫瘤發生的許多標志有關，包括錨定非依賴性生長、血管生成、細胞存活增加、遷移和侵襲[14-15]。因此，PAK4 作為惡性腫瘤治療過程中極具潛力的研究靶點，許多課題組研究 PAK4 抑制劑來降低 LIMK1 的表達以期直接或間接達到治療的目的。Li 等[16]通過配對重組蛋白質分析鑒定出 LIMK1 作為體外 PAK4 的底物，PAK4 在體外和體內是致瘤的，發現其在許多癌細胞系和腫瘤中過表達或基因擴增，且經驗證 PAK4 通過 PAK4/ LIMK1/cofilin 信號通路參與細胞骨架動力學調節癌細胞遷移和侵襲[17]。
1.2.2 LIMK 與 ROCK
LIMK2 屬于 Rho/ROCK/LIMK2/cofilin 途徑，ROCK、Rho 的下游蛋白激酶。ROCK 特異性激活 LIMK2，但不激活 RhoA 下游的 LIMK1。通過與 ROCK（ROCK-Delta3）的活性形式共表達刺激 LIMK1 和 LIMK2 對 cofilin 磷酸化的活性，而 ROCK1 可以選擇性激活 LIMK2 但不激活 LIMK1。RhoA 對 LIMK2 的激活受到 ROCK 的特異性抑制劑 Y-27632 的抑制。ROCK 直接磷酸化蘇氨酸 505 并激活 RhoA 下游的 LIMK2，從而使 cofilin 失活以誘導肌動蛋白細胞骨架重組[18]。
1.2.3 LIMK 與 cofilin
cofilin 是 LIMK 下游信號分子之一，屬于 ADF/cofilin 家族，是一種存在于真核生物中的肌動蛋白，它的相對分子質量很低，只有 21 000。在哺乳動物基因中有 2 種亞型，分別編碼為 cofilin-1 和 cofilin-2，cofilin 主要依靠調節肌動蛋白的解聚和聚合來發揮生理功能。LIMK1 和 LIMK2 均能夠特異性地使 Ser3 位點磷酸化，將 cofilin 磷酸化使其失活，LIMK1 在整個腫瘤進展過程中過表達，通過 β-連環蛋白核易位與 LIMK2 產生競爭性抑制[19]。而使 cofilin 脫磷酸化的主要激活物是彈弓磷酸激酶（slingshot，SSH），它可使失活的磷酸化 cofilin 脫磷酸化而復活，以此來恢復 cofilin 的活性從而發揮其功能[20]。cofilin 通路對于體外和體內細胞運動和形態發生起至關重要的作用，肌動蛋白的核轉運、肌動蛋白骨架的重組、胞質分裂等都與磷酸化的 cofilin 蛋白相聯系，它們經 Rho/ROCK/LIMK/cofilin 通路在腫瘤細胞侵襲和轉移方面起著重要的作用[21]。cofilin 在人類惡性腫瘤中呈過表達，同時其參與調節影響結腸癌細胞中上皮間充質轉化（EMT）期間細胞-細胞黏附組織的肌動蛋白細胞骨架動力學[22]。
2 LIMK 與結直腸癌
據文獻[23]報道，大約 50% 的結直腸癌患者在疾病過程中會發生轉移，5 年生存率通常只有 55% 左右。對于結直腸癌患者，腫瘤侵襲、轉移是其死亡的主要原因，而結直腸癌侵襲、轉移又是一個多步驟、多階段、多基因參與的過程[24]。近年來的研究已涉及腫瘤侵襲、轉移的分子框架，但治療結直腸癌轉移的有效靶點卻很局限。因此，揭示結直腸癌侵襲、轉移的分子機制仍很重要。
南方醫科大學的研究團隊[25]通過免疫組織化學方法及蛋白質印跡法檢測發現，在 152 例石蠟包埋保存結腸癌組織中的 LIMK1 較癌旁正常黏膜組織呈過表達，采用免疫印跡和免疫沉淀方法確定了兩種腫瘤轉移相關蛋白 MYH9 和 ACTN4 為 LIMK1 的直接靶標，三者相互作用促進結腸癌進展。
Su 等[26]通過對 87 例手術切除的結腸癌標本和 34 例與結腸癌相鄰的正常組織陣列的免疫組織化學染色分析發現，結腸癌組織中 LIMK1 和 destrin（ADF 成員之一）呈高表達，二者高表達與結腸癌的發生和發展有關；進一步通過二烯丙基二硫（DADS，一種從大蒜素中提取的脂溶性有機硫化合物）對人結腸癌細胞系 SW480 處理后研究證明了 DADS 可以下調 LIMK1 的表達，抑制 LIMK1/cofilin 信號通路，阻礙血管生成和 EMT，抑制結腸癌的遷移和侵襲，從而驗證了 DADS 具有抗癌作用，可用于抑制腫瘤細胞遷移和侵襲。
Zhang 等[19]通過免疫組織化學和 RT-PCR 檢測 LIMK2 在結腸癌組織中下調，且發現 LIMK2 隨著腫瘤從癌前病變進展到晚期惡性腫瘤而逐漸下調，這一點與 LIMK1 持續處于過表達狀態是不同的，LIMK2 通過 G1?S 期轉換的細胞周期停滯、抑制細胞增殖，通過限制 EMT 過程抑制細胞轉移的能力，降低的 LIMK2 表達增強了 β-連環蛋白的核積累并激活了 Wnt 信號傳導途徑可導致結腸癌進展和轉移，LIMK1 和 LIMK2 的這種不均衡表達在結腸癌進展中扮演新的重要角色。但是 Aggelou 等[20]的研究結果與 Zhang 等[19]研究結果不太一致，該研究中發現，LIMK1 和 LIMK2 在人類結腸癌中都是高度表達，并且與侵襲深度、淋巴結轉移和分期呈正相關；該研究中還采用免疫組織化學方法評估了 143 例人類結腸癌樣本中 LIMK1、LIMK2 和 cofilin 明顯過表達，比癌旁的正常組織分別高了 93.7%、89.5% 和 86.7%，從而證明了 LIMK1、LIMK2 和 cofilin 三種蛋白的含量與腫瘤分級呈正相關。
Min 等[27]在結腸癌 HCT116 細胞中驗證蛋白去乙酰化酶 SIRT2 可通過熱休克蛋白 90 脫乙酰化和抑制 LIMK1/cofilin 途徑調節肌動蛋白動力學和細胞遷移而起到抑制腫瘤侵襲和進展的作用。
有研究[23]報道，在結腸癌 HT-29 細胞中 cofilin-1 可通過激活 RhoA/LIMK2/cofilin-1 信號調節肌動蛋白細胞骨架重組和細胞-細胞黏附調節從而介導 EMT，cofilin-1 和非磷酸化 cofilin-1 的亞細胞分布不均勻導致肌動蛋白聚合率增加，進而在轉化生長因子-β 誘導的 EMT 期間增強結腸癌細胞 HT-29 的遷移及侵襲。
以上研究結果提示，LIMK 及 cofilin 的表達與結直腸癌的分化程度呈正相關，并且能促進腫瘤細胞的遷移、侵襲。但是否存在其他的 LIMK 家族成員以及 LIMK1 與 LIMK2 調控的具體機制目前尚不明確，需要我們繼續探索。針對 LIMK 家族能夠促進腫瘤細胞遷移、侵襲的特點，抑制 ROCK/LIMK/cofilin 及 PAK/LIMK/cofilin 通路已成為治療惡性腫瘤的一個新出路。
3 LIMK 抑制劑與結直腸癌治療
由于 ROCK/LIMK/cofilin 及 PAK/LIMK/cofilin 信號通路的異常激活會引發惡性腫瘤的發展、侵襲和轉移，因此，可以通過干預 ROCKs、LIMKs 和 cofilin 表達或活性來調節肌動蛋白以延緩癌細胞增殖、遷移和侵襲[28]。LIMK 通過 cofilin 調節肌動蛋白及微管的動態來整合上游信號，使其與結直腸癌的遷移及侵襲密切相關[29-30]。因此，尋找能夠抑制或調節 LIMK 活性的藥物將為結直腸癌的治療提供一種新的方案。
3.1 LIMK1 抑制劑
有研究[31]發現，一種全新的 1-菲基-四氫異喹啉衍生物可以誘導人乳腺癌 MCF-7 細胞的 G1/S 期細胞周期，并通過調節 PAK4/LIMK1/cofilin 信號通路抑制 MCF-7 細胞的遷移和侵襲。Hao 等[32]通過蛋白質印跡分析等方法研究了 1-菲基-四氫異喹啉衍生物對 PAK4/LIMK1/cofilin 信號傳導途徑的影響，在用不同濃度的衍生物處理 24 h 的肺腺癌 A549 細胞中觀察到其對 LIMK1 和 cofilin 磷酸化的抑制；在肺腺癌 A549 細胞異種移植人肺癌細胞小鼠模型腫瘤形成實驗中顯示其腫瘤生長抑制率>55%（P<0.05），也證明該衍生物對腫瘤細胞顯著的抑制和抗增殖作用。
DADS 作為一種從大蒜素中提取的脂溶性有機硫化合物，可通過抑制 LIMK 作為主要靶標并影響 ROCK1/PAK1/LIMK1/cofilin 信號通路來減少結直腸癌 SW480 細胞的遷移和侵襲[29]；其還被證明可以下調胃及結腸腫瘤細胞中的 LIMK1 來抑制 EMT，從而抑制腫瘤細胞的侵襲、增殖和遷移[26]。
虎刺醛，是一種新研究的蒽醌衍生物。據文獻[33]報道，虎刺醛能通過抑制 LIMK1 的表達而達到抑制乳腺癌細胞的侵襲與遷移的作用。
Nguyen 等[34]在研究 PAK1 抑制劑時發現，含羞草堿四肽（MFFY、MFWY 和 MFYY）和高良姜提取物（hispidin）衍生物（H1-3）對 LIMK1 也具有強的抑制活性。
葫蘆素Ⅰ是一種從植物中分離的細胞毒性三萜類固醇，它們可以抑制 LIMK 對磷酸 cofilin 的激活，從而使得宮頸癌 HeLa 細胞和人結直腸腺癌細胞 Caco-2 增殖和遷移延遲[35]。葫蘆素還可以誘導肌動蛋白與磷酸肌球蛋白Ⅱ的共聚集，這種共聚集很可能是由 Rho/ROCK 途徑的刺激和在體外通過與 LIMK 的直接相互作用抑制所引起的。葫蘆素對信號轉導和肌動蛋白動力學的影響從而抑制 LIMK 途徑下調腫瘤細胞的侵襲活性，使葫蘆素Ⅰ及其衍生物有成為新型抗癌藥物可能[36]。
3.2 LIMK2 抑制劑
Park 等[37]在腦膠質瘤中驗證了 BSM-5 和葫蘆素Ⅰ是抑制膠質母細胞瘤 GBM 細胞遷移和侵襲的有效抑制劑，而 BSM-5 被證明是一種高效的 LIMK 抑制劑，可以抑制 LIMK1 和 LIMK2。
Lexicon 藥物公司開發了具有高度特異性的 LIMK2 抑制劑（一種嘧啶類化合物），計劃用于局部治療眼高壓和相關性青光眼，但該抑制劑的細胞通透性及對微管細胞骨架的影響尚未見報道[38]。
T56-LIMKi 是由特拉維夫大學發現的可透過細胞的 LIMK2 高選擇性抑制劑，其被證明在小鼠異種移植模型中抑制胰腺腫瘤細胞的生長[39]。
以上研究結果提示，由于 LIMK1 和 LIMK 2 抑制劑具有極大的治療潛力，LIMK 抑制劑的報道數量正在穩步增加，目前報道對結直腸癌有效的抑制劑為 DADS 和葫蘆素Ⅰ，其余抑制劑是否對結直腸癌具有較高的特異性與有效性目前還不得而知，理想的抑制劑應該具有高效準確及不良反應少的特點，我們可以大膽設想上述抑制劑的作用機制是否同樣可以用于結直腸癌治療，當然這需要科研人員堅持不懈的努力來進行驗證。
4 小結與展望
目前 ROCK/LIMK/cofilin 及 PAK/LIMK/cofilin 通路已經被廣泛應用于腫瘤領域的研究，其在結直腸癌的發生及發展過程中也起著重要的作用；而且 LIMK 及其上下游的關鍵因子如 PAK、confilin 共同促進結腸癌的遷移和侵襲，LIMK 抑制劑也被證實有利于抑制腫瘤細胞的侵襲、轉移，但是其作用于人體的效果暫未有相關的研究報道，還需再進一步研究。雖然全世界的醫療科研人員已經做了很多努力來治愈惡性腫瘤，但仍然存在不明確的病因和機制。在惡性腫瘤治療已經走向靶向與精準治療的今天，LIMK 位于 ROCK/LIMK/cofilin 及 PAK/LIMK/cofilin 兩條信號通路的下游，具有重要的地位，LIMK1 與 LIMK2 的高選擇抑制劑已顯示出精準治療惡性腫瘤的潛力，對于 LIMK 高表達的結直腸癌而言治療前景讓人樂觀。
重要聲明
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作者貢獻聲明：唐果起草論文初稿，高鑫對論文進行了校對及修改，魏壽江對文章內容作了批評性審閱。