引用本文： 唐戀莎, 何文博, 劉楓. BRAF 基因突變輔助甲狀腺結節診斷為甲狀腺乳頭狀癌的價值研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(8): 1007-1010. doi: 10.7507/1007-9424.201902069 復制
甲狀腺結節是迄今為止最常見的內分泌疾病。大約 5% 的女性和 1% 的男性有可觸到的甲狀腺結節，當年齡達到 60 歲時約有 50% 的人至少有 1 枚甲狀腺結節；而在針對其他疾病進行頸部彩超、計算機斷層掃描或磁共振成像檢查時報告的“甲狀腺偶發瘤”的患病率高達 70%，在這些甲狀腺結節中，良性占大半，預后良好，終身不需手術，但有 7%～15% 為甲狀腺癌[1]。甲狀腺癌中最常見的類型是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC），占 80%～90%[2-3]。細針穿刺細胞學檢查（fine needle aspiration cytology，FNAC）是術前鑒別甲狀腺結節良惡性的金標準，但其檢查結果中有 10%～30% 的甲狀腺結節由于受多灶、大小、細胞病理學家的經驗、惡性腫瘤細胞形態特征的混雜、取材不足等多種因素的影響而仍不能確定其良惡性性質，在不確定性質結節的術后病理結果中發現僅 20%～25% 為甲狀腺癌，而其余的 75%～80% 患者有可能接受了不必要的甲狀腺手術[4-6]。因此，目前需要敏感性更高的檢測手段來提高甲狀腺良惡性結節診斷的精確性，從而避免良性結節患者接受過度治療[7-11]。目前有大量 FNAC 聯合 BRAF 基因突變應用于 PTC 的術前診斷和預后評估的研究[12-16]，但對其作為常規檢測用于術前診斷 PTC 存在一定的爭議，特別是對于鑒別不確定性質的良惡性結節的診斷價值有不同的觀點[4, 17]。筆者現將針對 BRAF 基因突變對良惡性結節及 PTC 的診斷相關研究進展進行總結分析。
1 BRAFV600E 基因突變與 PTC
BRAF 基因又稱鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體 B1，屬于 RAF 基因家族，位于人染色體 7q34，長約 190 kb，是 RET 和 RAS 的下游信號分子，其編碼的 BRAF 蛋白是 RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 信號通路的關鍵要素，也是 MAPK 信號通路中最強的激活因子，該信號通路具有調節細胞的生長、增殖和凋亡的重要作用，其激活后可能導致腫瘤的發生[5]。目前發現的 BRAF 基因突變類型已經超過 40 種，最為常見的是位于第 15 外顯子 T1799A 位點的 V600E 變異，占全部突變的 90%，因而又將 BRAFV600E基因突變稱為 BRAF 基因突變。
隨著對甲狀腺癌分子機制的深入研究發現，BRAF 基因突變是促使 PTC 形成與進展的重要分子改變，是迄今為止研究中比較明確的 PTC 形成的主要原因[18]。現有研究[19]表明，BRAF 基因突變僅發生于 PTC 和 PTC 起源的未分化甲狀腺癌，而在甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌及甲狀腺良性病變（腺瘤、增生等）中均未發現有該基因突變。在不同國家、不同研究[18-22]的報道中，BRAFV600E 基因在 PTC 中的突變率不同，突變率范圍為 29%～90%，其中高達 90% 的突變率是最近韓國的一項研究[22]采用免疫組織化學法檢測 PTC 的 BRAF 基因突變報道的，多數的研究報道 BRAF 基因突變率為 40%～50%，其突變率范圍之所以較大，有學者[19-22]推測其可能與種族差異、環境因素、特定人群的遺傳傾向、區域差異、疾病的不同階段、基因檢測手段、測序方法的不同、樣本大小、組織獲取等的差異有關。
2 BRAF 基因突變輔助診斷甲狀腺結節為 PTC 的特異性
BRAF 基因突變在 PTC 中具有較高的突變率，即使是微小的 PTC 也能通過分子學檢出 BRAF 基因突變[6]；且 BRAF 基因突變僅見于 PTC 或 PTC 起源的未分化甲狀腺癌，而良性病變組織、正常甲狀腺組織中不存在這一基因突變，因此其具有非常高的特異性[19]。Collet 等[23]對 97 例 FNAC 診斷為 PTC 的甲狀腺結節行 BRAF 基因突變檢測，發現 BRAF 基因突變診斷 PTC 的特異性和陽性預測值為 100%。有 2 篇 meta 分析[4, 15]結果同樣顯示 BRAF 基因突變檢測對甲狀腺結節診斷 PTC 的特異性接近 100%。同時也有研究[24-25]證明，幾乎所有 BRAF 基因突變陽性的甲狀腺結節經甲狀腺切除術后病理診斷均為 PTC。因此，如果甲狀腺結節 FNAC 的檢查結果為不典型或難以確診但 BRAF 基因突變檢測為陽性者幾乎就可以確診為 PTC[26]。由此可見，BRAF 基因突變可作為輔助診斷 PTC 的指標，對 PTC 的診斷具有高度的特異性，對甲狀腺結節惡性腫瘤有非常高的陽性預測價值[27-28]。
3 BRAF 基因突變對不明確性質甲狀腺結節輔助診斷為 PTC 的敏感性
現有研究中 PTC 的 BRAF 基因突變率浮動范圍非常大，為 29%～90%，BRAF 基因突變檢測診斷 PTC 的敏感性為 0.09～0.60[4, 14-15, 17]，不如特異性高，對于 BRAF 基因突變檢測用于不確定性質甲狀腺結節術前輔助診斷 PTC 的診斷價值存在一定爭議[29]。Jia 等[4]納入 16 項研究 1 131 例不明確性質甲狀腺結節的 meta 分析顯示，BRAF 基因突變檢測對不明確性質甲狀腺結節輔助診斷 PTC 的敏感度為 0.60 ［95% CI（0.556，0.634）］，特異性為 0.99 ［95% CI（0.976，0.997）］，認為 BRAF 基因突變具有輔助診斷價值；而 Trimboli 等[17]納入 8 項研究的 meta 分析顯示，在 1 361 例不明確性質的甲狀腺結節中 BRAF 基因突變僅 43 例，陽性率極低，認為 BRAF 基因突變的診斷價值非常有限。這兩項研究產生相左結論的原因可能有以下幾點：① 研究包括的病例數量有限；② 沒有對不確定性質結節的類別進行系統地分層；③ 不同類別的不確定性質結節中 BRAF 基因突變的突變率及敏感性不同。
目前采用國際公認的 Bethesda 甲狀腺細胞病理學報告系統[30]將不確定性結節分為 6 個類別，分別是：① 標本無法診斷或不滿意；② 良性；③ 意義不明確的細胞非典型性病變或濾泡性病變（AUS/FLUS）；④ 濾泡性腫瘤或可疑的濾泡性腫瘤（FN/SFN）；⑤ 可疑的惡性腫瘤（SMC）；⑥ 惡性。不同類別的結節中惡性腫瘤發病率在 SMC、AUS/FLUS、FN/SFN 中分別為 60%～75%、7%～48%、15%～30%[30]。Su 等[14]納入了 88 項研究進行 meta 分析，對不同類別結節進行了系統分層，其 meta 分析結果證實了不同類別結節 SMC、AUS/FLUS、FN/SFN 中 BRAF 基因突變率各不相同（分別為 43.2%、13.77%、4.43%），而這些結節中 BRAF 基因突變診斷 PTC 的敏感性高低順序（分別為 59.4%、40.1%、19.5%）與其基因突變率順序一致；Jinih 等[15]納入 32 項研究包括 3 150 例不確定性質結節的 meta 分析結果顯示，在 SMC、AUS/FLUS、FN/SFN 結節中 BRAF 基因診斷 PTC 的敏感性分別為 0.58、0.21、0.09。通過對目前的研究分析來看，BRAF 基因突變在不同類別的結節中有不同突變率及敏感性，在 SMC、AUS/FLUS 結節中呈現較高的敏感性是因為其較高的 BRAF 基因突變率，而高敏感性也與其惡性腫瘤發病率基本相符；在 FN/SFN 結節中的低敏感性、低突變率均低于其惡性腫瘤發病率，這可能是 BRAF 基因突變用于鑒別甲狀腺結節良惡性性質以及 PTC 術前輔助診斷有效性評估存在一定爭議的原因。
4 BRAF 基因突變陰性對不明確性質甲狀腺結節輔助診斷良惡性及 PTC 的分析
文獻報道在 FN/SFN 結節中，BRAF 基因突變陰性發生率約為 70%[31]，在 PTC 中 BRAF 基因突變的假陰性率約為 18%[32]。我們對 FN/SFN 結節和 PTC 中對 BRAF 基因突變的陰性率進行分析。
在 FN/SFN 結節中 BRAF 基因突變出現較高的陰性可能是因為 FN/SFN 結節主要由多種組成成分（濾泡細胞變異性 PTC，濾泡性甲狀腺癌，腺瘤樣增生和濾泡性腺瘤）組成。對濾泡細胞變異性 PTC 和濾泡性甲狀腺癌的遺傳分子學研究[33-34]表明，它們的 BRAF 基因突變率非常低，相反 RAS 突變率較高，RAS 突變在濾泡性甲狀腺癌中最高（45%），在濾泡細胞變異性 PTC 中為 26%～45%，濾泡性腺瘤中較低（30%），故 FN/SFN 結節中 BRAF 基因的低突變率、RAS 高突變率可能是其假陰性結果的主要來源。最近，An 等[35]報道，在相當多的 BRAF 基因突變陰性的不確定性質結節中發現有 RAS61 基因突變，單一 RAS 突變分析不明確性質甲狀腺結節就具有較高的敏感性（93.3%）和特異性（75.0%），采用 RAS 突變和 BRAF 突變聯合分析可提高不確定性質結節 60%～70% 的診斷率，而當與 FNAC 結合時，RAS61 突變分析在 AUS/FLUS 或 FN/SFN 結節中對濾泡細胞變異性 PTC 具有高度預測性，但 RAS 突變在良性濾泡性腺瘤中也有突變，因此也存在假陽性的可能。
對于 PTC 中出現的假陰性來說，PTC 中除 BRAF 基因突變和 RAS 基因突變外，還包括 RET-PTC、PI3K、PTEN、PAX8-PPARγ 重排等遺傳分子突變[36]，這些多種遺傳分子突變可能是 PTC 中 BRAF 基因突變出現陰性的原因。而測試其他遺傳分子 RET-PTC、PAX8-PPARγ 等改變也可能有助于改善對不明確性質的甲狀腺結節的良惡性及 PTC 的診斷[33, 36]。
但迄今為止，還未發現用于診斷不明確性質的甲狀腺結節的兼顧敏感性和特異性的分子標志物[31, 36]。最近，Brown 等[37]研究表明，對懷疑是惡性腫瘤但沒有測出基因突變結節的 FNAC 上清液進行 BRAF 基因突變檢測，可以將 PTC 診斷率提高 9%。因此，對于不明確性質的甲狀腺結節的診斷檢測還有待進一步研究。
5 小結與展望
BRAF 基因突變在甲狀腺結節的發生及發展中發揮著重要作用。在 FNAC 的基礎上，增加 BRAF 基因突變檢測將有助于提高甲狀腺惡性結節特別是 PTC 的確診率，對其診斷具有高度的特異性。盡管 BRAF 基因檢測用于診斷 PTC 的敏感性不如特異性高并有一定的假陰性，但其敏感性與其 BRAF 基因突變發生率基本一致。在不明確性質的結節中，BRAF 基因突變檢測在其突變發生率高的結節（SMC、AUS/FLUS 結節）中具有較高的診斷價值，而在突變發生率極低的 FN/SFN 結節中很大程度上會出現假陰性。綜合來看，BRAF 基因檢測有望成為提高甲狀腺結節診斷為 PTC 的診斷率的高特異性的診斷分子標志物。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：唐戀莎起草論文初稿，何文博協助起草論文初稿，劉楓修改指導論文并對文章的知識性內容作批評性審閱。
甲狀腺結節是迄今為止最常見的內分泌疾病。大約 5% 的女性和 1% 的男性有可觸到的甲狀腺結節，當年齡達到 60 歲時約有 50% 的人至少有 1 枚甲狀腺結節；而在針對其他疾病進行頸部彩超、計算機斷層掃描或磁共振成像檢查時報告的“甲狀腺偶發瘤”的患病率高達 70%，在這些甲狀腺結節中，良性占大半，預后良好，終身不需手術，但有 7%～15% 為甲狀腺癌[1]。甲狀腺癌中最常見的類型是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC），占 80%～90%[2-3]。細針穿刺細胞學檢查（fine needle aspiration cytology，FNAC）是術前鑒別甲狀腺結節良惡性的金標準，但其檢查結果中有 10%～30% 的甲狀腺結節由于受多灶、大小、細胞病理學家的經驗、惡性腫瘤細胞形態特征的混雜、取材不足等多種因素的影響而仍不能確定其良惡性性質，在不確定性質結節的術后病理結果中發現僅 20%～25% 為甲狀腺癌，而其余的 75%～80% 患者有可能接受了不必要的甲狀腺手術[4-6]。因此，目前需要敏感性更高的檢測手段來提高甲狀腺良惡性結節診斷的精確性，從而避免良性結節患者接受過度治療[7-11]。目前有大量 FNAC 聯合 BRAF 基因突變應用于 PTC 的術前診斷和預后評估的研究[12-16]，但對其作為常規檢測用于術前診斷 PTC 存在一定的爭議，特別是對于鑒別不確定性質的良惡性結節的診斷價值有不同的觀點[4, 17]。筆者現將針對 BRAF 基因突變對良惡性結節及 PTC 的診斷相關研究進展進行總結分析。
1 BRAFV600E 基因突變與 PTC
BRAF 基因又稱鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體 B1，屬于 RAF 基因家族，位于人染色體 7q34，長約 190 kb，是 RET 和 RAS 的下游信號分子，其編碼的 BRAF 蛋白是 RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 信號通路的關鍵要素，也是 MAPK 信號通路中最強的激活因子，該信號通路具有調節細胞的生長、增殖和凋亡的重要作用，其激活后可能導致腫瘤的發生[5]。目前發現的 BRAF 基因突變類型已經超過 40 種，最為常見的是位于第 15 外顯子 T1799A 位點的 V600E 變異，占全部突變的 90%，因而又將 BRAFV600E基因突變稱為 BRAF 基因突變。
隨著對甲狀腺癌分子機制的深入研究發現，BRAF 基因突變是促使 PTC 形成與進展的重要分子改變，是迄今為止研究中比較明確的 PTC 形成的主要原因[18]。現有研究[19]表明，BRAF 基因突變僅發生于 PTC 和 PTC 起源的未分化甲狀腺癌，而在甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌及甲狀腺良性病變（腺瘤、增生等）中均未發現有該基因突變。在不同國家、不同研究[18-22]的報道中，BRAFV600E 基因在 PTC 中的突變率不同，突變率范圍為 29%～90%，其中高達 90% 的突變率是最近韓國的一項研究[22]采用免疫組織化學法檢測 PTC 的 BRAF 基因突變報道的，多數的研究報道 BRAF 基因突變率為 40%～50%，其突變率范圍之所以較大，有學者[19-22]推測其可能與種族差異、環境因素、特定人群的遺傳傾向、區域差異、疾病的不同階段、基因檢測手段、測序方法的不同、樣本大小、組織獲取等的差異有關。
2 BRAF 基因突變輔助診斷甲狀腺結節為 PTC 的特異性
BRAF 基因突變在 PTC 中具有較高的突變率，即使是微小的 PTC 也能通過分子學檢出 BRAF 基因突變[6]；且 BRAF 基因突變僅見于 PTC 或 PTC 起源的未分化甲狀腺癌，而良性病變組織、正常甲狀腺組織中不存在這一基因突變，因此其具有非常高的特異性[19]。Collet 等[23]對 97 例 FNAC 診斷為 PTC 的甲狀腺結節行 BRAF 基因突變檢測，發現 BRAF 基因突變診斷 PTC 的特異性和陽性預測值為 100%。有 2 篇 meta 分析[4, 15]結果同樣顯示 BRAF 基因突變檢測對甲狀腺結節診斷 PTC 的特異性接近 100%。同時也有研究[24-25]證明，幾乎所有 BRAF 基因突變陽性的甲狀腺結節經甲狀腺切除術后病理診斷均為 PTC。因此，如果甲狀腺結節 FNAC 的檢查結果為不典型或難以確診但 BRAF 基因突變檢測為陽性者幾乎就可以確診為 PTC[26]。由此可見，BRAF 基因突變可作為輔助診斷 PTC 的指標，對 PTC 的診斷具有高度的特異性，對甲狀腺結節惡性腫瘤有非常高的陽性預測價值[27-28]。
3 BRAF 基因突變對不明確性質甲狀腺結節輔助診斷為 PTC 的敏感性
現有研究中 PTC 的 BRAF 基因突變率浮動范圍非常大，為 29%～90%，BRAF 基因突變檢測診斷 PTC 的敏感性為 0.09～0.60[4, 14-15, 17]，不如特異性高，對于 BRAF 基因突變檢測用于不確定性質甲狀腺結節術前輔助診斷 PTC 的診斷價值存在一定爭議[29]。Jia 等[4]納入 16 項研究 1 131 例不明確性質甲狀腺結節的 meta 分析顯示，BRAF 基因突變檢測對不明確性質甲狀腺結節輔助診斷 PTC 的敏感度為 0.60 ［95% CI（0.556，0.634）］，特異性為 0.99 ［95% CI（0.976，0.997）］，認為 BRAF 基因突變具有輔助診斷價值；而 Trimboli 等[17]納入 8 項研究的 meta 分析顯示，在 1 361 例不明確性質的甲狀腺結節中 BRAF 基因突變僅 43 例，陽性率極低，認為 BRAF 基因突變的診斷價值非常有限。這兩項研究產生相左結論的原因可能有以下幾點：① 研究包括的病例數量有限；② 沒有對不確定性質結節的類別進行系統地分層；③ 不同類別的不確定性質結節中 BRAF 基因突變的突變率及敏感性不同。
目前采用國際公認的 Bethesda 甲狀腺細胞病理學報告系統[30]將不確定性結節分為 6 個類別，分別是：① 標本無法診斷或不滿意；② 良性；③ 意義不明確的細胞非典型性病變或濾泡性病變（AUS/FLUS）；④ 濾泡性腫瘤或可疑的濾泡性腫瘤（FN/SFN）；⑤ 可疑的惡性腫瘤（SMC）；⑥ 惡性。不同類別的結節中惡性腫瘤發病率在 SMC、AUS/FLUS、FN/SFN 中分別為 60%～75%、7%～48%、15%～30%[30]。Su 等[14]納入了 88 項研究進行 meta 分析，對不同類別結節進行了系統分層，其 meta 分析結果證實了不同類別結節 SMC、AUS/FLUS、FN/SFN 中 BRAF 基因突變率各不相同（分別為 43.2%、13.77%、4.43%），而這些結節中 BRAF 基因突變診斷 PTC 的敏感性高低順序（分別為 59.4%、40.1%、19.5%）與其基因突變率順序一致；Jinih 等[15]納入 32 項研究包括 3 150 例不確定性質結節的 meta 分析結果顯示，在 SMC、AUS/FLUS、FN/SFN 結節中 BRAF 基因診斷 PTC 的敏感性分別為 0.58、0.21、0.09。通過對目前的研究分析來看，BRAF 基因突變在不同類別的結節中有不同突變率及敏感性，在 SMC、AUS/FLUS 結節中呈現較高的敏感性是因為其較高的 BRAF 基因突變率，而高敏感性也與其惡性腫瘤發病率基本相符；在 FN/SFN 結節中的低敏感性、低突變率均低于其惡性腫瘤發病率，這可能是 BRAF 基因突變用于鑒別甲狀腺結節良惡性性質以及 PTC 術前輔助診斷有效性評估存在一定爭議的原因。
4 BRAF 基因突變陰性對不明確性質甲狀腺結節輔助診斷良惡性及 PTC 的分析
文獻報道在 FN/SFN 結節中，BRAF 基因突變陰性發生率約為 70%[31]，在 PTC 中 BRAF 基因突變的假陰性率約為 18%[32]。我們對 FN/SFN 結節和 PTC 中對 BRAF 基因突變的陰性率進行分析。
在 FN/SFN 結節中 BRAF 基因突變出現較高的陰性可能是因為 FN/SFN 結節主要由多種組成成分（濾泡細胞變異性 PTC，濾泡性甲狀腺癌，腺瘤樣增生和濾泡性腺瘤）組成。對濾泡細胞變異性 PTC 和濾泡性甲狀腺癌的遺傳分子學研究[33-34]表明，它們的 BRAF 基因突變率非常低，相反 RAS 突變率較高，RAS 突變在濾泡性甲狀腺癌中最高（45%），在濾泡細胞變異性 PTC 中為 26%～45%，濾泡性腺瘤中較低（30%），故 FN/SFN 結節中 BRAF 基因的低突變率、RAS 高突變率可能是其假陰性結果的主要來源。最近，An 等[35]報道，在相當多的 BRAF 基因突變陰性的不確定性質結節中發現有 RAS61 基因突變，單一 RAS 突變分析不明確性質甲狀腺結節就具有較高的敏感性（93.3%）和特異性（75.0%），采用 RAS 突變和 BRAF 突變聯合分析可提高不確定性質結節 60%～70% 的診斷率，而當與 FNAC 結合時，RAS61 突變分析在 AUS/FLUS 或 FN/SFN 結節中對濾泡細胞變異性 PTC 具有高度預測性，但 RAS 突變在良性濾泡性腺瘤中也有突變，因此也存在假陽性的可能。
對于 PTC 中出現的假陰性來說，PTC 中除 BRAF 基因突變和 RAS 基因突變外，還包括 RET-PTC、PI3K、PTEN、PAX8-PPARγ 重排等遺傳分子突變[36]，這些多種遺傳分子突變可能是 PTC 中 BRAF 基因突變出現陰性的原因。而測試其他遺傳分子 RET-PTC、PAX8-PPARγ 等改變也可能有助于改善對不明確性質的甲狀腺結節的良惡性及 PTC 的診斷[33, 36]。
但迄今為止，還未發現用于診斷不明確性質的甲狀腺結節的兼顧敏感性和特異性的分子標志物[31, 36]。最近，Brown 等[37]研究表明，對懷疑是惡性腫瘤但沒有測出基因突變結節的 FNAC 上清液進行 BRAF 基因突變檢測，可以將 PTC 診斷率提高 9%。因此，對于不明確性質的甲狀腺結節的診斷檢測還有待進一步研究。
5 小結與展望
BRAF 基因突變在甲狀腺結節的發生及發展中發揮著重要作用。在 FNAC 的基礎上，增加 BRAF 基因突變檢測將有助于提高甲狀腺惡性結節特別是 PTC 的確診率，對其診斷具有高度的特異性。盡管 BRAF 基因檢測用于診斷 PTC 的敏感性不如特異性高并有一定的假陰性，但其敏感性與其 BRAF 基因突變發生率基本一致。在不明確性質的結節中，BRAF 基因突變檢測在其突變發生率高的結節（SMC、AUS/FLUS 結節）中具有較高的診斷價值，而在突變發生率極低的 FN/SFN 結節中很大程度上會出現假陰性。綜合來看，BRAF 基因檢測有望成為提高甲狀腺結節診斷為 PTC 的診斷率的高特異性的診斷分子標志物。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：唐戀莎起草論文初稿，何文博協助起草論文初稿，劉楓修改指導論文并對文章的知識性內容作批評性審閱。