引用本文： 吳巨鋼, 裴國清, 楊建軍, 火海鐘, 宋致成, 俞繼衛, 顧巖. HIBADH 蛋白表達在胃腺癌組織中的臨床意義及其在胃癌細胞中的功能研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(3): 294-300. doi: 10.7507/1007-9424.201810026 復制
胃癌是當今世界第 5 大最常見的惡性腫瘤，也是導致癌癥相關死亡的第 3 大原因[1]。在中國，胃癌相關死亡則攀升至第 2 位。根據大數據統計分析，2015 年我國胃癌新發病例為 67.91 萬例，胃癌相關死亡人數為 49.8 萬人[1]。男性更易罹患胃癌[1]。胃癌侵襲轉移能力強是導致預后不良的主要原因。越來越多的研究試圖解釋胃癌發生發展的機制，但至今仍未取得突破性進展，仍未找到有效的治療靶點[2-3]。因此，尋找胃癌特異性標志物是關系到人類健康的一個重要問題，迫在眉睫。3-羥異丁酸脫氫酶（3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase，HIBADH）是一種代謝相關蛋白，是糖異生過程中葡萄糖異丁酸生成途徑的一種關鍵酶[4]。HIBADH 蛋白參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解，是纈氨酸分解代謝途徑的中心代謝酶[5]。HIBADH 蛋白的底物是 3-羥基-2-甲基-丙酸酯和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，3 種代謝產物分別為 2-甲基三乙氧基泛酸鹽、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和 H+。HIBADH 蛋白主要在各種組織和細胞的線粒體中表達[6]。多項研究[7-8]通過蛋白質組學方法分析發現，HIBADH 蛋白是一種與細胞運動相關的蛋白。據報道[9]，使用沙蟾蜍精處理宮頸癌 Hela 細胞后，HIBADH 蛋白的表達量明顯下降，提示 HIBADH 蛋白可能在腫瘤細胞中發揮作用，但具體作用和機制尚不清楚。本研究擬進一步研究以明確 HIBADH 蛋白表達和胃癌的關系。
1 資料和方法
1.1 研究對象
納入標準：行胃癌根治術；隨訪資料保存完整；原發灶和癌旁組織石蠟標本保存完整。排除標準：中途失訪，隨訪數據不完整；殘胃癌患者。回顧性收集 2006 年 1 月至 2007 年 12 月期間上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院普外科收治的 76 例胃腺癌患者，收集患者的胃癌原發灶和癌旁組織（距離腫瘤以遠 5 cm）的石蠟標本。76 例患者中，男 48 例，女 28 例；中位年齡為 64 歲（30～81 歲），其中≥60 歲者 52 例。所有患者接受胃癌根治術，且術前均未接受化療或放療。其中行全胃切除 9 例，行遠端胃切除 57 例，行近端胃切除 10 例。2 例患者行 D1 淋巴結清掃術，68 例患者行 D2 淋巴結清掃術，6 例患者行 D3 淋巴結清掃術。腫瘤直徑為 0.4～10.0 cm、（5.08±2.66）cm，其中≥5 cm 者 38 例。術后病理檢查：早期腺癌 13 例，BorrmannⅠ型 3 例，Borrmann Ⅱ型 10 例，Borrmann Ⅲ型 41 例，Borrmann Ⅳ型 9 例；組織分化程度：高分化 14 例，中分化 6 例，低分化 56 例；Lauren’s 分型：腸型 51 例，彌漫型 25 例；淋巴管浸潤 38 例，血管浸潤 13 例，淋巴結轉移 48 例；pT 分期：pT1–2 期 28 例，pT3–4 期 48 例；pTNM 分期：Ⅰ期 21 例，Ⅱ期 13 例，Ⅲ期 42 例。所有臨床病理資料均按照中文歐洲腫瘤內科學會（European society for medical onclogy，ESMO）臨床實踐指南[10]進行評估。本研究經筆者所在醫院醫學倫理委員會批準。
1.2 主要材料和設備
主要材料和試劑：兔抗人 HIBADH 多克隆抗體（Abcam 公司，英國）、生物素化羊抗兔（Boster 公司，中國）、ABC 試劑盒（Santa Cruz Biotech- nology 公司，美國）、人 MKN45 胃癌細胞系和人 293T 細胞系（ATCC 細胞庫，美國）、RPMI-1640 培養液（HyClone 公司，美國）、胎牛血清（Gibco 公司，美國）、鼠抗人 Tubulin 單克隆（Sigma-Aldrich 公司，美國）、TRIzol 試劑（Invitrogen 公司，美國）；RevertAidTM cDNA 合成試劑盒（Takara 公司，日本）、SYBR Green 試劑盒（Biotool 公司，美國）、CCK-8 試劑（Dojindo 公司，日本）、脂質體（HanBio 公司，中國）、BCA protein assay kit（碧云天生物科技公司，中國）、transwell 小室（Corning，康寧公司）及 Matrigel 膠（BD Biosciences 公司，美國）。
本實驗采用的儀器主要包括：實時定量 PCR 儀（LightCycler 480II，Roche 公司，瑞士）、免疫印跡電泳轉膜儀（PowerPac，Bio-Rad 公司，美國）、凝膠&化學發光成像系統（Fusion Pulse，Vilber 公司，法國）和分光光度計（SmartSpec Plus，Bio-Rad 公司，美國）。
1.3 免疫組織化學染色方法
胃癌原發灶、癌旁組織及癌轉移淋巴結以 4% 甲醛溶液浸泡后，石蠟包埋長期保存。采用 ABC 法，行 4 μm 厚連續石蠟組織切片，依次脫蠟、梯度乙醇水化及加入 3% 過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，再以 10 mmol/L 檸檬酸緩沖液微波加熱抗原修復，室溫下以 5% 山羊血清封閉 1 h。一抗為兔抗人 HIBADH 單克隆抗體（1∶100），4 ℃ 過夜；二抗為生物素化羊抗兔（1∶1 000），室溫下放置 1 h；再加入 ABC 混合液，室溫下放置半小時，最后以 DAB/H2O2 顯色，蘇木精復染，樹脂封片。所有切片由 2 位病理學專家獨立評分，再求兩者的平均分為最終的得分。根據染色細胞百分數和染色強度綜合評分[11-12]，≥3 分認為 HIBADH 蛋白表達陽性，而分數<3 分認為 HIBADH 蛋白表達陰性。免疫組織化學的染色陽性對照采用 Tubulin 代替 HIBADH 作為一抗，陰性對照以 PBS 溶液作為一抗。
1.4 細胞系及其培養
人 MKN45 胃癌細胞系的培養液為 90% RPMI 1640 和 10% 胎牛血清，孵育在 37 ℃、5% 二氧化碳的培養箱中。人 293T 細胞的培養液為90% DMED 和 10% 胎牛血清。
1.5 RNA 干擾表達載體（siRNA）和慢病毒感染
根據人 HIBADH 基因序列，設計并合成 3 種 HIBADH siRNA 寡核苷酸序列。siRNA-1：正義鏈，5′-CAGUUGGAUUCAUUGGACUTT-3′；siRNA-2：正義鏈，5′-GAAGGGCUCAUUAUUAAUATT-3′；siRNA-3：正義鏈，5′-GCAAAGGGCUACUCAAAGATT-3′。另設計并合成陰性對照 siRNA 序列（陰性對照組）：正義鏈，5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。通過 RT-PCR 和 Western blotting 驗證后，選擇最有效的 siRNA 序列，在此基礎上添加發夾結構（shRNA）。隨后，通過輔助質粒（psPAX2 和 pMD2G）與脂質體共轉染 293T 細胞，制備含有 HIBADH-shRNA 結構的重組慢病毒。轉染 48 h 后，采用超離心（25 000 g，4 ℃，2 h）濃縮病毒，得到高滴度的慢病毒濃縮液。用含 RNA干擾（RNAi）載體的慢病毒上清液轉染 MKN45 細胞 72 h，采用 1 μg/mL 嘌呤霉素篩選，最后獲得 HIBADH 蛋白穩定低表達的 MKN45 細胞系（轉染組）。后續檢測都是基于轉染組、陰性對照組及未轉染任何序列的空白對照組細胞進行。
1.6 實時定量 RT-PCR
采用 TRIzol 試劑提取胃癌細胞中的總 RNA，之后采用 RevertAidTM cDNA 合成試劑盒進行逆轉錄，然后使用 SYBR Green 試劑盒進行RT-PCR。HIBADH 基因的引物序列為 5′-GCTGCACGATCTGGGAACC-3′（上游）和 5′-CTCCACAGTACACCACGTTG-3′（下游）。采用相對定量法比較目的基因 mRNA 的拷貝數差異[13-14]。每個基因的 mRNA 表達水平檢測 3 次。
1.7 Western blotting 法檢測 HIBADH 蛋白的表達
胃癌細胞提取總蛋白后計算蛋白濃度，等體積等量蛋白樣本行 Western blotting 檢測。一抗分別為 HIBADH mAb（1∶2 000）和 Tubulin mAb-辣根過氧化物酶（HRP，1∶5 000）。電泳前蛋白質上樣為等量等體積（30 μg/20 μL）。蛋白條帶半定量分析：目的蛋白表達水平=（目的蛋白條帶密度灰度值×相應面積）/（對應的 GAPDH 蛋白條帶密度灰度值×相應面積）。實驗重復 3 次。
1.8 細胞增殖試驗
取對數期生長細胞，以每孔 1×104個細胞接種于 96 孔板，每組設 6 個復孔，置于 37 ℃、5% 二氧化碳的培養箱中。分別于 0、24、48 和 72 h，加入 10 μL CCK-8 試劑，繼續培養箱孵育 80 min。在酶聯免疫分析儀上測定 450 nm 波長處每孔的吸光度（A）值。以上實驗重復 3 次。
1.9 細胞遷移和侵襲試驗
采用 24-well 8 μm 的 transwell 小室檢測細胞遷移。上室接種含 1×105個胃癌細胞的 200 μL 無血清培養液，下室以含 20% 胎牛血清的培養液作為化學引誘物。細胞侵襲實驗時上室底部涂 Matrigel 膠。培養箱孵育 48 h 后，行結晶紫染色，在顯微鏡下計數上室膜背面上的細胞數。實驗重復 3 次。
1.10 細胞劃痕愈合試驗
6 孔培養板中的細胞融合達 80%～90% 后，用 10 μL 槍頭劃 1 條直線。PBS 洗滌培養皿 3 次以清除細胞碎片，然后改為無血清培養基。在處理后及處理后 48 h，以倒置顯微鏡拍攝 1 次圖像。愈合率=（0 h 劃痕寬度–48 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度[11]。實驗重復 3 次。
1.11 統計學方法
所有分析均使用 SPSS 17.0 軟件進行。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，2 組間比較采用方差分析；計數資料采用成組 χ2 檢驗或配對 χ2 檢驗。生存曲線繪制采用 Kaplan-Meier 法，生存曲線比較采用 log-rank 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HIBADH 蛋白在胃癌原發灶中的表達及其與胃癌臨床病理學特征的關系
HIBADH 蛋白在 76 例胃癌原發灶和癌旁組織中的表達陽性率分別為 65.79%（50/76）和 7.89%（6/76），胃癌原發灶組織中的表達陽性率較高（χ2=54.738，P<0.001），見圖 1a–1c。
圖1
示胃癌原發灶、癌旁組織及轉移淋巴結組織中 HIBADH 蛋白的表達及其與患者預后的關系
a：HIBADH 蛋白在癌旁組織中呈陽性表達（ABC ×100）；b：HIBADH 蛋白在胃癌原發灶組織中呈陰性表達（ABC ×200）；c：HIBADH 蛋白在胃癌原發灶組織中呈陽性表達（ABC ×200）；d：HIBADH 蛋白在轉移淋巴結組織中呈陽性表達（ABC ×200）；e：HIBADH 蛋白表達陽性和陰性患者的生存曲線；f 和 g：空白對照組、陰性對照組、siRNA-1、siRNA-2 及 siRNA-3 組細胞中 HIBADH 蛋白的表達水平（f）及電泳結果（g）；h 和 i：空白對照組、陰性對照組及轉染組細胞中 HIBADH 蛋白的表達水平（h）及電泳結果（i）；j：不同時點陰性對照組及轉染組的
HIBADH 蛋白在胃癌原發灶中的表達和多種腫瘤臨床病理學特征密切相關：HIBADH 蛋白的表達與腫瘤直徑、淋巴管浸潤、pT 分期、淋巴結轉移及 pTNM 分期均相關（P<0.05）。腫瘤直徑≥5 cm 相對于<5 cm 者、淋巴管浸潤相對于未發生淋巴管浸潤者、pT3–4 期相對于 pT1–2 期者、淋巴結轉移相對于未發生淋巴結轉移者、pTNM 分期Ⅱ/Ⅲ期相對于Ⅰ期者，前者的 HIBADH 蛋白表達陽性率更高；而 HIBADH 蛋白的表達與性別、年齡、組織分化程度、Lauren’s 分型及血管浸潤情況均無關（P>0.05）。具體見表 1。
表1
胃癌患者 HIBADH 蛋白的表達與其臨床病理學特征的關系
2.2 轉移淋巴結中 HIBADH 蛋白的表達
本研究進一步對 48 例淋巴結轉移陽性患者的癌轉移淋巴結組織進行免疫組織化學染色后發現，HIBADH 蛋白在癌轉移淋巴結組織中的表達陽性率為 100%（48/48），見圖 1d。這表明，胃癌轉移淋巴結中 HIBADH 蛋白呈高表達。
2.3 HIBADH 蛋白的表達與胃癌患者預后的關系
本組患者的隨訪方式包括住院、門診和電話訪問。本研究于 2017 年 12 月 31 日結束隨訪，隨訪率為 100%，隨訪時間 3～130 個月，中位隨訪時間為 30 個月。在隨訪期間，因胃癌復發轉移死亡 45 例，因其他疾病死亡 16 例。本組患者術后的總體 3 年生存率為 47.5%，5 年生存率為 39.9%，10 年生存率為 35.4%。其中 HIBADH 陽性組和 HIBADH 陰性組患者的術后 10 年生存率分別為 16.4% 和 69.4%。log-rank 結果表明，HIBADH 陰性組患者的預后較 HIBADH 陽性組好（χ2=19.612，P<0.001）。該結果說明，HIBADH 蛋白的表達提示患者預后差（圖 1e）。
2.4 HIBADH 蛋白穩定低表達的胃癌細胞株構建
本研究設計構建了 3 種人 HIBADH 靶向 siRNA 以及 1 種陰性對照組干擾表達載體，并轉染到 MKN45 細胞中。結果陰性對照組和空白對照組的 HIBADH 蛋白的表達水平比較差異無統計學意義，但均高于 siRNA-1、siRNA-2 及 siRNA-3 組（P<0.05）；其中 siRNA-2 組的 HIBADH 蛋白的表達水平最低（P<0.05），見圖 1f–1g。因此，在 siRNA-2 中加入發夾結構，建立穩定的 HIBADH-shRNA MKN45 細胞株（轉染組），結果顯示，轉染組的 HIBADH 蛋白的表達水平低于陰性對照組（P<0.05）。見圖 1h 和1i。
2.5 胃癌細胞增殖能力檢測
本研究采用 CCK-8 法檢測 MKN45 胃癌細胞增殖能力的變化。陰性對照組和轉染組的 A 值隨時點延長均增加；0、24、48 及 72 h 時，同時點 2 組細胞的 A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05），見圖 1j，說明 HIBADH 蛋白表達干擾后對 MKN45 細胞的增殖能力無明顯影響。
2.6 胃癌細胞遷移能力和侵襲能力檢測
本研究先采用 transwell 小室檢測胃癌細胞的遷移能力。培養 48 h 后，陰性對照組的穿膜細胞數高于轉染組，2 組間比較差異具有統計學意義（P<0.001）。隨后，在上室鋪上 Matrigel 膠，以檢測胃癌細胞的侵襲能力。同樣培養 48 h 后，發現陰性對照組的穿膜細胞數也高于轉染組，差異有統計學意義（P<0.001）。這些實驗結果說明，HIBADH 蛋白表達干擾后 MKN45 細胞的遷移和侵襲能力均下降。具體見圖 1k–1p。
為了進一步驗證 HIBADH 蛋白表達對 MKN45 細胞遷移能力的影響，本研究采用了細胞劃痕試驗。劃痕形成后，無血清培養 48 h 時陰性對照組的劃痕愈合率高于轉染組，差異有統計學意義（P<0.005），見圖 2。
圖2
示陰性對照組和轉染組的劃痕實驗結果
a 和 b：0 h 時陰性對照組（a）和轉染組（b）的劃痕照片；c 和 d：48 h 時陰性對照組（d）和轉染組（d）的劃痕照片；e：陰性對照組和轉染組的劃痕愈合率結果，與陰性對照組比較，*
3 討論
β-羥酸脫氫酶超家族介導 β-羥酸底物中羥基的 1 個氫原子的去除，包括 HIBADH 和 6-葡萄糖酸磷酸脫氫酶（PGDH）[15]。PGDH 基團為包含 460～490 個氨基酸殘基的長鏈結構，通過催化氧化脫羧反應形成一個明確的底物—6-磷酸葡萄糖酸鹽[16-17]。HIBADH 蛋白家族則較短，約 300 個殘基，包括 HIBADH、3-羥丙酸脫氫酶、2-（羥甲基）戊二酸脫氫酶、琥珀酸半醛還原酶、蘇氨酸脫氫酶和絲氨酸脫氫酶[18-20]，它們各自對底物具有高度的特異性。在原核細胞和真核細胞中 HIBADH 蛋白都是不可或缺的酶，參與多種代謝途徑，如氨基酸分解代謝、糖異生作用和煙酸發酵[18-19]。
HIBADH 基因在不同的哺乳動物之間高度保守。人類 HIBADH 肽序列與牛 HIBADH 蛋白的同源性為 96.13%[6, 21]。HIBADH 分子廣泛表達在人的小腦、心臟、骨骼肌、子宮、胎盤、睪丸和精子中[19]。目前認為，HIBADH 蛋白是精子線粒體中的 ATP 生產相關蛋白。據報道[22]，在人類精子生成過程中，HIBADH 蛋白高度表達于精子的各個時期，且主要聚集在富含線粒體的精子頸部和中部。
近年來報道[9]，使用沙蟾蜍精處理宮頸癌 Hela 細胞后，HIBADH 蛋白的表達量明顯下降，提示 HIBADH 蛋白可能在腫瘤細胞中產生作用。然而，上述研究[9]只報道，HIBADH 作為一種代謝相關酶在實驗中被觀察到表達水平升高，并沒有對其具體作用和機制進行分析。當前，代謝異常和腫瘤發生的相關性是研究的熱點[23]，同樣也是胃癌研究領域的熱點[24-25]。HIBADH 蛋白作為一種代謝相關酶，在沙蟾蜍精這類潛在抗癌藥物的作用下，表達量發生明顯變化。HIBADH 蛋白是否在腫瘤的發生發展中具有重要作用？或者僅是腫瘤細胞在藥物刺激后的應答反應？這引起了筆者團隊的關注。故筆者團隊探索了 HIBADH 蛋白表達和胃癌的相關性及其分子機制。
本研究結果表明，HIBADH 蛋白在胃癌原發灶中的表達明顯上調，并且與腫瘤直徑、淋巴管浸潤、pT 分期、淋巴結轉移和 pTNM 分期密切相關；生存分析結果顯示，HIBADH 蛋白表達患者的生存時間較未表達患者短。隨后筆者團隊構建了穩定的 HIBADH 敲低表達的 MKN45 胃癌細胞系，研究發現，干擾 HIBADH 蛋白的表達可降低 MKN45 細胞的遷移、侵襲和傷口愈合能力，提示 HIBADH 蛋白可能和胃癌細胞的運動能力有關，但它的具體分子機制有待進一步研究。
胃癌是當今世界第 5 大最常見的惡性腫瘤，也是導致癌癥相關死亡的第 3 大原因[1]。在中國，胃癌相關死亡則攀升至第 2 位。根據大數據統計分析，2015 年我國胃癌新發病例為 67.91 萬例，胃癌相關死亡人數為 49.8 萬人[1]。男性更易罹患胃癌[1]。胃癌侵襲轉移能力強是導致預后不良的主要原因。越來越多的研究試圖解釋胃癌發生發展的機制，但至今仍未取得突破性進展，仍未找到有效的治療靶點[2-3]。因此，尋找胃癌特異性標志物是關系到人類健康的一個重要問題，迫在眉睫。3-羥異丁酸脫氫酶（3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase，HIBADH）是一種代謝相關蛋白，是糖異生過程中葡萄糖異丁酸生成途徑的一種關鍵酶[4]。HIBADH 蛋白參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解，是纈氨酸分解代謝途徑的中心代謝酶[5]。HIBADH 蛋白的底物是 3-羥基-2-甲基-丙酸酯和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，3 種代謝產物分別為 2-甲基三乙氧基泛酸鹽、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和 H+。HIBADH 蛋白主要在各種組織和細胞的線粒體中表達[6]。多項研究[7-8]通過蛋白質組學方法分析發現，HIBADH 蛋白是一種與細胞運動相關的蛋白。據報道[9]，使用沙蟾蜍精處理宮頸癌 Hela 細胞后，HIBADH 蛋白的表達量明顯下降，提示 HIBADH 蛋白可能在腫瘤細胞中發揮作用，但具體作用和機制尚不清楚。本研究擬進一步研究以明確 HIBADH 蛋白表達和胃癌的關系。
1 資料和方法
1.1 研究對象
納入標準：行胃癌根治術；隨訪資料保存完整；原發灶和癌旁組織石蠟標本保存完整。排除標準：中途失訪，隨訪數據不完整；殘胃癌患者。回顧性收集 2006 年 1 月至 2007 年 12 月期間上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院普外科收治的 76 例胃腺癌患者，收集患者的胃癌原發灶和癌旁組織（距離腫瘤以遠 5 cm）的石蠟標本。76 例患者中，男 48 例，女 28 例；中位年齡為 64 歲（30～81 歲），其中≥60 歲者 52 例。所有患者接受胃癌根治術，且術前均未接受化療或放療。其中行全胃切除 9 例，行遠端胃切除 57 例，行近端胃切除 10 例。2 例患者行 D1 淋巴結清掃術，68 例患者行 D2 淋巴結清掃術，6 例患者行 D3 淋巴結清掃術。腫瘤直徑為 0.4～10.0 cm、（5.08±2.66）cm，其中≥5 cm 者 38 例。術后病理檢查：早期腺癌 13 例，BorrmannⅠ型 3 例，Borrmann Ⅱ型 10 例，Borrmann Ⅲ型 41 例，Borrmann Ⅳ型 9 例；組織分化程度：高分化 14 例，中分化 6 例，低分化 56 例；Lauren’s 分型：腸型 51 例，彌漫型 25 例；淋巴管浸潤 38 例，血管浸潤 13 例，淋巴結轉移 48 例；pT 分期：pT1–2 期 28 例，pT3–4 期 48 例；pTNM 分期：Ⅰ期 21 例，Ⅱ期 13 例，Ⅲ期 42 例。所有臨床病理資料均按照中文歐洲腫瘤內科學會（European society for medical onclogy，ESMO）臨床實踐指南[10]進行評估。本研究經筆者所在醫院醫學倫理委員會批準。
1.2 主要材料和設備
主要材料和試劑：兔抗人 HIBADH 多克隆抗體（Abcam 公司，英國）、生物素化羊抗兔（Boster 公司，中國）、ABC 試劑盒（Santa Cruz Biotech- nology 公司，美國）、人 MKN45 胃癌細胞系和人 293T 細胞系（ATCC 細胞庫，美國）、RPMI-1640 培養液（HyClone 公司，美國）、胎牛血清（Gibco 公司，美國）、鼠抗人 Tubulin 單克隆（Sigma-Aldrich 公司，美國）、TRIzol 試劑（Invitrogen 公司，美國）；RevertAidTM cDNA 合成試劑盒（Takara 公司，日本）、SYBR Green 試劑盒（Biotool 公司，美國）、CCK-8 試劑（Dojindo 公司，日本）、脂質體（HanBio 公司，中國）、BCA protein assay kit（碧云天生物科技公司，中國）、transwell 小室（Corning，康寧公司）及 Matrigel 膠（BD Biosciences 公司，美國）。
本實驗采用的儀器主要包括：實時定量 PCR 儀（LightCycler 480II，Roche 公司，瑞士）、免疫印跡電泳轉膜儀（PowerPac，Bio-Rad 公司，美國）、凝膠&化學發光成像系統（Fusion Pulse，Vilber 公司，法國）和分光光度計（SmartSpec Plus，Bio-Rad 公司，美國）。
1.3 免疫組織化學染色方法
胃癌原發灶、癌旁組織及癌轉移淋巴結以 4% 甲醛溶液浸泡后，石蠟包埋長期保存。采用 ABC 法，行 4 μm 厚連續石蠟組織切片，依次脫蠟、梯度乙醇水化及加入 3% 過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，再以 10 mmol/L 檸檬酸緩沖液微波加熱抗原修復，室溫下以 5% 山羊血清封閉 1 h。一抗為兔抗人 HIBADH 單克隆抗體（1∶100），4 ℃ 過夜；二抗為生物素化羊抗兔（1∶1 000），室溫下放置 1 h；再加入 ABC 混合液，室溫下放置半小時，最后以 DAB/H2O2 顯色，蘇木精復染，樹脂封片。所有切片由 2 位病理學專家獨立評分，再求兩者的平均分為最終的得分。根據染色細胞百分數和染色強度綜合評分[11-12]，≥3 分認為 HIBADH 蛋白表達陽性，而分數<3 分認為 HIBADH 蛋白表達陰性。免疫組織化學的染色陽性對照采用 Tubulin 代替 HIBADH 作為一抗，陰性對照以 PBS 溶液作為一抗。
1.4 細胞系及其培養
人 MKN45 胃癌細胞系的培養液為 90% RPMI 1640 和 10% 胎牛血清，孵育在 37 ℃、5% 二氧化碳的培養箱中。人 293T 細胞的培養液為90% DMED 和 10% 胎牛血清。
1.5 RNA 干擾表達載體（siRNA）和慢病毒感染
根據人 HIBADH 基因序列，設計并合成 3 種 HIBADH siRNA 寡核苷酸序列。siRNA-1：正義鏈，5′-CAGUUGGAUUCAUUGGACUTT-3′；siRNA-2：正義鏈，5′-GAAGGGCUCAUUAUUAAUATT-3′；siRNA-3：正義鏈，5′-GCAAAGGGCUACUCAAAGATT-3′。另設計并合成陰性對照 siRNA 序列（陰性對照組）：正義鏈，5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。通過 RT-PCR 和 Western blotting 驗證后，選擇最有效的 siRNA 序列，在此基礎上添加發夾結構（shRNA）。隨后，通過輔助質粒（psPAX2 和 pMD2G）與脂質體共轉染 293T 細胞，制備含有 HIBADH-shRNA 結構的重組慢病毒。轉染 48 h 后，采用超離心（25 000 g，4 ℃，2 h）濃縮病毒，得到高滴度的慢病毒濃縮液。用含 RNA干擾（RNAi）載體的慢病毒上清液轉染 MKN45 細胞 72 h，采用 1 μg/mL 嘌呤霉素篩選，最后獲得 HIBADH 蛋白穩定低表達的 MKN45 細胞系（轉染組）。后續檢測都是基于轉染組、陰性對照組及未轉染任何序列的空白對照組細胞進行。
1.6 實時定量 RT-PCR
采用 TRIzol 試劑提取胃癌細胞中的總 RNA，之后采用 RevertAidTM cDNA 合成試劑盒進行逆轉錄，然后使用 SYBR Green 試劑盒進行RT-PCR。HIBADH 基因的引物序列為 5′-GCTGCACGATCTGGGAACC-3′（上游）和 5′-CTCCACAGTACACCACGTTG-3′（下游）。采用相對定量法比較目的基因 mRNA 的拷貝數差異[13-14]。每個基因的 mRNA 表達水平檢測 3 次。
1.7 Western blotting 法檢測 HIBADH 蛋白的表達
胃癌細胞提取總蛋白后計算蛋白濃度，等體積等量蛋白樣本行 Western blotting 檢測。一抗分別為 HIBADH mAb（1∶2 000）和 Tubulin mAb-辣根過氧化物酶（HRP，1∶5 000）。電泳前蛋白質上樣為等量等體積（30 μg/20 μL）。蛋白條帶半定量分析：目的蛋白表達水平=（目的蛋白條帶密度灰度值×相應面積）/（對應的 GAPDH 蛋白條帶密度灰度值×相應面積）。實驗重復 3 次。
1.8 細胞增殖試驗
取對數期生長細胞，以每孔 1×104個細胞接種于 96 孔板，每組設 6 個復孔，置于 37 ℃、5% 二氧化碳的培養箱中。分別于 0、24、48 和 72 h，加入 10 μL CCK-8 試劑，繼續培養箱孵育 80 min。在酶聯免疫分析儀上測定 450 nm 波長處每孔的吸光度（A）值。以上實驗重復 3 次。
1.9 細胞遷移和侵襲試驗
采用 24-well 8 μm 的 transwell 小室檢測細胞遷移。上室接種含 1×105個胃癌細胞的 200 μL 無血清培養液，下室以含 20% 胎牛血清的培養液作為化學引誘物。細胞侵襲實驗時上室底部涂 Matrigel 膠。培養箱孵育 48 h 后，行結晶紫染色，在顯微鏡下計數上室膜背面上的細胞數。實驗重復 3 次。
1.10 細胞劃痕愈合試驗
6 孔培養板中的細胞融合達 80%～90% 后，用 10 μL 槍頭劃 1 條直線。PBS 洗滌培養皿 3 次以清除細胞碎片，然后改為無血清培養基。在處理后及處理后 48 h，以倒置顯微鏡拍攝 1 次圖像。愈合率=（0 h 劃痕寬度–48 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度[11]。實驗重復 3 次。
1.11 統計學方法
所有分析均使用 SPSS 17.0 軟件進行。計量資料以均數±標準差（±s）表示，2 組間比較采用方差分析；計數資料采用成組 χ2 檢驗或配對 χ2 檢驗。生存曲線繪制采用 Kaplan-Meier 法，生存曲線比較采用 log-rank 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HIBADH 蛋白在胃癌原發灶中的表達及其與胃癌臨床病理學特征的關系
HIBADH 蛋白在 76 例胃癌原發灶和癌旁組織中的表達陽性率分別為 65.79%（50/76）和 7.89%（6/76），胃癌原發灶組織中的表達陽性率較高（χ2=54.738，P<0.001），見圖 1a–1c。
圖1
示胃癌原發灶、癌旁組織及轉移淋巴結組織中 HIBADH 蛋白的表達及其與患者預后的關系
a：HIBADH 蛋白在癌旁組織中呈陽性表達（ABC ×100）；b：HIBADH 蛋白在胃癌原發灶組織中呈陰性表達（ABC ×200）；c：HIBADH 蛋白在胃癌原發灶組織中呈陽性表達（ABC ×200）；d：HIBADH 蛋白在轉移淋巴結組織中呈陽性表達（ABC ×200）；e：HIBADH 蛋白表達陽性和陰性患者的生存曲線；f 和 g：空白對照組、陰性對照組、siRNA-1、siRNA-2 及 siRNA-3 組細胞中 HIBADH 蛋白的表達水平（f）及電泳結果（g）；h 和 i：空白對照組、陰性對照組及轉染組細胞中 HIBADH 蛋白的表達水平（h）及電泳結果（i）；j：不同時點陰性對照組及轉染組的
HIBADH 蛋白在胃癌原發灶中的表達和多種腫瘤臨床病理學特征密切相關：HIBADH 蛋白的表達與腫瘤直徑、淋巴管浸潤、pT 分期、淋巴結轉移及 pTNM 分期均相關（P<0.05）。腫瘤直徑≥5 cm 相對于<5 cm 者、淋巴管浸潤相對于未發生淋巴管浸潤者、pT3–4 期相對于 pT1–2 期者、淋巴結轉移相對于未發生淋巴結轉移者、pTNM 分期Ⅱ/Ⅲ期相對于Ⅰ期者，前者的 HIBADH 蛋白表達陽性率更高；而 HIBADH 蛋白的表達與性別、年齡、組織分化程度、Lauren’s 分型及血管浸潤情況均無關（P>0.05）。具體見表 1。
表1
胃癌患者 HIBADH 蛋白的表達與其臨床病理學特征的關系
2.2 轉移淋巴結中 HIBADH 蛋白的表達
本研究進一步對 48 例淋巴結轉移陽性患者的癌轉移淋巴結組織進行免疫組織化學染色后發現，HIBADH 蛋白在癌轉移淋巴結組織中的表達陽性率為 100%（48/48），見圖 1d。這表明，胃癌轉移淋巴結中 HIBADH 蛋白呈高表達。
2.3 HIBADH 蛋白的表達與胃癌患者預后的關系
本組患者的隨訪方式包括住院、門診和電話訪問。本研究于 2017 年 12 月 31 日結束隨訪，隨訪率為 100%，隨訪時間 3～130 個月，中位隨訪時間為 30 個月。在隨訪期間，因胃癌復發轉移死亡 45 例，因其他疾病死亡 16 例。本組患者術后的總體 3 年生存率為 47.5%，5 年生存率為 39.9%，10 年生存率為 35.4%。其中 HIBADH 陽性組和 HIBADH 陰性組患者的術后 10 年生存率分別為 16.4% 和 69.4%。log-rank 結果表明，HIBADH 陰性組患者的預后較 HIBADH 陽性組好（χ2=19.612，P<0.001）。該結果說明，HIBADH 蛋白的表達提示患者預后差（圖 1e）。
2.4 HIBADH 蛋白穩定低表達的胃癌細胞株構建
本研究設計構建了 3 種人 HIBADH 靶向 siRNA 以及 1 種陰性對照組干擾表達載體，并轉染到 MKN45 細胞中。結果陰性對照組和空白對照組的 HIBADH 蛋白的表達水平比較差異無統計學意義，但均高于 siRNA-1、siRNA-2 及 siRNA-3 組（P<0.05）；其中 siRNA-2 組的 HIBADH 蛋白的表達水平最低（P<0.05），見圖 1f–1g。因此，在 siRNA-2 中加入發夾結構，建立穩定的 HIBADH-shRNA MKN45 細胞株（轉染組），結果顯示，轉染組的 HIBADH 蛋白的表達水平低于陰性對照組（P<0.05）。見圖 1h 和1i。
2.5 胃癌細胞增殖能力檢測
本研究采用 CCK-8 法檢測 MKN45 胃癌細胞增殖能力的變化。陰性對照組和轉染組的 A 值隨時點延長均增加；0、24、48 及 72 h 時，同時點 2 組細胞的 A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05），見圖 1j，說明 HIBADH 蛋白表達干擾后對 MKN45 細胞的增殖能力無明顯影響。
2.6 胃癌細胞遷移能力和侵襲能力檢測
本研究先采用 transwell 小室檢測胃癌細胞的遷移能力。培養 48 h 后，陰性對照組的穿膜細胞數高于轉染組，2 組間比較差異具有統計學意義（P<0.001）。隨后，在上室鋪上 Matrigel 膠，以檢測胃癌細胞的侵襲能力。同樣培養 48 h 后，發現陰性對照組的穿膜細胞數也高于轉染組，差異有統計學意義（P<0.001）。這些實驗結果說明，HIBADH 蛋白表達干擾后 MKN45 細胞的遷移和侵襲能力均下降。具體見圖 1k–1p。
為了進一步驗證 HIBADH 蛋白表達對 MKN45 細胞遷移能力的影響，本研究采用了細胞劃痕試驗。劃痕形成后，無血清培養 48 h 時陰性對照組的劃痕愈合率高于轉染組，差異有統計學意義（P<0.005），見圖 2。
圖2
示陰性對照組和轉染組的劃痕實驗結果
a 和 b：0 h 時陰性對照組（a）和轉染組（b）的劃痕照片；c 和 d：48 h 時陰性對照組（d）和轉染組（d）的劃痕照片；e：陰性對照組和轉染組的劃痕愈合率結果，與陰性對照組比較，*
3 討論
β-羥酸脫氫酶超家族介導 β-羥酸底物中羥基的 1 個氫原子的去除，包括 HIBADH 和 6-葡萄糖酸磷酸脫氫酶（PGDH）[15]。PGDH 基團為包含 460～490 個氨基酸殘基的長鏈結構，通過催化氧化脫羧反應形成一個明確的底物—6-磷酸葡萄糖酸鹽[16-17]。HIBADH 蛋白家族則較短，約 300 個殘基，包括 HIBADH、3-羥丙酸脫氫酶、2-（羥甲基）戊二酸脫氫酶、琥珀酸半醛還原酶、蘇氨酸脫氫酶和絲氨酸脫氫酶[18-20]，它們各自對底物具有高度的特異性。在原核細胞和真核細胞中 HIBADH 蛋白都是不可或缺的酶，參與多種代謝途徑，如氨基酸分解代謝、糖異生作用和煙酸發酵[18-19]。
HIBADH 基因在不同的哺乳動物之間高度保守。人類 HIBADH 肽序列與牛 HIBADH 蛋白的同源性為 96.13%[6, 21]。HIBADH 分子廣泛表達在人的小腦、心臟、骨骼肌、子宮、胎盤、睪丸和精子中[19]。目前認為，HIBADH 蛋白是精子線粒體中的 ATP 生產相關蛋白。據報道[22]，在人類精子生成過程中，HIBADH 蛋白高度表達于精子的各個時期，且主要聚集在富含線粒體的精子頸部和中部。
近年來報道[9]，使用沙蟾蜍精處理宮頸癌 Hela 細胞后，HIBADH 蛋白的表達量明顯下降，提示 HIBADH 蛋白可能在腫瘤細胞中產生作用。然而，上述研究[9]只報道，HIBADH 作為一種代謝相關酶在實驗中被觀察到表達水平升高，并沒有對其具體作用和機制進行分析。當前，代謝異常和腫瘤發生的相關性是研究的熱點[23]，同樣也是胃癌研究領域的熱點[24-25]。HIBADH 蛋白作為一種代謝相關酶，在沙蟾蜍精這類潛在抗癌藥物的作用下，表達量發生明顯變化。HIBADH 蛋白是否在腫瘤的發生發展中具有重要作用？或者僅是腫瘤細胞在藥物刺激后的應答反應？這引起了筆者團隊的關注。故筆者團隊探索了 HIBADH 蛋白表達和胃癌的相關性及其分子機制。
本研究結果表明，HIBADH 蛋白在胃癌原發灶中的表達明顯上調，并且與腫瘤直徑、淋巴管浸潤、pT 分期、淋巴結轉移和 pTNM 分期密切相關；生存分析結果顯示，HIBADH 蛋白表達患者的生存時間較未表達患者短。隨后筆者團隊構建了穩定的 HIBADH 敲低表達的 MKN45 胃癌細胞系，研究發現，干擾 HIBADH 蛋白的表達可降低 MKN45 細胞的遷移、侵襲和傷口愈合能力，提示 HIBADH 蛋白可能和胃癌細胞的運動能力有關，但它的具體分子機制有待進一步研究。
