引用本文： 張恬瑩, 蘭濤, 魏玲玲, 馮天航, 黃孝倫. 甲基化在肝纖維化過程中的作用及其機制的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(2): 229-235. doi: 10.7507/1007-9424.201808090 復制
肝纖維化是由于肝臟慢性損傷而引起的細胞外基質過度積累和瘢痕形成，其病理表現為再生肝細胞結節形成。肝纖維化會進一步發展為肝硬變，而肝硬變又會進展成肝功能衰竭和肝癌[1]。由于大多數人類疾病是由環境因素和遺傳因素相互作用造成的，肝纖維化過程中也同樣存在環境因素與遺傳因素共同作用，DNA 和組蛋白修飾、非編碼 RNA 的表觀遺傳機制導致基因的遺傳沉默等在其發病機制中起關鍵作用[2]。肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）是造成肝纖維性化的關鍵細胞，并且其主要由 DNA 和組蛋白甲基化參與調節，在肝纖維化發生過程中的關鍵事件是 HSCs 被激活后存儲維生素 A 的竇周細胞轉化為促纖維化的肌成纖維細胞。筆者現就肝纖維化的發病機制以及近些年來肝纖維化相關的重要 DNA 甲基化和組蛋白甲基化改變及其機制的一些研究進展作一簡要介紹。
1 肝纖維化的機制
肝纖維化是慢性損傷的過程，主要由慢性肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病、膽汁淤積、代謝性疾病等引起[3-5]。肝纖維化進一步發展成肝硬變，肝硬變是肝癌極其重要的危險因素，20%～30% 的肝硬變患者會進展為肝細胞癌[6-7]。
肝纖維化的發病機制主要依賴于以下 3 方面的因素：① 肝損傷后，釋放大量炎性因子如白細胞介素 6、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、結締組織生長因子、血小板源性生長因子等負責招募炎性細胞。② HSCs、巨噬細胞、門靜脈周圍及骨髓源性的成纖維細胞和纖維細胞、凋亡的肝細胞、肝內定居的 Kupffer 細胞等分泌細胞外基質如Ⅰ型膠原蛋白、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）并刺激肝細胞再生，以對損傷的肝組織進行修復[8-9]，其中 HSCs 處于中心地位，超過 80% 的分泌細胞外基質的肌成纖維細胞均來源于 HSCs[10-11]。③ HSCs 在產生細胞外基質的同時分泌對細胞外基質進行降解的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）一族如 MMP-13 及 MMP 抑制因子組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of MMP，TIMPs），以調控細胞外基質的分泌量，從而維持動態平衡，肝纖維化的形成正是這種動態平衡的失調[12]。
當前普遍認為，肝纖維化是可逆轉的，而進展為肝硬化或惡變為肝癌后則不可逆轉。
2 DNA 甲基化在肝纖維化中的作用
2.1 DNA 甲基化
DNA 甲基化是研究最早的一種表觀遺傳學修飾方式，其是在 DNA 復制完成后的一種酶促反應。在 DNA 甲基化的過程中，DNA 通過在 CpG 的 5′位置加入甲基形成 5-甲基胞嘧啶（5-mC），而 TET 蛋白又可以催化 5-mC 轉化為 5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）。
催化甲基轉移的 DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）分為 DNMT1、DNMT2 和 DNMT3a/3b，其中 DNMT1 是一種維持性甲基化酶，在細胞分裂過程中識別新 DNA 鏈上的半甲基化位點并再生出甲基化狀態；DNMT2 可與 DNA 上特異位點結合，但具體作用尚不清楚；DNMT3a 和 DNMT3b 是重新甲基化酶，它們使去甲基化的 CpG 位點重新甲基化，即參與 DNA 的從頭甲基化[13]。而 TET 蛋白主要起去甲基化作用，但對其機制的研究尚不明確[2]。
甲基-CpG 結合蛋白 2（methyl-CpG binding protein 2，MeCP2）在 HSCs 的活化和轉化過程中起著重要的作用，其在肝纖維化中過度表達，與甲基化 DNA 特異性結合，抑制其下游靶基因的轉錄；過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）也受 MeCP2 表達的影響，通過沉默 MeCP2 表達會導致 PPARγ 表達減少[14]。
2.2 DNA 甲基化基因與肝纖維化
2.2.1 同源性磷酸酶張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome，PTEN）
PTEN 是磷酸酶基因，使用磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯即磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的產物作為其生理底物[15]。PI3K/AKT 和 ERK 信號通路是 PTEN 通過其脂質磷酸酶活性作用的途徑之一，該信號通路激活會導致 HSCs 活化，在該過程中涉及許多細胞因子和生長因子如 TGF-β1。TGF-β1 被認為是促使 HSCs 向肌成纖維細胞轉化、增加 α-SMA 等活化標志物的表達以及上調膠原蛋白表達的最重要的中介物，若將 HSCs 暴露于 TGF-β1 時會激活 PI3K/AKT 和 ERK 途徑[16]，通過抑制 PI3K 活性和 ERK 磷酸化將阻斷活化的 HSCs 的細胞增殖和Ⅰ型膠原蛋白表達。在某些情況下 PTEN 能夠通過其蛋白酪氨酸磷酸酶活性抑制 ERK 信號傳導途徑，從而負面調節細胞增殖、黏著斑和細胞遷移[17]。PTEN 功能的喪失可能導致磷脂酰肌醇 3，4，5-三磷酸酯的積累，繼而增強 AKT 和 ERK 活性，導致細胞凋亡減少和（或）增加有絲分裂原信號傳導，而高甲基化是 PTEN 失活的機制之一，已經在許多惡性腫瘤中得到證實，如 Tao 等[18]和 Takashima 等[19]已經證明 DNMTs 抑制劑 5-氮雜-2′-脫氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-azadC）通過抑制 DNMT 和 AKT/ERK 通路的激活，從而抑制 HSCs 活化，使 PTEN 基因啟動子甲基化并恢復 PTEN 基因表達；Bian 等[20]證實，在纖維化的肝臟中 PTEN 表達下調，并最終導致 HSCs 中 ERK 與 AKT 細胞通路被激活，TGF-β1 分泌增多，誘導 HSCs 激活、Ⅰ型膠原蛋白和 α-SMA 分泌增多，從而導致肝纖維化的發生。以上研究結果提示，PTEN 基因在肝纖維化過程中高甲基化，PI3K/AKT 和 ERK 信號通路被激化，從而導致 HSCs 進一步活化。
2.2.2 septin 9（SEPT9）
現在人類已經發現了 13 個 septin 家族成員，編碼的蛋白質相對分子質量為 40×103～60×103[21-22]，其中的 SEPT9 是高度保守的 septin 蛋白家族的成員之一，屬于 GTP 酶超級家族，是 GTP 結合蛋白，這些 GTP 酶蛋白參與細胞質分裂、細胞內物質轉運、細胞周期調控以及細胞凋亡。SEPT9 有 219 kb，可被剪切成多種形式而被熟知。在 SEPT9 的 3′和 5′末端可選擇性剪接，5′端可產生 6 種不同的信使 RNA 變異剪接體即 SEPT9_v1、SEPT9_v2、SEPT9_v3、SEPT9_v4、SEPT9_v4*和 SEPT9_v5，3′端也可產生 3 種不同的信使 RNA 即 SV1、SV2 和 SV3[23]。目前研究[24]證實，SEPT9_v1 被發現在許多腫瘤中過表達，包括卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌，而其在這些器官的正常組織中幾乎檢測不到。SEPT9_v4 和 SEPT9_v4*編碼相同的多肽片段，但證實只有 SEPT9_v4*多肽鏈參與腫瘤發生[25-26]。Septin 相關基因對腫瘤的促癌作用存在爭議，不同腫瘤細胞中 SEPT9_v3 的表達水平差異較大，隨后的研究證明了 SEPT9_v3 表達的多樣性是由于其在惡性腫瘤中的不同 DNA 甲基化狀態決定的[27]。近年來，一些基礎和臨床研究已經提供了人類疾病中 SEPT9 超甲基化狀態的證據，如惡性胸腔積液[28]、非侵襲性肺癌[29]、食管鱗狀細胞癌[30]、膽管癌[31]、糖尿病[32]。現在也開發了 SEPT9 甲基化測定法應用于血漿，外周血中甲基化的 SEPT9 被驗證作為結直腸癌的敏感生物標志物[33-34]，目前可用于歐洲結直腸癌的血基篩查試驗中的臨床診斷[35]。Wu 等[36]證明在 HSCs 中的 SEPT9 在體內和體外都是超甲基化，SEPT9 的甲基化由 DNMT3a 調節，SEPT9 通過降低 TGF-β1 表達，使肌成纖維細胞中標志物 α-SMA 和Ⅰ型膠原蛋白的表達相應減少，SEPT9 的表達增加可以減輕體外肝纖維化。以上研究結果提示，SEPT9 在正常肝組織中表達，在肝纖維化中超甲基化，可通過減少 TGF-β1 使肝纖維化標志物減少。
2.2.3 patched-1（Ptch1）
Ptch1 蛋白是信號通路的一個組成部分，在控制細胞分化和增殖中發揮重要作用[37-38]。hedgehog（Hh）信號通路在細胞生長分化、動物胚胎發育過程中都起關鍵作用，且與組織內穩態以及成人器官的腫瘤發生、腫瘤細胞的增殖分化、細胞凋亡、侵襲轉移關系密切。Hh 信號通路主要由 Hh 配體蛋白 sonic hedgehog（Shh）、indian hedgehog（Ihh）、desert hedgehog（Dhh）、兩個跨膜蛋白受體 patched（Ptch）和 Smoothened（Smo）及下游轉錄因子神經膠質瘤相關癌基因同源蛋白（glioma-associated oncogene homolog，GLI）組成。Hh 信號通路各組成部分的突變或異常激活會導致發育缺陷或腫瘤[39]。當 Hh 蛋白不存在時，Ptch1 可抑制 Smo 的活性，下游基因的轉錄表達受到抑制。當 Hh 蛋白與 Ptch1 結合時，Ptch1 對 Smo 的抑制作用被解除，Smo 被激活，進入胞質，將信號下傳，激活轉錄因子（GLI1、GLI2、GLI3），GLI 進入細胞核，直接啟動 Ptch、Wnt、表皮生長因子等目的基因的表達[40]。Choi 等[41]報道了 Hh 途徑活化會導致 HSCs 激活；Yang 等[42]報道了 Ptch1 在肝纖維化中高甲基化，Pcth1 通過影響 GLI1 和 Smad3 信號機制影響 HSCs 活化。Smad3 和 GLI1 會促進 TGF-β1分泌，Ⅰ型膠原蛋白和 α-SMA 分泌增多。以上研究結果提示，Hh 信號通路與 HSCs 的活化相關，在肝纖維化過程中該通路激化，Ptch1 與 Hh 配體蛋白結合，最終導致 GLI1 進入細胞核，促進 TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白和 α-SMA 分泌增多。
2.2.4 Smad
Smad 蛋白是一類轉錄協調子，必須與其他 DNA 結合蛋白相互作用才能調節靶基因的轉錄，其分屬于 3 類：第 1 類是膜受體激活的 Smad，有 MARK 磷酸化位點（包括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 及 Smad8 亞型）；第 2 類是通用的 Smad（目前只有 Smad4）；第 3 類可稱為抑制性 Smad（包括 Smad6、Smad7）。它們是 TGF-β 信號傳導途徑中的抑制因子，C 端功能區缺乏磷酸。HSCs 的活化是一個級聯反應過程[43]，體現在兩方面：① 在 TGF-β/Smad 通路中，TGF-β 是啟動因子。TGF-β/活動素連續激活 TGF-β 超家族受體 Ⅰ、Ⅱ，TGF-β 超家族受體Ⅰ使細胞內質-核信號分子 Smad2/3 磷酸化，導致這些蛋白質活化并轉移到細胞核[22]。Smad7 可抑制 Smad2 和 Smad3 受體調節的磷酸化作用，它們主要通過競爭性地與 TGF-β 超家族受體Ⅰ結合而抑制受體激活膜受體激活的 Smad 的磷酸化作用；Smad7 沉默可以來自表觀遺傳修飾，包括 DNA甲基化、組蛋白修飾或 microRNA[44-45]。② TGF-β 通過誘導 HSCs 合成 TIMPs 而抑制 MMPs 的表達和活性，從而抑制細胞外基質的降解。TGF-β/Smad 通路中為疾病治療提供了作用點。Yang 等[42]的研究結果揭示了 Ptch1 在肝纖維化中為高表達，其在 Smad3 信號傳導中起抑制作用。Latella 等[46]通過使用 Smad3 敲除小鼠進行的研究證明，所述 Smad3 敲除小鼠被保護免受二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化。Bian 等[47]證明通過抑制 DNMT1 抑制了 TGF-β1，從而減少了 Smad2 和 Smad3 的磷酸化，也導致了 Smad7 表達的增加。在肝纖維化中 Smad7 處于高甲基化，TGF-β/Smad 通路中 Smad2 和 Smad3 磷酸化，導致 TGF-β1 表達增加，合成 TIMPs 而抑制 MMPs 的表達和活性。以上研究結果提示，Smad2 和 Smad3 促進肝纖維化，Smad7 可抑制肝纖維化發生，但在肝纖維化過程中 Smad7 處于高甲基化，TGF-β/Smad 通路中 Smad2 和 Smad3 磷酸化，導致 HSCs 的激活。
2.2.5 分泌型焦磷酸蛋白 1（secreted phosphoprotein 1，Spp 1）
Spp1 是一種具有多種功能的分泌型酸性糖蛋白，其可由許多細胞如微血管內皮細胞、成纖維細胞、炎癥細胞、肌細胞產生[48]。Spp1 具有多種生物學功能，包括細胞黏附、信號轉導等[49]。Spp1 主要參與以下 3 條通路：① Spp1 可通過整合素調節核因子-κB 通路中激酶的磷酸化作用，導致 IκB 的磷酸化[50-51]。② Spp1 與 CD44 結合可以通過 PI3K/AKT 通路的激活促進細胞存活，PI3K/AKT 通路可增加 Spp1 的表達，一項基因譜的研究[52]結果表明，Spp1 是 PI3K/AKT 通路的下游效應器并可被 PTEN 所拮抗。③ 細胞內 Spp1 與髓樣分化因子 88 和 Toll 樣受體 9 復合體共同位于細胞膜附近，可以激活轉錄因子干擾素調節因子 7 的核轉運進一步誘導干擾素 α 的產生[53]。在早期肝纖維化中，Spp1 增強子低甲基化，Spp1 表達上調。在 Spp1 基因敲除小鼠的研究[54-55]中表明，Spp1 在肝損傷和纖維化的進展中起重要作用。Spp1 是由 Kupffer 細胞產生的關鍵細胞因子或趨化因子，是肝損傷導致的炎癥反應[56]。Komatsu 等[57]對 CCl4 誘導的肝纖維化大鼠肝組織的 DNA 甲基化進行了分析，發現 Spp1 出現了低甲基化的狀態，PI3K/AKT 通路激活，TGF-β1 分泌增多，誘導 HSCs 激活，細胞外基質Ⅰ型膠原蛋白和 α-SMA 分泌也增多，導致肝纖維化的發生；Spp1 在肝癌中也表達增多。以上研究結果提示，肝纖維化過程中 PI3K/AKT 通路激活，Spp1 低甲基化且表達增加，使 TGF-β1 分泌增多，HSCs 激活，進一步加重肝纖維化。
2.2.6 Ras 三磷酸鳥苷酶激活樣蛋白-1（Ras GTPase activating-like protein 1，RASAL1）
RASAL1 基因是一種 RAS GTPase 活化蛋白，與一類被稱為鳥苷酸交換因子的蛋白可共同調節 Ras 通路的“開”與“關”。Ras 蛋白有 Ras-GTP（有活性）與 Ras-GDP（無活性）兩種結構形式，RASAL1 基因編碼的蛋白在 RAS-GTP 與 RAS-GDP 的結構轉換中起著重要的調控作用。RASAL1 基因啟動子區域高度甲基化可導致 RASAL1 基因的沉默，從而使 RAS-GTP 活性減弱，繼而導致 RASAL1 活性下調，RASAL1 在結直腸癌、肝癌等多種腫瘤中表達下調，被認為是候選抑癌基因。RAS-RAF-MEK-ERK 信號傳導通路活性異常與多種腫瘤的發生、發展密切相關，其中 RAS 分子是這條信號通路的關鍵樞紐分子。有研究[58]提示了 Ras 信號在肝纖維化中的重要作用。Tao 等[18]研究表明，RASAL1 基因在肝纖維化中高甲基化，RAS-RAF-MEK-ERK 通路激活，導致 HSCs 活化，而 MeCP2 基因的沉默可增加 RASAL1 的表達。以上研究結果提示，RASAL1 在肝纖維化處于無活性狀態，使 RAS-RAF-MEK-ERK 通路激活，導致 HSCs 活化。
3 組蛋白甲基化在肝纖維化中的作用
3.1 組蛋白甲基化
組蛋白八聚體由 H2A、H2B 與 H3、H4 各兩分子組成，147 bp 的 DNA 圍繞組蛋白八聚體外形成核小體。核小體是最基本的染色體結構。組蛋白甲基化修飾（一種翻譯后修飾）通常發生在核小體中 H3 和 H4 組蛋白 N 端的賴氨酸或精氨酸殘基上，組蛋白甲基轉移酶能夠在其殘基上添加 1、2 或 3 個甲基，根據殘基上甲基化基團的數量分為單甲基化、二甲基化或三甲基化。賴氨酸甲基化通常發生在 H3 賴氨酸 4（H3K4）、9（H3K9）、27（H3K27）、36（H3K36）、79（H3K79）和 H4 賴氨酸 20（H4K20）中，精氨酸甲基化通常發生在 H3 精氨酸 2（H3R2）、8（H3R8）、17（H3R17）、26（H3R26）和 H4 精氨酸 3（H4R3）中[59]。對基因轉錄的影響取決于共價修飾的特定位點，如 H3K4 三甲基化導致基因轉錄活化，而 H3K9 或 H3K27 導致基因轉錄沉默[60-62]。在 HSCs 的激活過程中伴隨著涉及甲基轉移至 H3K27 和 H3K4，甲基轉移酶 EZH2 調節 H3K27 甲基化使其沉默，而甲基轉移酶 ASH1 調節 H3K4 甲基化使其活化。EZH2 是通過靶向 PPARγ 介導 H3K27 甲基化的，而 ASH1 直接綁定于活化 HSCs 中的α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、TIMP-1、TGF-β1 所在區域。ASH1 消失會極大地抑制纖維化基因的表達，MeCP2 可正調控 ASH1 表達，提出 MeCP2 作為表觀遺傳學調控通路中的一個關鍵的轉錄活性成分共同調節多個纖維化相關基因的表達[63]。有研究[64]發現，組蛋白甲基轉移酶抑制劑 3-deazaneplano-A（DZNep）可抑制多種組蛋白甲基化修飾，從而抑制肝纖維化的進展。近幾年也有不少與組蛋白甲基化修飾相關的基因的研究。
3.2 組蛋白甲基化相關因子與肝纖維化
3.2.1 缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）
HIF-1 是由氧敏感性 α 亞基（HIF-1α）和組成性 β 亞基（HIF-1β）組成的異二聚體轉錄因子，通過在缺氧條件下調節必需基因的表達來促進細胞存活[65]。HIF-1 通過調節自噬以激活 HSCs[66-67]。缺氧可抑制細胞中 H3K4 三甲基化組蛋白甲基化修飾[68]。Deng 等[67]在缺氧誘導的 LX-2 細胞中研究發現，HIF-1α 分子的核運輸、自噬和 HSCs 活化明顯受到抑制，是由于缺氧條件下 H3K4 三甲基化組蛋白甲基化被 DZNep 抑制，結果提示，組蛋白甲基化修飾在 HIF-1 信號級聯中起重要作用以調節細胞活性。Hong 等[69]研究組蛋白 H3K4 甲基化修飾在 HSCs 活化中起關鍵作用，抑制組蛋白 H3K4 三甲基化修飾影響 HIF-1 核運輸，最終影響自噬和 HSCs 的激活。以上研究結果提示，H3K4 的三甲基化會影響 HIF-1 核運輸和自噬，進而影響 HSCs 的活化。
3.2.2 Dickkopf-1（Dkk-1）
Dickkopf 家族（Dkk）由 4 個成員（Dkk-1－Dkk-4）組成，充當 Wnt 信號通路的抑制劑，其中 Dkk-1（Wnt/β-catenin 信號傳導的抑制劑）過表達能夠抑制原代培養的 HSCs[70]。研究[71]表明，在肝纖維化進展過程中，HSCs 中 Wnt 信號通路被激活且誘導此通路的一些下游元件。Hussain 等[72]和 Yang 等[73]均報道，EZH2 通過 H3K27 的三甲基化抑制 Dkk-1 表達，從而激活 Wnt/β-catenin 途徑使 HSCs 活化。以上研究結果提示，H3K27 的三甲基化會抑制 Dkk-1 的表達，使 Wnt/β-catenin 信號通路激活，從而使 HSCs 活化。
3.2.3 心肌素相關轉錄因子-A（myocardin related transcription factor-A，MRTF-A）
MRTF-A 是轉錄調控激活輔助因子，其通過與組蛋白甲基轉移酶復合物 SET1/COMPASS 相互作用而增強 HSCs 活化[74]。SET1/COMPASS 復合物是一個由 8 個蛋白亞基組成的相對分子質量為 380×103的甲基轉移酶復合物，它能夠催化組蛋白 H3K4 位點發生單甲基化、二甲基化及三甲基化[75]。Tian 等[76]研究發現，MRTF-A 減少會影響 SET1/COMPASS 復合物亞基與組蛋白甲基轉移酶的結合，從而減輕 TGF-β 誘導的促纖維化轉錄。以上研究結果提示，MRTF-A 是通過表觀遺傳學中組蛋白甲基化轉移酶與 SET1/COMPASS 的作用調節 HSCs 中 TGF-β 信號通路來調節肝纖維化的。
4 小結與展望
甲基化通過改變基因的表觀遺傳學從而影響基因的表達，引起肝纖維化中不同途徑的級聯反應，由此我們可以通過對甲基化在肝臟疾病中的作用及機制進行系統而深入的研究，為肝臟疾病的治療提供新的方向。從目前的研究看，DNMTs 抑制劑（5-azadC）可以通過抑制 DNA 甲基化而抑制 HSCs 的持續活化，其正在進行Ⅱ期測試試驗中；DZNep 也在用于抑制肝纖維化的進展；另有研究也在用甲基化級聯反應的某個位點作為潛在的靶點來治療肝纖維化。
肝纖維化是由于肝臟慢性損傷而引起的細胞外基質過度積累和瘢痕形成，其病理表現為再生肝細胞結節形成。肝纖維化會進一步發展為肝硬變，而肝硬變又會進展成肝功能衰竭和肝癌[1]。由于大多數人類疾病是由環境因素和遺傳因素相互作用造成的，肝纖維化過程中也同樣存在環境因素與遺傳因素共同作用，DNA 和組蛋白修飾、非編碼 RNA 的表觀遺傳機制導致基因的遺傳沉默等在其發病機制中起關鍵作用[2]。肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）是造成肝纖維性化的關鍵細胞，并且其主要由 DNA 和組蛋白甲基化參與調節，在肝纖維化發生過程中的關鍵事件是 HSCs 被激活后存儲維生素 A 的竇周細胞轉化為促纖維化的肌成纖維細胞。筆者現就肝纖維化的發病機制以及近些年來肝纖維化相關的重要 DNA 甲基化和組蛋白甲基化改變及其機制的一些研究進展作一簡要介紹。
1 肝纖維化的機制
肝纖維化是慢性損傷的過程，主要由慢性肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病、膽汁淤積、代謝性疾病等引起[3-5]。肝纖維化進一步發展成肝硬變，肝硬變是肝癌極其重要的危險因素，20%～30% 的肝硬變患者會進展為肝細胞癌[6-7]。
肝纖維化的發病機制主要依賴于以下 3 方面的因素：① 肝損傷后，釋放大量炎性因子如白細胞介素 6、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、結締組織生長因子、血小板源性生長因子等負責招募炎性細胞。② HSCs、巨噬細胞、門靜脈周圍及骨髓源性的成纖維細胞和纖維細胞、凋亡的肝細胞、肝內定居的 Kupffer 細胞等分泌細胞外基質如Ⅰ型膠原蛋白、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）并刺激肝細胞再生，以對損傷的肝組織進行修復[8-9]，其中 HSCs 處于中心地位，超過 80% 的分泌細胞外基質的肌成纖維細胞均來源于 HSCs[10-11]。③ HSCs 在產生細胞外基質的同時分泌對細胞外基質進行降解的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）一族如 MMP-13 及 MMP 抑制因子組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of MMP，TIMPs），以調控細胞外基質的分泌量，從而維持動態平衡，肝纖維化的形成正是這種動態平衡的失調[12]。
當前普遍認為，肝纖維化是可逆轉的，而進展為肝硬化或惡變為肝癌后則不可逆轉。
2 DNA 甲基化在肝纖維化中的作用
2.1 DNA 甲基化
DNA 甲基化是研究最早的一種表觀遺傳學修飾方式，其是在 DNA 復制完成后的一種酶促反應。在 DNA 甲基化的過程中，DNA 通過在 CpG 的 5′位置加入甲基形成 5-甲基胞嘧啶（5-mC），而 TET 蛋白又可以催化 5-mC 轉化為 5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）。
催化甲基轉移的 DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）分為 DNMT1、DNMT2 和 DNMT3a/3b，其中 DNMT1 是一種維持性甲基化酶，在細胞分裂過程中識別新 DNA 鏈上的半甲基化位點并再生出甲基化狀態；DNMT2 可與 DNA 上特異位點結合，但具體作用尚不清楚；DNMT3a 和 DNMT3b 是重新甲基化酶，它們使去甲基化的 CpG 位點重新甲基化，即參與 DNA 的從頭甲基化[13]。而 TET 蛋白主要起去甲基化作用，但對其機制的研究尚不明確[2]。
甲基-CpG 結合蛋白 2（methyl-CpG binding protein 2，MeCP2）在 HSCs 的活化和轉化過程中起著重要的作用，其在肝纖維化中過度表達，與甲基化 DNA 特異性結合，抑制其下游靶基因的轉錄；過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）也受 MeCP2 表達的影響，通過沉默 MeCP2 表達會導致 PPARγ 表達減少[14]。
2.2 DNA 甲基化基因與肝纖維化
2.2.1 同源性磷酸酶張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome，PTEN）
PTEN 是磷酸酶基因，使用磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯即磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的產物作為其生理底物[15]。PI3K/AKT 和 ERK 信號通路是 PTEN 通過其脂質磷酸酶活性作用的途徑之一，該信號通路激活會導致 HSCs 活化，在該過程中涉及許多細胞因子和生長因子如 TGF-β1。TGF-β1 被認為是促使 HSCs 向肌成纖維細胞轉化、增加 α-SMA 等活化標志物的表達以及上調膠原蛋白表達的最重要的中介物，若將 HSCs 暴露于 TGF-β1 時會激活 PI3K/AKT 和 ERK 途徑[16]，通過抑制 PI3K 活性和 ERK 磷酸化將阻斷活化的 HSCs 的細胞增殖和Ⅰ型膠原蛋白表達。在某些情況下 PTEN 能夠通過其蛋白酪氨酸磷酸酶活性抑制 ERK 信號傳導途徑，從而負面調節細胞增殖、黏著斑和細胞遷移[17]。PTEN 功能的喪失可能導致磷脂酰肌醇 3，4，5-三磷酸酯的積累，繼而增強 AKT 和 ERK 活性，導致細胞凋亡減少和（或）增加有絲分裂原信號傳導，而高甲基化是 PTEN 失活的機制之一，已經在許多惡性腫瘤中得到證實，如 Tao 等[18]和 Takashima 等[19]已經證明 DNMTs 抑制劑 5-氮雜-2′-脫氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-azadC）通過抑制 DNMT 和 AKT/ERK 通路的激活，從而抑制 HSCs 活化，使 PTEN 基因啟動子甲基化并恢復 PTEN 基因表達；Bian 等[20]證實，在纖維化的肝臟中 PTEN 表達下調，并最終導致 HSCs 中 ERK 與 AKT 細胞通路被激活，TGF-β1 分泌增多，誘導 HSCs 激活、Ⅰ型膠原蛋白和 α-SMA 分泌增多，從而導致肝纖維化的發生。以上研究結果提示，PTEN 基因在肝纖維化過程中高甲基化，PI3K/AKT 和 ERK 信號通路被激化，從而導致 HSCs 進一步活化。
2.2.2 septin 9（SEPT9）
現在人類已經發現了 13 個 septin 家族成員，編碼的蛋白質相對分子質量為 40×103～60×103[21-22]，其中的 SEPT9 是高度保守的 septin 蛋白家族的成員之一，屬于 GTP 酶超級家族，是 GTP 結合蛋白，這些 GTP 酶蛋白參與細胞質分裂、細胞內物質轉運、細胞周期調控以及細胞凋亡。SEPT9 有 219 kb，可被剪切成多種形式而被熟知。在 SEPT9 的 3′和 5′末端可選擇性剪接，5′端可產生 6 種不同的信使 RNA 變異剪接體即 SEPT9_v1、SEPT9_v2、SEPT9_v3、SEPT9_v4、SEPT9_v4*和 SEPT9_v5，3′端也可產生 3 種不同的信使 RNA 即 SV1、SV2 和 SV3[23]。目前研究[24]證實，SEPT9_v1 被發現在許多腫瘤中過表達，包括卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌，而其在這些器官的正常組織中幾乎檢測不到。SEPT9_v4 和 SEPT9_v4*編碼相同的多肽片段，但證實只有 SEPT9_v4*多肽鏈參與腫瘤發生[25-26]。Septin 相關基因對腫瘤的促癌作用存在爭議，不同腫瘤細胞中 SEPT9_v3 的表達水平差異較大，隨后的研究證明了 SEPT9_v3 表達的多樣性是由于其在惡性腫瘤中的不同 DNA 甲基化狀態決定的[27]。近年來，一些基礎和臨床研究已經提供了人類疾病中 SEPT9 超甲基化狀態的證據，如惡性胸腔積液[28]、非侵襲性肺癌[29]、食管鱗狀細胞癌[30]、膽管癌[31]、糖尿病[32]。現在也開發了 SEPT9 甲基化測定法應用于血漿，外周血中甲基化的 SEPT9 被驗證作為結直腸癌的敏感生物標志物[33-34]，目前可用于歐洲結直腸癌的血基篩查試驗中的臨床診斷[35]。Wu 等[36]證明在 HSCs 中的 SEPT9 在體內和體外都是超甲基化，SEPT9 的甲基化由 DNMT3a 調節，SEPT9 通過降低 TGF-β1 表達，使肌成纖維細胞中標志物 α-SMA 和Ⅰ型膠原蛋白的表達相應減少，SEPT9 的表達增加可以減輕體外肝纖維化。以上研究結果提示，SEPT9 在正常肝組織中表達，在肝纖維化中超甲基化，可通過減少 TGF-β1 使肝纖維化標志物減少。
2.2.3 patched-1（Ptch1）
Ptch1 蛋白是信號通路的一個組成部分，在控制細胞分化和增殖中發揮重要作用[37-38]。hedgehog（Hh）信號通路在細胞生長分化、動物胚胎發育過程中都起關鍵作用，且與組織內穩態以及成人器官的腫瘤發生、腫瘤細胞的增殖分化、細胞凋亡、侵襲轉移關系密切。Hh 信號通路主要由 Hh 配體蛋白 sonic hedgehog（Shh）、indian hedgehog（Ihh）、desert hedgehog（Dhh）、兩個跨膜蛋白受體 patched（Ptch）和 Smoothened（Smo）及下游轉錄因子神經膠質瘤相關癌基因同源蛋白（glioma-associated oncogene homolog，GLI）組成。Hh 信號通路各組成部分的突變或異常激活會導致發育缺陷或腫瘤[39]。當 Hh 蛋白不存在時，Ptch1 可抑制 Smo 的活性，下游基因的轉錄表達受到抑制。當 Hh 蛋白與 Ptch1 結合時，Ptch1 對 Smo 的抑制作用被解除，Smo 被激活，進入胞質，將信號下傳，激活轉錄因子（GLI1、GLI2、GLI3），GLI 進入細胞核，直接啟動 Ptch、Wnt、表皮生長因子等目的基因的表達[40]。Choi 等[41]報道了 Hh 途徑活化會導致 HSCs 激活；Yang 等[42]報道了 Ptch1 在肝纖維化中高甲基化，Pcth1 通過影響 GLI1 和 Smad3 信號機制影響 HSCs 活化。Smad3 和 GLI1 會促進 TGF-β1分泌，Ⅰ型膠原蛋白和 α-SMA 分泌增多。以上研究結果提示，Hh 信號通路與 HSCs 的活化相關，在肝纖維化過程中該通路激化，Ptch1 與 Hh 配體蛋白結合，最終導致 GLI1 進入細胞核，促進 TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白和 α-SMA 分泌增多。
2.2.4 Smad
Smad 蛋白是一類轉錄協調子，必須與其他 DNA 結合蛋白相互作用才能調節靶基因的轉錄，其分屬于 3 類：第 1 類是膜受體激活的 Smad，有 MARK 磷酸化位點（包括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 及 Smad8 亞型）；第 2 類是通用的 Smad（目前只有 Smad4）；第 3 類可稱為抑制性 Smad（包括 Smad6、Smad7）。它們是 TGF-β 信號傳導途徑中的抑制因子，C 端功能區缺乏磷酸。HSCs 的活化是一個級聯反應過程[43]，體現在兩方面：① 在 TGF-β/Smad 通路中，TGF-β 是啟動因子。TGF-β/活動素連續激活 TGF-β 超家族受體 Ⅰ、Ⅱ，TGF-β 超家族受體Ⅰ使細胞內質-核信號分子 Smad2/3 磷酸化，導致這些蛋白質活化并轉移到細胞核[22]。Smad7 可抑制 Smad2 和 Smad3 受體調節的磷酸化作用，它們主要通過競爭性地與 TGF-β 超家族受體Ⅰ結合而抑制受體激活膜受體激活的 Smad 的磷酸化作用；Smad7 沉默可以來自表觀遺傳修飾，包括 DNA甲基化、組蛋白修飾或 microRNA[44-45]。② TGF-β 通過誘導 HSCs 合成 TIMPs 而抑制 MMPs 的表達和活性，從而抑制細胞外基質的降解。TGF-β/Smad 通路中為疾病治療提供了作用點。Yang 等[42]的研究結果揭示了 Ptch1 在肝纖維化中為高表達，其在 Smad3 信號傳導中起抑制作用。Latella 等[46]通過使用 Smad3 敲除小鼠進行的研究證明，所述 Smad3 敲除小鼠被保護免受二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化。Bian 等[47]證明通過抑制 DNMT1 抑制了 TGF-β1，從而減少了 Smad2 和 Smad3 的磷酸化，也導致了 Smad7 表達的增加。在肝纖維化中 Smad7 處于高甲基化，TGF-β/Smad 通路中 Smad2 和 Smad3 磷酸化，導致 TGF-β1 表達增加，合成 TIMPs 而抑制 MMPs 的表達和活性。以上研究結果提示，Smad2 和 Smad3 促進肝纖維化，Smad7 可抑制肝纖維化發生，但在肝纖維化過程中 Smad7 處于高甲基化，TGF-β/Smad 通路中 Smad2 和 Smad3 磷酸化，導致 HSCs 的激活。
2.2.5 分泌型焦磷酸蛋白 1（secreted phosphoprotein 1，Spp 1）
Spp1 是一種具有多種功能的分泌型酸性糖蛋白，其可由許多細胞如微血管內皮細胞、成纖維細胞、炎癥細胞、肌細胞產生[48]。Spp1 具有多種生物學功能，包括細胞黏附、信號轉導等[49]。Spp1 主要參與以下 3 條通路：① Spp1 可通過整合素調節核因子-κB 通路中激酶的磷酸化作用，導致 IκB 的磷酸化[50-51]。② Spp1 與 CD44 結合可以通過 PI3K/AKT 通路的激活促進細胞存活，PI3K/AKT 通路可增加 Spp1 的表達，一項基因譜的研究[52]結果表明，Spp1 是 PI3K/AKT 通路的下游效應器并可被 PTEN 所拮抗。③ 細胞內 Spp1 與髓樣分化因子 88 和 Toll 樣受體 9 復合體共同位于細胞膜附近，可以激活轉錄因子干擾素調節因子 7 的核轉運進一步誘導干擾素 α 的產生[53]。在早期肝纖維化中，Spp1 增強子低甲基化，Spp1 表達上調。在 Spp1 基因敲除小鼠的研究[54-55]中表明，Spp1 在肝損傷和纖維化的進展中起重要作用。Spp1 是由 Kupffer 細胞產生的關鍵細胞因子或趨化因子，是肝損傷導致的炎癥反應[56]。Komatsu 等[57]對 CCl4 誘導的肝纖維化大鼠肝組織的 DNA 甲基化進行了分析，發現 Spp1 出現了低甲基化的狀態，PI3K/AKT 通路激活，TGF-β1 分泌增多，誘導 HSCs 激活，細胞外基質Ⅰ型膠原蛋白和 α-SMA 分泌也增多，導致肝纖維化的發生；Spp1 在肝癌中也表達增多。以上研究結果提示，肝纖維化過程中 PI3K/AKT 通路激活，Spp1 低甲基化且表達增加，使 TGF-β1 分泌增多，HSCs 激活，進一步加重肝纖維化。
2.2.6 Ras 三磷酸鳥苷酶激活樣蛋白-1（Ras GTPase activating-like protein 1，RASAL1）
RASAL1 基因是一種 RAS GTPase 活化蛋白，與一類被稱為鳥苷酸交換因子的蛋白可共同調節 Ras 通路的“開”與“關”。Ras 蛋白有 Ras-GTP（有活性）與 Ras-GDP（無活性）兩種結構形式，RASAL1 基因編碼的蛋白在 RAS-GTP 與 RAS-GDP 的結構轉換中起著重要的調控作用。RASAL1 基因啟動子區域高度甲基化可導致 RASAL1 基因的沉默，從而使 RAS-GTP 活性減弱，繼而導致 RASAL1 活性下調，RASAL1 在結直腸癌、肝癌等多種腫瘤中表達下調，被認為是候選抑癌基因。RAS-RAF-MEK-ERK 信號傳導通路活性異常與多種腫瘤的發生、發展密切相關，其中 RAS 分子是這條信號通路的關鍵樞紐分子。有研究[58]提示了 Ras 信號在肝纖維化中的重要作用。Tao 等[18]研究表明，RASAL1 基因在肝纖維化中高甲基化，RAS-RAF-MEK-ERK 通路激活，導致 HSCs 活化，而 MeCP2 基因的沉默可增加 RASAL1 的表達。以上研究結果提示，RASAL1 在肝纖維化處于無活性狀態，使 RAS-RAF-MEK-ERK 通路激活，導致 HSCs 活化。
3 組蛋白甲基化在肝纖維化中的作用
3.1 組蛋白甲基化
組蛋白八聚體由 H2A、H2B 與 H3、H4 各兩分子組成，147 bp 的 DNA 圍繞組蛋白八聚體外形成核小體。核小體是最基本的染色體結構。組蛋白甲基化修飾（一種翻譯后修飾）通常發生在核小體中 H3 和 H4 組蛋白 N 端的賴氨酸或精氨酸殘基上，組蛋白甲基轉移酶能夠在其殘基上添加 1、2 或 3 個甲基，根據殘基上甲基化基團的數量分為單甲基化、二甲基化或三甲基化。賴氨酸甲基化通常發生在 H3 賴氨酸 4（H3K4）、9（H3K9）、27（H3K27）、36（H3K36）、79（H3K79）和 H4 賴氨酸 20（H4K20）中，精氨酸甲基化通常發生在 H3 精氨酸 2（H3R2）、8（H3R8）、17（H3R17）、26（H3R26）和 H4 精氨酸 3（H4R3）中[59]。對基因轉錄的影響取決于共價修飾的特定位點，如 H3K4 三甲基化導致基因轉錄活化，而 H3K9 或 H3K27 導致基因轉錄沉默[60-62]。在 HSCs 的激活過程中伴隨著涉及甲基轉移至 H3K27 和 H3K4，甲基轉移酶 EZH2 調節 H3K27 甲基化使其沉默，而甲基轉移酶 ASH1 調節 H3K4 甲基化使其活化。EZH2 是通過靶向 PPARγ 介導 H3K27 甲基化的，而 ASH1 直接綁定于活化 HSCs 中的α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、TIMP-1、TGF-β1 所在區域。ASH1 消失會極大地抑制纖維化基因的表達，MeCP2 可正調控 ASH1 表達，提出 MeCP2 作為表觀遺傳學調控通路中的一個關鍵的轉錄活性成分共同調節多個纖維化相關基因的表達[63]。有研究[64]發現，組蛋白甲基轉移酶抑制劑 3-deazaneplano-A（DZNep）可抑制多種組蛋白甲基化修飾，從而抑制肝纖維化的進展。近幾年也有不少與組蛋白甲基化修飾相關的基因的研究。
3.2 組蛋白甲基化相關因子與肝纖維化
3.2.1 缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）
HIF-1 是由氧敏感性 α 亞基（HIF-1α）和組成性 β 亞基（HIF-1β）組成的異二聚體轉錄因子，通過在缺氧條件下調節必需基因的表達來促進細胞存活[65]。HIF-1 通過調節自噬以激活 HSCs[66-67]。缺氧可抑制細胞中 H3K4 三甲基化組蛋白甲基化修飾[68]。Deng 等[67]在缺氧誘導的 LX-2 細胞中研究發現，HIF-1α 分子的核運輸、自噬和 HSCs 活化明顯受到抑制，是由于缺氧條件下 H3K4 三甲基化組蛋白甲基化被 DZNep 抑制，結果提示，組蛋白甲基化修飾在 HIF-1 信號級聯中起重要作用以調節細胞活性。Hong 等[69]研究組蛋白 H3K4 甲基化修飾在 HSCs 活化中起關鍵作用，抑制組蛋白 H3K4 三甲基化修飾影響 HIF-1 核運輸，最終影響自噬和 HSCs 的激活。以上研究結果提示，H3K4 的三甲基化會影響 HIF-1 核運輸和自噬，進而影響 HSCs 的活化。
3.2.2 Dickkopf-1（Dkk-1）
Dickkopf 家族（Dkk）由 4 個成員（Dkk-1－Dkk-4）組成，充當 Wnt 信號通路的抑制劑，其中 Dkk-1（Wnt/β-catenin 信號傳導的抑制劑）過表達能夠抑制原代培養的 HSCs[70]。研究[71]表明，在肝纖維化進展過程中，HSCs 中 Wnt 信號通路被激活且誘導此通路的一些下游元件。Hussain 等[72]和 Yang 等[73]均報道，EZH2 通過 H3K27 的三甲基化抑制 Dkk-1 表達，從而激活 Wnt/β-catenin 途徑使 HSCs 活化。以上研究結果提示，H3K27 的三甲基化會抑制 Dkk-1 的表達，使 Wnt/β-catenin 信號通路激活，從而使 HSCs 活化。
3.2.3 心肌素相關轉錄因子-A（myocardin related transcription factor-A，MRTF-A）
MRTF-A 是轉錄調控激活輔助因子，其通過與組蛋白甲基轉移酶復合物 SET1/COMPASS 相互作用而增強 HSCs 活化[74]。SET1/COMPASS 復合物是一個由 8 個蛋白亞基組成的相對分子質量為 380×103的甲基轉移酶復合物，它能夠催化組蛋白 H3K4 位點發生單甲基化、二甲基化及三甲基化[75]。Tian 等[76]研究發現，MRTF-A 減少會影響 SET1/COMPASS 復合物亞基與組蛋白甲基轉移酶的結合，從而減輕 TGF-β 誘導的促纖維化轉錄。以上研究結果提示，MRTF-A 是通過表觀遺傳學中組蛋白甲基化轉移酶與 SET1/COMPASS 的作用調節 HSCs 中 TGF-β 信號通路來調節肝纖維化的。
4 小結與展望
甲基化通過改變基因的表觀遺傳學從而影響基因的表達，引起肝纖維化中不同途徑的級聯反應，由此我們可以通過對甲基化在肝臟疾病中的作用及機制進行系統而深入的研究，為肝臟疾病的治療提供新的方向。從目前的研究看，DNMTs 抑制劑（5-azadC）可以通過抑制 DNA 甲基化而抑制 HSCs 的持續活化，其正在進行Ⅱ期測試試驗中；DZNep 也在用于抑制肝纖維化的進展；另有研究也在用甲基化級聯反應的某個位點作為潛在的靶點來治療肝纖維化。