引用本文： 孫建兵, 吉翔, 汪亞輝, 馬凱, 于建平, 李洪濤, 韓曉鵬, 劉宏斌. 循環腫瘤細胞與胃癌患者臨床病理特征及預后的關系研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(1): 25-30. doi: 10.7507/1007-9424.201808028 復制
胃癌是全球第 5 大常見的惡性腫瘤，也是全球第 3 大癌癥死亡原因[1]；2015 年中國胃癌新發病例約為 67.9 萬例，死亡病例約為 49.8 萬例[2]。患者被診斷為胃癌時只有 23% 的胃癌患者是局限性的，34% 的病例已經發生轉移，32% 的病例已發生淋巴結轉移[3]。胃癌發病早期一般多無癥狀，被確診時患者多屬晚期[4]。早期胃癌患者的 5 年生存率可達 90% 以上，而晚期胃癌患者的 5 年生存率僅為 25%～30%[5-6]。盡管手術、化療和其他治療方法在胃癌患者的治療中不斷取得進展，但胃癌患者的預后仍較差，其主要原因是胃癌的復發和轉移，故胃癌的早期診斷、早期治療在提高胃癌患者預后方面起著關鍵作用。循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是指因自發或診療操作過程中由原發灶或轉移灶脫落進入外周血液循環系統或者淋巴系統的腫瘤細胞[7-9]。腫瘤的侵襲、轉移是在腫瘤微環境中由多種分子參與、通過多種信號通路、涉及腫瘤細胞從原發灶或轉移灶脫落、上皮間質轉化、細胞外基質降解、浸潤穿透基底膜、遠處轉移等多步驟、多環節的復雜過程。CTCs 的產生在腫瘤的侵襲、轉移過程中扮演了重要的角色。CTCs 的檢測被美國 FDA 批準用于轉移性乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌的臨床診斷和療效評估[10-12]。目前 CTCs 的檢測用于胃癌的診治方面應用較少，本研究旨在通過檢測胃癌患者術前清晨空腹外周靜脈血中的 CTCs，探討其與胃癌患者的臨床病理特征及預后的關系。
1 資料與方法
1.1 納入和排除標準
1.1.1 納入標準
胃癌組：① 符合中華人民共和國衛生部頒布的《中華人民共和國衛生行業標準》（WS316-2010）中的“胃癌診斷標準”[13]的胃癌患者；② 術前未行新輔助化療及其他任何抗腫瘤治療；③ 患者不伴有其他器官惡性腫瘤；④ 腫瘤在接受手術時無明確廣泛轉移且行胃癌 D2 根治手術；⑤ 術后按期進行標準的 FOLFOX6 方案化療；⑥ 患者病歷資料齊全。胃良性病變組：① 同期經病理診斷確診為胃部良性病變患者（包括潰瘍、炎癥、出血）；② 既往無惡性腫瘤病史；③ 一般資料如性別和年齡與胃癌組無明顯差異的患者。本研究經筆者所在醫院倫理委員會批準。
1.1.2 排除標準
① 術后失訪的患者；② 術后行放療、免疫治療、靶向治療等可能對研究結果產生影響的情況。
1.2 研究對象
選取就診于中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院 2015 年 8 月至 2016 年 12 月期間經組織病理學證實為胃癌且行胃癌 D2 根治術的患者 100 例（胃癌組），其中男 67 例，女 33 例；年齡（58±10）歲。選取同時期就診于筆者所在醫院的胃良性病變患者 38 例作為對照（胃良性病變組），其中男 21 例，女 17 例；年齡（59±11）歲。2 組患者在年齡和性別方面比較差異無統計學意義（P>0.050）。所有患者的手術方式、術后病理組織學檢查或 TNM 分期均按日本第 15 版《胃癌處理規約》規定施行。
1.3 主要試劑和儀器
試劑：ACD 抗凝采血管購自美國 BD 公司；人外周血白細胞去除試劑盒及人外周血 CTCs 鑒別試劑盒均購自北京萊爾生物醫藥科技有限公司。儀器：低速大容量離心機購自山海安亭飛鴿公司；原位雜交儀購自賽默飛世爾科技中國有限公司；熒光顯微鏡購自奧林巴斯中國有限公司；載玻片購自丹麥 DAKO 公司。
1.4 CTCs 的檢測方法
抽取患者清晨空腹肘正中靜脈血 7 mL，并用 ACD 抗凝劑抗凝，24 h 內采用免疫磁微粒陰性富集法聯合免疫熒光原位雜交技術檢測 CTCs。
1.4.1 CTCs 的陰性富集
① 取 4 mL 全血標本加入離心管中，用 CS1 緩沖液補充到 45 mL，在室溫下離心 5 min（650×g），吸去上清液，留 10 mL 于離心管，輕搖離心管混勻沉淀細胞。② 加 CS2 至 45 mL，將離心管置于室溫 8 min，于垂直混勻儀混勻后再離心 5 min（650×g），棄去上清液至 500 μL；輕搖離心管混勻沉淀細胞后補加 CS1 緩沖液至 5 mL。③ 適量的磁微粒（150 μL/人份）混懸液至 2 mL 離心管中，加入 1 mL CS1 緩沖液輕柔吹打混勻，于磁力架上靜置 1 min，棄去上清液。重復洗滌 3 次后，用 CS1 重懸磁微粒至 150 μL。將洗滌好的磁微粒保存在試管架上備用。④ 將 ② 中處理好的樣本緩慢加入磁微粒，調節搖床搖速至 120 次/分，室溫下搖動 20 min。⑤ 先于 5 mL 新的離心管中加入3 mL CS3 緩沖液，將④ 中的所有液體輕輕疊加到 CS3 頂層，離心 5 min（300×g）。⑥ 離心后可見 3 層溶液，輕柔吸取最上面的 2 層溶液，移至 1 個新的 15 mL 離心管中，加入 CS1 緩沖液至 14 mL，輕柔顛倒混勻 3 次后再離心 5 min（950×g），棄上清液至 300 μL，加入 1 mL CS1緩沖液，重懸沉淀細胞。⑦ 將標本轉移至新的 2 mL 離心管中，靠于磁力架上 2～3 min，將液體分別轉移至新的 15 mL 離心管中，離心 3 min（2 070×g），棄去上清液至 100 μL，加入 100 μL CF1 固定液，充分輕柔吹打混勻 10 次以上，涂片至標本框（免疫組化筆畫框）中。
1.4.2 CTCs 的鑒定
免疫熒光原位雜交鑒定：① 預固定：CF2 預固定 8 min；② 老化：37 ℃ 預熱的 2×SSC 老化 10 min；③ 脫水：75%、85%、100% 的梯度乙醇脫水，各 2 min；④ 雜交：10 U 探針（CEP17/CEP8），蓋片，75 ℃ 變性 5 min，37 ℃ 雜交 1.5 h；⑤ 洗片：43 ℃ 預熱的 50% FA 中甩掉蓋玻片，并溫浴 15 min；⑥ 洗滌：室溫 2×SSC 中 5 min，2 次；⑦ 抗體孵育：滴加抗體（CD45），室溫孵育 1 h；⑧ 洗片：0.2% 的 BSA 洗標本區 2 次；⑨ 復染：10 μL 0.1% 的 4′6-聯脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（4′6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride，DAPI），蓋片，待熒光顯微鏡下讀片。
1.4.3 CTCs 的陽性結果判定
① DAPI（+）CD45（–）CEP8 多倍體（+）CEP17 二倍體（–）；② DAPI（+）CD45（–）CEP8（–） CEP17（+）；③ DAPI（+）CD45（–）CEP8（+） CEP17（+）。DAPI 標記細胞核呈藍色，CD45 標記白細胞呈紅色，CEP8 標記 8 號染色體著絲粒呈橙色和 CEP17 標記 17 號染色體著絲粒呈綠色，正常細胞均為二倍體。
1.5 腫瘤標志物的檢測
胃癌和胃良性病變患者入院后行常規腫瘤標志物 CEA、CA19-9 及 CA125 的檢測并收集數據，檢測結果以 CEA>6.0 μg/L、CA19-9>27 U/mL、CA125>35 U/mL 判定為高表達。
1.6 隨訪及預后監測
定期對 100 例胃癌術后患者進行嚴密的隨訪，對出院患者每 3 個月進行 1 次門診或電話隨訪。術后無瘤生存期為行手術治療后至疾病復發或末次隨訪時間（2017 年 12 月 20 日）。時間以月為單位統計，詳細記錄胃癌患者的一般資料（如性別、年齡）、術后組織病理學資料（如腫瘤部位、浸潤深度、分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移、脈管癌栓）及隨訪資料（如無進展生存期）。患者復發的判斷標準：病理活檢結果證實和（或）明確的影像學檢查結果證實。
1.7 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件對數據進行分析。采用 χ2 檢驗或 Fisher 確切概率法分析 CTCs 水平與胃癌患者臨床病理特征之間的關系。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characterisitic curve，ROC）分析 CTCs 的診斷特異度和敏感度。采用 Kaplan-Meier 法分析比較不同 CTCs 水平患者的無進展生存期，采用 log-rank 法檢驗。檢驗水準 α=0.050。
2 結果
2.1 CTCs 的陽性鑒定結果
CTCs 陽性鑒定結果為 DAPI（+）CD45（–）CEP8（+） CEP17（–）、DAPI（+）CD45（–）CEP8（–） CEP17（+）、DAPI（+）CD45（–）CEP8 （+） CEP17（+），見圖 1a-1c；陰性結果見圖 1d。胃癌組患者外周靜脈血中共 94 例檢出 CTCs；胃良性病變組患者外周靜脈血中共 11 例檢出 CTCs。
圖1
CTCs 的陽性鑒定結果（熒光顯微鏡 ×400）
a：DAPI（+）CD45（–）CEP8（+）CEP17（–）；b：DAPI（+）CD45（–）CEP8（–）CEP17（+）；c：DAPI（+）CD45（–）CEP8（+）CEP17（+）；d：DAPI（+）CD45（+）CEP8（–）CEP17（–）
2.2 2 組患者空腹外周靜脈血中 CTCs 和腫瘤標志物 CEA、CA19-9、CA125 在診斷胃癌中的 ROC 曲線結果
選取最佳臨界值 2 個 CTCs/4 mL 血為陽性，此時 CTCs 診斷胃癌的敏感度為 89.0%，特異度為 89.5%，此時的約登指數最大（0.785）。因此，設定 CTCs 截斷值為 2 個 CTCs/4 mL 血，將胃癌患者分為高表達組（CTCs≥2 個 CTCs/4 mL 血）和低表達組（CTCs<2 個 CTCs/4 mL 血），結果顯示，外周靜脈血 CTCs 陽性率在胃癌組為 89.0%（89/100），在胃良性病變組為 10.5%（4/38），胃癌組外周靜脈血 CTCs 陽性率明顯高于胃良性病變組，差異有統計學意義（P<0.001）。血清標志物 CEA、CA19-9、CA125 在診斷胃癌時的敏感度分別為 23%、30%、10%，特異度分別為 97.4%、92.1%、94.7%；對相應的ROC曲線下面積分別為 0.711 ［95%CI（0.621，0.801）］、0.666 ［95%CI（0.573，0.759）］及0.551 ［95%CI（0.445，0.657）]，CTCs 的ROC曲線下面積為 0.935 ［95%CI（0.894，0.976）］，其診斷胃癌的價值明顯優于 CEA、CA19-9 和 CA125，見圖 2a。
圖2
示 CTCs 及腫瘤標志物 CEA、CA19-9 和 CA-125 診斷胃癌的 ROC 曲線（a）及胃癌患者術前外周靜脈血中 CTCs 水平與患者術后無進展生存期的關系（b）
2.3 胃癌患者外周靜脈血中 CTCs 水平與患者臨床病理特征的關系
胃癌患者外周靜脈血中 CTCs 水平與腫瘤浸潤深度（χ2=6.945，P=0.017）、淋巴結轉移（χ2=5.274，P=0.038）及 TNM 分期（χ2=6.659，P=0.016）有關，而與患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度及有無脈管癌栓無關（P>0.050），見表 1。
表1
胃癌患者外周靜脈血中 CTCs 水平與患者臨床病理特征的關系（例）
2.4 胃癌患者術前外周靜脈血中 CTCs 水平與患者術后無進展生存期的關系
100 例胃癌患者中有 21 例術后復發，復發率為 21.0%，術后復發間隔時間 8～22 個月。Kaplan-Meier 生存分析顯示，胃癌患者外周靜脈血中 CTCs 低表達者術后無進展生存期顯著長于 CTCs 高表達者（χ2=5.172，P=0.023），提示術前外周靜脈血中 CTCs 的表達水平與胃癌患者術后腫瘤復發相關，見圖 2b。
3 討論
胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均處于較高水平。Chen 等[2]通過對中國國家中央癌癥登記處提供的數據，分析了來自 72 個人口癌癥登記中心（2009–2011 年）的數據，估計了到 2015 年我國胃癌新發病例將達到 429.2 萬例，死亡病例將達到 281.4 萬例，且農村地區人群的年齡標準化發病率和死亡率均顯著高于城市居民。
胃癌早期的癥狀多可表現為無明顯臨床癥狀，因此，當被確診時通常處于胃癌的中晚期。診斷時最常見的癥狀是食欲不振、消化不良、體質量減輕和腹痛，胃食管交界處或胃近端的腫瘤患者也可能出現吞咽困難。早期診斷手段主要依靠內鏡、CT、PET-CT、上消化道造影等檢查[4]。相對來說，早期胃癌患者經手術及輔助化療后的預后較中晚期患者預后良好。據文獻[14]報道，我國的早期胃癌診斷率不到 10%，而且因國民健康理念及醫療衛生條件不同而各地區的差異較大。所以，早期診斷、早期治療在提高胃癌患者的預后方面至關重要。
CTCs 的發現及應用為腫瘤的診斷和預后判斷提供了一種新的臨床依據成為可能。CellSearch 檢測系統檢測 CTCs 在胃癌患者中的陽性率為 69%[15]；微流控技術檢測胃癌患者 CTCs 陽性率為 75%[16]；本研究采用免疫磁微粒陰性富集并免疫熒光原位雜交鑒定 CTCs，避免了腫瘤細胞因發生上皮間質轉化導致上皮性的黏蛋白表達缺失而漏檢的問題，本研究中胃癌患者外周靜脈血中 CTCs 的陽性率為 89.0%，特異度為 89.5%，說明免疫磁微粒陰性富集聯合免疫熒光原位雜交技術檢測 CTCs，在胃癌的診斷中有較高的敏感度，相對于胃癌患者血清腫瘤標志物 CEA、CA19-9、CA125，CTCs 對胃癌的診斷預測價值更優，但其特異度較血清腫瘤標志物低，因此，在臨床中若能將 CTCs 檢測聯合血清腫瘤標志物檢測可能有助于提高胃癌診斷的敏感度和特異度。
有關 CTCs 與胃癌患者臨床病理特征關系的研究結論存在爭議。有研究[17-18]認為，CTCs 水平與腫瘤組織學分型和遠處轉移有關，而與 TNM 分期、淋巴結轉移等無關；也有研究[19-20]顯示，CTCs 水平與胃癌 TNM 分期、淋巴結轉移、遠處轉移均無關。本研究中 CTCs 水平與胃癌患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期有關。分析其原因可能是由于檢測技術的差異導致敏感度不同，產生信息偏倚。此外，本研究納入了 100 例胃癌患者作為研究對象，進行長達 30 個月的專人隨訪，樣本量大，患者信息齊全，隨訪數據可靠。
有學者[15, 21]認為，CTCs 是判斷進展期胃癌無瘤生存期的獨立預測指標；本研究中胃癌患者 CTCs 低表達者的無進展生存期顯著高于高表達者，提示術前 CTCs 的檢測可以預測胃癌患者術后腫瘤復發的風險及預后。
本研究的不足之處在于本研究是一項回顧性研究且樣本量較少，可能存在選擇偏倚和混雜偏倚；此外，缺少術后及化療前后患者血清 CTCs 的變化情況，可能導致混雜偏倚。
綜上，胃癌患者術前利用免疫磁微粒陰性富集法聯合免疫熒光原位雜交技術行 CTCs 檢測的敏感度較高，若結合腫瘤血清學標志物檢測可能會提高診斷特異度，可作為腫瘤臨床分期及患者術后腫瘤復發風險評估的一項預測指標，對臨床工作具有一定的指導意義。
胃癌是全球第 5 大常見的惡性腫瘤，也是全球第 3 大癌癥死亡原因[1]；2015 年中國胃癌新發病例約為 67.9 萬例，死亡病例約為 49.8 萬例[2]。患者被診斷為胃癌時只有 23% 的胃癌患者是局限性的，34% 的病例已經發生轉移，32% 的病例已發生淋巴結轉移[3]。胃癌發病早期一般多無癥狀，被確診時患者多屬晚期[4]。早期胃癌患者的 5 年生存率可達 90% 以上，而晚期胃癌患者的 5 年生存率僅為 25%～30%[5-6]。盡管手術、化療和其他治療方法在胃癌患者的治療中不斷取得進展，但胃癌患者的預后仍較差，其主要原因是胃癌的復發和轉移，故胃癌的早期診斷、早期治療在提高胃癌患者預后方面起著關鍵作用。循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是指因自發或診療操作過程中由原發灶或轉移灶脫落進入外周血液循環系統或者淋巴系統的腫瘤細胞[7-9]。腫瘤的侵襲、轉移是在腫瘤微環境中由多種分子參與、通過多種信號通路、涉及腫瘤細胞從原發灶或轉移灶脫落、上皮間質轉化、細胞外基質降解、浸潤穿透基底膜、遠處轉移等多步驟、多環節的復雜過程。CTCs 的產生在腫瘤的侵襲、轉移過程中扮演了重要的角色。CTCs 的檢測被美國 FDA 批準用于轉移性乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌的臨床診斷和療效評估[10-12]。目前 CTCs 的檢測用于胃癌的診治方面應用較少，本研究旨在通過檢測胃癌患者術前清晨空腹外周靜脈血中的 CTCs，探討其與胃癌患者的臨床病理特征及預后的關系。
1 資料與方法
1.1 納入和排除標準
1.1.1 納入標準
胃癌組：① 符合中華人民共和國衛生部頒布的《中華人民共和國衛生行業標準》（WS316-2010）中的“胃癌診斷標準”[13]的胃癌患者；② 術前未行新輔助化療及其他任何抗腫瘤治療；③ 患者不伴有其他器官惡性腫瘤；④ 腫瘤在接受手術時無明確廣泛轉移且行胃癌 D2 根治手術；⑤ 術后按期進行標準的 FOLFOX6 方案化療；⑥ 患者病歷資料齊全。胃良性病變組：① 同期經病理診斷確診為胃部良性病變患者（包括潰瘍、炎癥、出血）；② 既往無惡性腫瘤病史；③ 一般資料如性別和年齡與胃癌組無明顯差異的患者。本研究經筆者所在醫院倫理委員會批準。
1.1.2 排除標準
① 術后失訪的患者；② 術后行放療、免疫治療、靶向治療等可能對研究結果產生影響的情況。
1.2 研究對象
選取就診于中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院 2015 年 8 月至 2016 年 12 月期間經組織病理學證實為胃癌且行胃癌 D2 根治術的患者 100 例（胃癌組），其中男 67 例，女 33 例；年齡（58±10）歲。選取同時期就診于筆者所在醫院的胃良性病變患者 38 例作為對照（胃良性病變組），其中男 21 例，女 17 例；年齡（59±11）歲。2 組患者在年齡和性別方面比較差異無統計學意義（P>0.050）。所有患者的手術方式、術后病理組織學檢查或 TNM 分期均按日本第 15 版《胃癌處理規約》規定施行。
1.3 主要試劑和儀器
試劑：ACD 抗凝采血管購自美國 BD 公司；人外周血白細胞去除試劑盒及人外周血 CTCs 鑒別試劑盒均購自北京萊爾生物醫藥科技有限公司。儀器：低速大容量離心機購自山海安亭飛鴿公司；原位雜交儀購自賽默飛世爾科技中國有限公司；熒光顯微鏡購自奧林巴斯中國有限公司；載玻片購自丹麥 DAKO 公司。
1.4 CTCs 的檢測方法
抽取患者清晨空腹肘正中靜脈血 7 mL，并用 ACD 抗凝劑抗凝，24 h 內采用免疫磁微粒陰性富集法聯合免疫熒光原位雜交技術檢測 CTCs。
1.4.1 CTCs 的陰性富集
① 取 4 mL 全血標本加入離心管中，用 CS1 緩沖液補充到 45 mL，在室溫下離心 5 min（650×g），吸去上清液，留 10 mL 于離心管，輕搖離心管混勻沉淀細胞。② 加 CS2 至 45 mL，將離心管置于室溫 8 min，于垂直混勻儀混勻后再離心 5 min（650×g），棄去上清液至 500 μL；輕搖離心管混勻沉淀細胞后補加 CS1 緩沖液至 5 mL。③ 適量的磁微粒（150 μL/人份）混懸液至 2 mL 離心管中，加入 1 mL CS1 緩沖液輕柔吹打混勻，于磁力架上靜置 1 min，棄去上清液。重復洗滌 3 次后，用 CS1 重懸磁微粒至 150 μL。將洗滌好的磁微粒保存在試管架上備用。④ 將 ② 中處理好的樣本緩慢加入磁微粒，調節搖床搖速至 120 次/分，室溫下搖動 20 min。⑤ 先于 5 mL 新的離心管中加入3 mL CS3 緩沖液，將④ 中的所有液體輕輕疊加到 CS3 頂層，離心 5 min（300×g）。⑥ 離心后可見 3 層溶液，輕柔吸取最上面的 2 層溶液，移至 1 個新的 15 mL 離心管中，加入 CS1 緩沖液至 14 mL，輕柔顛倒混勻 3 次后再離心 5 min（950×g），棄上清液至 300 μL，加入 1 mL CS1緩沖液，重懸沉淀細胞。⑦ 將標本轉移至新的 2 mL 離心管中，靠于磁力架上 2～3 min，將液體分別轉移至新的 15 mL 離心管中，離心 3 min（2 070×g），棄去上清液至 100 μL，加入 100 μL CF1 固定液，充分輕柔吹打混勻 10 次以上，涂片至標本框（免疫組化筆畫框）中。
1.4.2 CTCs 的鑒定
免疫熒光原位雜交鑒定：① 預固定：CF2 預固定 8 min；② 老化：37 ℃ 預熱的 2×SSC 老化 10 min；③ 脫水：75%、85%、100% 的梯度乙醇脫水，各 2 min；④ 雜交：10 U 探針（CEP17/CEP8），蓋片，75 ℃ 變性 5 min，37 ℃ 雜交 1.5 h；⑤ 洗片：43 ℃ 預熱的 50% FA 中甩掉蓋玻片，并溫浴 15 min；⑥ 洗滌：室溫 2×SSC 中 5 min，2 次；⑦ 抗體孵育：滴加抗體（CD45），室溫孵育 1 h；⑧ 洗片：0.2% 的 BSA 洗標本區 2 次；⑨ 復染：10 μL 0.1% 的 4′6-聯脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（4′6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride，DAPI），蓋片，待熒光顯微鏡下讀片。
1.4.3 CTCs 的陽性結果判定
① DAPI（+）CD45（–）CEP8 多倍體（+）CEP17 二倍體（–）；② DAPI（+）CD45（–）CEP8（–） CEP17（+）；③ DAPI（+）CD45（–）CEP8（+） CEP17（+）。DAPI 標記細胞核呈藍色，CD45 標記白細胞呈紅色，CEP8 標記 8 號染色體著絲粒呈橙色和 CEP17 標記 17 號染色體著絲粒呈綠色，正常細胞均為二倍體。
1.5 腫瘤標志物的檢測
胃癌和胃良性病變患者入院后行常規腫瘤標志物 CEA、CA19-9 及 CA125 的檢測并收集數據，檢測結果以 CEA>6.0 μg/L、CA19-9>27 U/mL、CA125>35 U/mL 判定為高表達。
1.6 隨訪及預后監測
定期對 100 例胃癌術后患者進行嚴密的隨訪，對出院患者每 3 個月進行 1 次門診或電話隨訪。術后無瘤生存期為行手術治療后至疾病復發或末次隨訪時間（2017 年 12 月 20 日）。時間以月為單位統計，詳細記錄胃癌患者的一般資料（如性別、年齡）、術后組織病理學資料（如腫瘤部位、浸潤深度、分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移、脈管癌栓）及隨訪資料（如無進展生存期）。患者復發的判斷標準：病理活檢結果證實和（或）明確的影像學檢查結果證實。
1.7 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件對數據進行分析。采用 χ2 檢驗或 Fisher 確切概率法分析 CTCs 水平與胃癌患者臨床病理特征之間的關系。采用受試者工作特征曲線（receiver operating characterisitic curve，ROC）分析 CTCs 的診斷特異度和敏感度。采用 Kaplan-Meier 法分析比較不同 CTCs 水平患者的無進展生存期，采用 log-rank 法檢驗。檢驗水準 α=0.050。
2 結果
2.1 CTCs 的陽性鑒定結果
CTCs 陽性鑒定結果為 DAPI（+）CD45（–）CEP8（+） CEP17（–）、DAPI（+）CD45（–）CEP8（–） CEP17（+）、DAPI（+）CD45（–）CEP8 （+） CEP17（+），見圖 1a-1c；陰性結果見圖 1d。胃癌組患者外周靜脈血中共 94 例檢出 CTCs；胃良性病變組患者外周靜脈血中共 11 例檢出 CTCs。
圖1
CTCs 的陽性鑒定結果（熒光顯微鏡 ×400）
a：DAPI（+）CD45（–）CEP8（+）CEP17（–）；b：DAPI（+）CD45（–）CEP8（–）CEP17（+）；c：DAPI（+）CD45（–）CEP8（+）CEP17（+）；d：DAPI（+）CD45（+）CEP8（–）CEP17（–）
2.2 2 組患者空腹外周靜脈血中 CTCs 和腫瘤標志物 CEA、CA19-9、CA125 在診斷胃癌中的 ROC 曲線結果
選取最佳臨界值 2 個 CTCs/4 mL 血為陽性，此時 CTCs 診斷胃癌的敏感度為 89.0%，特異度為 89.5%，此時的約登指數最大（0.785）。因此，設定 CTCs 截斷值為 2 個 CTCs/4 mL 血，將胃癌患者分為高表達組（CTCs≥2 個 CTCs/4 mL 血）和低表達組（CTCs<2 個 CTCs/4 mL 血），結果顯示，外周靜脈血 CTCs 陽性率在胃癌組為 89.0%（89/100），在胃良性病變組為 10.5%（4/38），胃癌組外周靜脈血 CTCs 陽性率明顯高于胃良性病變組，差異有統計學意義（P<0.001）。血清標志物 CEA、CA19-9、CA125 在診斷胃癌時的敏感度分別為 23%、30%、10%，特異度分別為 97.4%、92.1%、94.7%；對相應的ROC曲線下面積分別為 0.711 ［95%CI（0.621，0.801）］、0.666 ［95%CI（0.573，0.759）］及0.551 ［95%CI（0.445，0.657）]，CTCs 的ROC曲線下面積為 0.935 ［95%CI（0.894，0.976）］，其診斷胃癌的價值明顯優于 CEA、CA19-9 和 CA125，見圖 2a。
圖2
示 CTCs 及腫瘤標志物 CEA、CA19-9 和 CA-125 診斷胃癌的 ROC 曲線（a）及胃癌患者術前外周靜脈血中 CTCs 水平與患者術后無進展生存期的關系（b）
2.3 胃癌患者外周靜脈血中 CTCs 水平與患者臨床病理特征的關系
胃癌患者外周靜脈血中 CTCs 水平與腫瘤浸潤深度（χ2=6.945，P=0.017）、淋巴結轉移（χ2=5.274，P=0.038）及 TNM 分期（χ2=6.659，P=0.016）有關，而與患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度及有無脈管癌栓無關（P>0.050），見表 1。
表1
胃癌患者外周靜脈血中 CTCs 水平與患者臨床病理特征的關系（例）
2.4 胃癌患者術前外周靜脈血中 CTCs 水平與患者術后無進展生存期的關系
100 例胃癌患者中有 21 例術后復發，復發率為 21.0%，術后復發間隔時間 8～22 個月。Kaplan-Meier 生存分析顯示，胃癌患者外周靜脈血中 CTCs 低表達者術后無進展生存期顯著長于 CTCs 高表達者（χ2=5.172，P=0.023），提示術前外周靜脈血中 CTCs 的表達水平與胃癌患者術后腫瘤復發相關，見圖 2b。
3 討論
胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均處于較高水平。Chen 等[2]通過對中國國家中央癌癥登記處提供的數據，分析了來自 72 個人口癌癥登記中心（2009–2011 年）的數據，估計了到 2015 年我國胃癌新發病例將達到 429.2 萬例，死亡病例將達到 281.4 萬例，且農村地區人群的年齡標準化發病率和死亡率均顯著高于城市居民。
胃癌早期的癥狀多可表現為無明顯臨床癥狀，因此，當被確診時通常處于胃癌的中晚期。診斷時最常見的癥狀是食欲不振、消化不良、體質量減輕和腹痛，胃食管交界處或胃近端的腫瘤患者也可能出現吞咽困難。早期診斷手段主要依靠內鏡、CT、PET-CT、上消化道造影等檢查[4]。相對來說，早期胃癌患者經手術及輔助化療后的預后較中晚期患者預后良好。據文獻[14]報道，我國的早期胃癌診斷率不到 10%，而且因國民健康理念及醫療衛生條件不同而各地區的差異較大。所以，早期診斷、早期治療在提高胃癌患者的預后方面至關重要。
CTCs 的發現及應用為腫瘤的診斷和預后判斷提供了一種新的臨床依據成為可能。CellSearch 檢測系統檢測 CTCs 在胃癌患者中的陽性率為 69%[15]；微流控技術檢測胃癌患者 CTCs 陽性率為 75%[16]；本研究采用免疫磁微粒陰性富集并免疫熒光原位雜交鑒定 CTCs，避免了腫瘤細胞因發生上皮間質轉化導致上皮性的黏蛋白表達缺失而漏檢的問題，本研究中胃癌患者外周靜脈血中 CTCs 的陽性率為 89.0%，特異度為 89.5%，說明免疫磁微粒陰性富集聯合免疫熒光原位雜交技術檢測 CTCs，在胃癌的診斷中有較高的敏感度，相對于胃癌患者血清腫瘤標志物 CEA、CA19-9、CA125，CTCs 對胃癌的診斷預測價值更優，但其特異度較血清腫瘤標志物低，因此，在臨床中若能將 CTCs 檢測聯合血清腫瘤標志物檢測可能有助于提高胃癌診斷的敏感度和特異度。
有關 CTCs 與胃癌患者臨床病理特征關系的研究結論存在爭議。有研究[17-18]認為，CTCs 水平與腫瘤組織學分型和遠處轉移有關，而與 TNM 分期、淋巴結轉移等無關；也有研究[19-20]顯示，CTCs 水平與胃癌 TNM 分期、淋巴結轉移、遠處轉移均無關。本研究中 CTCs 水平與胃癌患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期有關。分析其原因可能是由于檢測技術的差異導致敏感度不同，產生信息偏倚。此外，本研究納入了 100 例胃癌患者作為研究對象，進行長達 30 個月的專人隨訪，樣本量大，患者信息齊全，隨訪數據可靠。
有學者[15, 21]認為，CTCs 是判斷進展期胃癌無瘤生存期的獨立預測指標；本研究中胃癌患者 CTCs 低表達者的無進展生存期顯著高于高表達者，提示術前 CTCs 的檢測可以預測胃癌患者術后腫瘤復發的風險及預后。
本研究的不足之處在于本研究是一項回顧性研究且樣本量較少，可能存在選擇偏倚和混雜偏倚；此外，缺少術后及化療前后患者血清 CTCs 的變化情況，可能導致混雜偏倚。
綜上，胃癌患者術前利用免疫磁微粒陰性富集法聯合免疫熒光原位雜交技術行 CTCs 檢測的敏感度較高，若結合腫瘤血清學標志物檢測可能會提高診斷特異度，可作為腫瘤臨床分期及患者術后腫瘤復發風險評估的一項預測指標，對臨床工作具有一定的指導意義。
