引用本文： 張麒, 艾良, 代佑果. 長鏈非編碼 RNA 母系表達基因 3 多態性與胃癌關系的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(11): 1323-1326. doi: 10.7507/1007-9424.201805074 復制
長鏈非編碼 RNA（lncRNA）是一類長度超過 200 個核苷酸的非編碼 RNA，以往認為是轉錄過程中的“噪音”，而近年來發現其具有轉錄、轉錄后調控等作用，參與多種腫瘤疾病的發生及發展[1-6]。母系表達基因 3（maternally expressed gene 3，MEG3）屬于 lncRNA 印記基因，位于人類第 14 號染色體長臂 3 區 2 帶 2 亞帶。在人類的多種正常組織中均表達 MEG3，然而在胃癌等腫瘤組織中 MEG3 表達卻明顯降低，其通過多種途徑介導腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移，并與 TNM 分期、腫瘤大小、預后等臨床特征密切相關[7-14]。單核苷酸多態性可能影響基因表達，進而影響個體對于疾病的易感性[15-16]。近年來研究[17-18]顯示，MEG3 多態性與結直腸癌和神經母細胞瘤的風險有關。本研究運用病例-對照研究調查 MEG3 兩個標簽單核苷酸多態性（rs7158663 和 rs4081134）與中國漢族人群胃癌發生的關系，為鑒定胃癌新的易感基因提供依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選擇 2013 年 3 月至 2017 年 10 月期間于云南省腫瘤醫院住院治療的胃癌患者 172 例，其納入標準：組織病理學確診為胃癌患者，否認腫瘤家族史，漢族個體；排除標準：胃癌復發者，其他器官腫瘤轉移至胃而非原發病灶者，由于 MEG3 參與心、肺、肝、腎等重要臟器炎癥性病變或腫瘤的發生及發展[19-27]，為了避免混雜因素對 MEG3 多態性的影響，排除合并以上病變者。選擇同期到云南省腫瘤醫院體檢中心進行健康體檢個體 224 例作為對照（研究前運用統計學方法進行了樣本含量估算，檢驗效能大于80%時需要樣本量220例，故選用224例），對照人群均為漢族，無腫瘤家族史、急慢性胃炎等其他疾病。所有研究對象簽署知情同意書后采集外周靜脈血 2～3 mL。
1.2 主要試劑與儀器
全血基因組 DNA 提取試劑盒（天根生化科技公司，北京），TaqMan 探針（rs7158663 和 rs4081134 探針編號分別為 C_9693465_10 和 C_1259786_10）和 2×反應混合物（ABI 公司，美國），ABI 7500 Fast 實時熒光定量 PCR 儀（ABI 公司，美國）。
1.3 DNA 提取及基因分型
采用全血基因組 DNA 提取試劑盒提取 DNA，具體操作按照試劑盒說明進行。TaqMan 探針法進行基因分型，10 μL PCR 反應體系如下：DNA 模板 20 ng，2×反應混合物 5.0 μL，TaqMan 探針各 0.25 μL，無菌去離子水補足 10 μL。ABI 7500 Fast 實時熒光定量 PCR 儀上運行以下程序：95 ℃ 預變性 10 min；95 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 退火 60 s，40 個循環。結果判斷：紅色熒光均為 GG 基因型，綠色熒光均為 AA 基因型，藍色熒光均為 AG 基因型。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 13.0 統計軟件包對數據進行分析。胃癌組和對照組一般特征比較，包括年齡和性別，分別采用 t 檢驗和 χ2 檢驗；Hardy-Weinberg 遺傳平衡和 MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌的關系分析均采用 χ2 檢驗，優勢比（OR）和 95% 置信區間（CI）用于評價多態性位點與胃癌的風險度，多重比較，校正檢驗水準 α=0.017。
2 結果
2.1 胃癌組和對照組一般特征及 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗
胃癌組男 117 例，女 55 例；年齡37~84歲、（59±13）歲；臨床Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期患者分別為 82 例和 90 例；高中分化癌和低分化癌分別為 124 例和 48 例；淋巴結有轉移 67 例，無轉移 105 例；Lauren 分型腸型 82 例，彌漫型 56 例，混合型 34 例；幽門螺旋桿菌感染陽性 153 例，陰性 19 例。對照組男 157 例，女 67 例；年齡28~75歲、（58±10）歲。胃癌組和對照組年齡和性別比較差異無統計學意義（t=–0.59，P=0.560；χ2=0.20，P=0.660）。胃癌組和對照組 MEG3 rs7158663 和 rs4081134 基因型分布見表 1，經 χ2 檢驗，符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡（P>0.05），提示 2 組研究對象不存在入選偏倚，具有可比性。
2.2 MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性基因型分布比較
MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌的關系見表 1。從表 1 可見，MEG3 rs7158663 和 rs4081134在胃癌組和對照組中均檢測到 GG、AG 和 AA 3 種基因型，rs7158663 AG+AA 基因型和A 等位基因分布頻率在胃癌組均明顯高于對照組 ［校正OR=1.71，95%CI為（1.14，2.56），P=0.010；校正OR=1.58，95%CI為（1.15，2.19），P=0.005］，而 rs4081134 在胃癌組和對照組間的基因型和等位基因分布頻率比較差異均無統計學意義（P>0.017）。
表1
MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌的關系［例（%）］
2.3 MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌臨床特征的關系
MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌臨床特征的關系見表 2。從表 2 可見，經 χ2 檢驗并校正年齡和性別，結果顯示，MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌患者的年齡、性別、臨床分期、分化程度、淋巴結轉移、Lauren 分型和幽門螺旋桿菌感染狀態均無關（P>0.05）。
表2
MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌臨床特征的關系［例（%）］
3 討論
lncRNAs 在多種疾病中存在差異性表達，雖然不編碼蛋白，但是具有重要的調控功能。MEG3，一種研究較為廣泛的 lncRNA，在包括胃癌等多種腫瘤中呈低表達[7-10, 13-14]。過表達 MEG3 可抑制細胞增殖、侵襲、遷移、上皮-間質轉化并促進細胞凋亡，這一作用通過多種途徑調節完成，包括：① 作為競爭性內源 miRNA 競爭結合 miR-181 上調其靶基因 Bcl-2；② 調節 miR-21 上調 E-鈣黏蛋白，下調 N-鈣黏蛋白、鋅指轉錄因子 Snail 和 β-連環素的表達；③ p53 信號通路[8-10, 14]。提示 MEG3 可能作為抑癌基因參與胃癌的發生及發展。
由于遺傳多態性可影響基因表達，進而影響疾病的易感性，因此，其成為多年來的研究熱點[15-16]。關于 MEG3 遺傳多態性與腫瘤的關系，Cao 等[17]調查了 5 個標簽單核苷酸多態性在 518 例結直腸癌和 527 例對照人群中的分布，發現 MEG3 rs7158663 AA 基因型攜帶者結直腸癌的發病風險增加了 1.96 倍，這一高風險見于 60 歲以下和具有家族史結直腸癌患者。Zhuo 等[18]調查了 2 個標簽單核苷酸多態性（rs7158663 和 rs4081134）在 392 例兒童神經母細胞瘤和 783 例對照組中的分布，盡管在整體分析中 2 組間差異無統計學意義，但是亞組分析顯示 rs4081134 AG+AA 基因型攜帶者更易發展為臨床 Ⅲ～Ⅳ 期。查閱文獻，未見 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌的相關性研究報道。本研究運用病例-對照研究分析了上述 2 個多態性位點在 172 例胃癌患者和 224 例健康對照人群中的分布，發現 rs7158663 AG+AA 基因型和 A 等位基因攜帶者胃癌的發病風險分別增加了 1.71 和 1.58 倍。由于本研究是初步探索性研究，納入樣本量較小，可能沒有足夠的檢驗效能，尤其在分層分析時，未發現 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌臨床特征有關。較小的樣本量造成隨訪有效數據極少，無法進行生存分析以明確 MEG3 多態性與胃癌預后的關系。此外，本研究樣本均來源于同一單位、單一民族。因此，未來有必要開展多中心、大樣本和多種族的合作研究驗證本結果，并分析其與預后的關系。
綜上，本研究運用 TaqMan 探針法調查了 MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性在中國漢族胃癌患者和健康對照人群中的頻率分布，發現攜帶 rs7158663 AG+AA 基因型和 A 等位基因個體罹患胃癌的風險顯著增加，提示可能是中國漢族人群胃癌的易感基因之一，關于其作用機制有待進一步研究。
長鏈非編碼 RNA（lncRNA）是一類長度超過 200 個核苷酸的非編碼 RNA，以往認為是轉錄過程中的“噪音”，而近年來發現其具有轉錄、轉錄后調控等作用，參與多種腫瘤疾病的發生及發展[1-6]。母系表達基因 3（maternally expressed gene 3，MEG3）屬于 lncRNA 印記基因，位于人類第 14 號染色體長臂 3 區 2 帶 2 亞帶。在人類的多種正常組織中均表達 MEG3，然而在胃癌等腫瘤組織中 MEG3 表達卻明顯降低，其通過多種途徑介導腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移，并與 TNM 分期、腫瘤大小、預后等臨床特征密切相關[7-14]。單核苷酸多態性可能影響基因表達，進而影響個體對于疾病的易感性[15-16]。近年來研究[17-18]顯示，MEG3 多態性與結直腸癌和神經母細胞瘤的風險有關。本研究運用病例-對照研究調查 MEG3 兩個標簽單核苷酸多態性（rs7158663 和 rs4081134）與中國漢族人群胃癌發生的關系，為鑒定胃癌新的易感基因提供依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選擇 2013 年 3 月至 2017 年 10 月期間于云南省腫瘤醫院住院治療的胃癌患者 172 例，其納入標準：組織病理學確診為胃癌患者，否認腫瘤家族史，漢族個體；排除標準：胃癌復發者，其他器官腫瘤轉移至胃而非原發病灶者，由于 MEG3 參與心、肺、肝、腎等重要臟器炎癥性病變或腫瘤的發生及發展[19-27]，為了避免混雜因素對 MEG3 多態性的影響，排除合并以上病變者。選擇同期到云南省腫瘤醫院體檢中心進行健康體檢個體 224 例作為對照（研究前運用統計學方法進行了樣本含量估算，檢驗效能大于80%時需要樣本量220例，故選用224例），對照人群均為漢族，無腫瘤家族史、急慢性胃炎等其他疾病。所有研究對象簽署知情同意書后采集外周靜脈血 2～3 mL。
1.2 主要試劑與儀器
全血基因組 DNA 提取試劑盒（天根生化科技公司，北京），TaqMan 探針（rs7158663 和 rs4081134 探針編號分別為 C_9693465_10 和 C_1259786_10）和 2×反應混合物（ABI 公司，美國），ABI 7500 Fast 實時熒光定量 PCR 儀（ABI 公司，美國）。
1.3 DNA 提取及基因分型
采用全血基因組 DNA 提取試劑盒提取 DNA，具體操作按照試劑盒說明進行。TaqMan 探針法進行基因分型，10 μL PCR 反應體系如下：DNA 模板 20 ng，2×反應混合物 5.0 μL，TaqMan 探針各 0.25 μL，無菌去離子水補足 10 μL。ABI 7500 Fast 實時熒光定量 PCR 儀上運行以下程序：95 ℃ 預變性 10 min；95 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 退火 60 s，40 個循環。結果判斷：紅色熒光均為 GG 基因型，綠色熒光均為 AA 基因型，藍色熒光均為 AG 基因型。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 13.0 統計軟件包對數據進行分析。胃癌組和對照組一般特征比較，包括年齡和性別，分別采用 t 檢驗和 χ2 檢驗；Hardy-Weinberg 遺傳平衡和 MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌的關系分析均采用 χ2 檢驗，優勢比（OR）和 95% 置信區間（CI）用于評價多態性位點與胃癌的風險度，多重比較，校正檢驗水準 α=0.017。
2 結果
2.1 胃癌組和對照組一般特征及 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗
胃癌組男 117 例，女 55 例；年齡37~84歲、（59±13）歲；臨床Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期患者分別為 82 例和 90 例；高中分化癌和低分化癌分別為 124 例和 48 例；淋巴結有轉移 67 例，無轉移 105 例；Lauren 分型腸型 82 例，彌漫型 56 例，混合型 34 例；幽門螺旋桿菌感染陽性 153 例，陰性 19 例。對照組男 157 例，女 67 例；年齡28~75歲、（58±10）歲。胃癌組和對照組年齡和性別比較差異無統計學意義（t=–0.59，P=0.560；χ2=0.20，P=0.660）。胃癌組和對照組 MEG3 rs7158663 和 rs4081134 基因型分布見表 1，經 χ2 檢驗，符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡（P>0.05），提示 2 組研究對象不存在入選偏倚，具有可比性。
2.2 MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性基因型分布比較
MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌的關系見表 1。從表 1 可見，MEG3 rs7158663 和 rs4081134在胃癌組和對照組中均檢測到 GG、AG 和 AA 3 種基因型，rs7158663 AG+AA 基因型和A 等位基因分布頻率在胃癌組均明顯高于對照組 ［校正OR=1.71，95%CI為（1.14，2.56），P=0.010；校正OR=1.58，95%CI為（1.15，2.19），P=0.005］，而 rs4081134 在胃癌組和對照組間的基因型和等位基因分布頻率比較差異均無統計學意義（P>0.017）。
表1
MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌的關系［例（%）］
2.3 MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌臨床特征的關系
MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌臨床特征的關系見表 2。從表 2 可見，經 χ2 檢驗并校正年齡和性別，結果顯示，MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌患者的年齡、性別、臨床分期、分化程度、淋巴結轉移、Lauren 分型和幽門螺旋桿菌感染狀態均無關（P>0.05）。
表2
MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌臨床特征的關系［例（%）］
3 討論
lncRNAs 在多種疾病中存在差異性表達，雖然不編碼蛋白，但是具有重要的調控功能。MEG3，一種研究較為廣泛的 lncRNA，在包括胃癌等多種腫瘤中呈低表達[7-10, 13-14]。過表達 MEG3 可抑制細胞增殖、侵襲、遷移、上皮-間質轉化并促進細胞凋亡，這一作用通過多種途徑調節完成，包括：① 作為競爭性內源 miRNA 競爭結合 miR-181 上調其靶基因 Bcl-2；② 調節 miR-21 上調 E-鈣黏蛋白，下調 N-鈣黏蛋白、鋅指轉錄因子 Snail 和 β-連環素的表達；③ p53 信號通路[8-10, 14]。提示 MEG3 可能作為抑癌基因參與胃癌的發生及發展。
由于遺傳多態性可影響基因表達，進而影響疾病的易感性，因此，其成為多年來的研究熱點[15-16]。關于 MEG3 遺傳多態性與腫瘤的關系，Cao 等[17]調查了 5 個標簽單核苷酸多態性在 518 例結直腸癌和 527 例對照人群中的分布，發現 MEG3 rs7158663 AA 基因型攜帶者結直腸癌的發病風險增加了 1.96 倍，這一高風險見于 60 歲以下和具有家族史結直腸癌患者。Zhuo 等[18]調查了 2 個標簽單核苷酸多態性（rs7158663 和 rs4081134）在 392 例兒童神經母細胞瘤和 783 例對照組中的分布，盡管在整體分析中 2 組間差異無統計學意義，但是亞組分析顯示 rs4081134 AG+AA 基因型攜帶者更易發展為臨床 Ⅲ～Ⅳ 期。查閱文獻，未見 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌的相關性研究報道。本研究運用病例-對照研究分析了上述 2 個多態性位點在 172 例胃癌患者和 224 例健康對照人群中的分布，發現 rs7158663 AG+AA 基因型和 A 等位基因攜帶者胃癌的發病風險分別增加了 1.71 和 1.58 倍。由于本研究是初步探索性研究，納入樣本量較小，可能沒有足夠的檢驗效能，尤其在分層分析時，未發現 rs7158663 和 rs4081134 多態性與胃癌臨床特征有關。較小的樣本量造成隨訪有效數據極少，無法進行生存分析以明確 MEG3 多態性與胃癌預后的關系。此外，本研究樣本均來源于同一單位、單一民族。因此，未來有必要開展多中心、大樣本和多種族的合作研究驗證本結果，并分析其與預后的關系。
綜上，本研究運用 TaqMan 探針法調查了 MEG3 rs7158663 和 rs4081134 多態性在中國漢族胃癌患者和健康對照人群中的頻率分布，發現攜帶 rs7158663 AG+AA 基因型和 A 等位基因個體罹患胃癌的風險顯著增加，提示可能是中國漢族人群胃癌的易感基因之一，關于其作用機制有待進一步研究。
