引用本文： 喻晶, 周程繼, 程龍, 王攀. 胞內氯離子通道蛋白1與結腸癌關系的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(9): 1141-1145. doi: 10.7507/1007-9424.201801114 復制
胞內氯離子通道蛋白 1（chloride intracellular channel protein 1，CLIC1）是 p64 基因家族的成員之一，主要表達于細胞核，也可存在于細胞漿及細胞膜[1]。近年來較多研究表明，CLIC1 高表達于多種腫瘤組織中，其高表達常與腫瘤的發生及轉移有密切的關系，其亦參與結腸癌的進展過程。筆者現就 CLIC1 在結腸癌中的最新研究進展作一綜述。
1 CLIC1 的分子結構與特點
CLIC1 是第一個被發現的具有多種重要生理功能的人類氯離子通道蛋白家族中的一員，其基因定位于人染色體 6p21.3，其蛋白由 241 個氨基酸殘基組成，相對分子質量大小為 27 000，表達于細胞核、細胞漿及細胞膜中[1]。
CLIC1 具有可溶型和整合膜型兩種正常的形式，可溶型形式可自發轉化成整合膜型的形式，Hossain 等[2]的研究發現，這種轉換是由膜脂質組成特別是膽固醇以及外部因素如氧化作用和 pH 調節，然而目前尚不清楚調節 CLIC1 膜插入的精確生理機制，但其研究結果首次證實了 CLIC1 中的磷脂酰化膜兩種不同結構的取向取決于膽固醇的存在與否。
通過晶體結構分析發現，CLIC1 的晶體結構在 1.4 ?（0.14 nm）分辨率被確定；通過序列分析發現，CLIC1 晶體結構主要有 2 個疏水區，其中 N 末端有 α1 螺旋和 β2 折疊，C 末端為 α6 螺旋。通過人工雙層脂質膜和細胞脂質膜結構的研究[3]發現，CLIC1 的整合膜型形式中 C 末端在膜內側，N 末端是細胞膜結合的位點。CLIC1 的 C 末端與谷胱甘肽 S 轉移酶具有高度的同源性[4-5]；N 末端含有硫氧還原蛋白域，是高度保守區域，可折疊形成谷氧還原蛋白，谷氧還原蛋白的 Trp35 被認為是 CLIC1 蛋白的跨膜結構的起點位[6-7]。
2 CLIC1 的生物學功能和組織分布特點
2.1 CLIC1 的生物學功能
通過蛋白結構分析、點突變等研究方法進一步證實了離子通道蛋白可通過形變并相互結合形成寡聚體而錨定于細胞膜表面，從而發揮著離子通道的作用。CLIC1 表現出外向整流的單一電流電導，與鉀離子、鈉離子及其他陰離子來共同維持細胞膜電位的穩定[8-9]。
CLIC1 不僅通過離子通道，其還可能參與細胞內氧化應激、細胞周期調節、細胞凋亡、血管生成等過程。可溶型的 CLIC1 通過插入脂質雙分子層，從而形成跨膜蛋白[10]，此過程可能會受到細胞內環境所調控[11-12]，具體整合的過程可能與細胞內環境的 pH 值、激酶、氧化狀態、細胞周期等調節有關[11-15]。有研究[14-15]表明，細胞內 pH 值可明顯影響可溶型 CLIC1 構象的穩定性，pH 值的高低可改變蛋白質插入細胞膜的阻力（蛋白質插入）。也有研究[5, 11]表明，氧化環境下可溶型單體 CLIC1 可發生分子構象重排，其 Cys24 和 Cys59 可形成分子內二硫鍵，從而穩定重排的結構，跨膜區的分子進一步多聚化可以在細胞膜形成細胞膜通道[5]。還有研究[16]表明，CLIC1 的 N 末端所包含完整的谷胱甘肽結合域，即通過 Cys24 位點以共價鍵的形式來結合谷胱甘肽，在特定的條件下 CLIC1 發生形變暴露谷胱甘肽結合位點，可能通過未知的酶聯反應進一步形成寡聚體，插入脂質雙分子層后形成氯離子通道結構。此外，一些特定分子也可能影響 CLIC1 的功能，如膽固醇有促進 CLIC1 發生形變從而有利于這些分子插入細胞膜的脂質雙分子層的作用[17]。
2.2 CLIC1 的組織分布特點
近年來研究[18-19]發現，CLIC1 在進化過程中高度保守，其表達水平在物種間差異比較小，并存在于多種組織和器官里。對小鼠的研究[20]發現，CLIC1 的 mRNA 廣泛存在于各種組織中，尤其高表達于骨骼肌、腎臟和肝臟組織中。免疫組織化學檢測結果[21]發現，CLIC1 在氣管、膽囊、肝內膽管、胰腺管、近端腎小管等表面的單層柱狀上皮細胞表達尤為明顯，且存在于細胞的頂端，總體呈極化分布；在食管上皮細胞中 CLIC1 的表達以胞漿內膜為主，在骨骼肌則是彌漫性分布于細胞內胞漿及細胞器中，而在皮膚、消化道平滑肌、心臟、脾臟等組織器官中則表達較少。目前，尚無人體組織器官中的 CLIC1 表達譜的研究報道。
3 CLIC1 與腫瘤的相關研究
CLIC1 在多種惡性腫瘤組織中呈高表達，包括肺癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌、神經膠質瘤、鼻咽癌、胃癌、結直腸癌等，其在這些惡性腫瘤中的高表達與較差的臨床預后關系密切，CLIC1 可能成為惡性腫瘤判斷預后的重要指標之一。
Wang 等[22]發現，CLIC1 與肺腺癌患者的臨床分期及預后關系密切；有研究者[23]通過蛋白質組學分析方法發現，CLIC1 可能在乙型肝炎病毒發生肝癌的過程中發揮著一定的作用；同樣用蛋白質組學分析方法及免疫組織化學方法檢測結果[24-25]發現，CLIC1 在胃癌及卵巢癌組織中也呈較明顯的高表達；Setti 等[26]發現，CLIC1 在神經膠質瘤組織中的表達和病理分期呈明顯的正相關，與生存期則呈負相關；Chang 等[27]比較鼻咽癌患者血漿及其組織中的 CLIC1 表達，結果發現，CLIC1 在鼻咽癌組織和血漿中均呈高表達，因此提出，CLIC1 可能作為血漿分子標志物用于早期檢測鼻咽癌患者。
CLIC1 與更多腫瘤的關系有待更多的研究去進一步證實，或許 CLIC1 可作為腫瘤早期診斷的生物標志物。
4 CLIC1 與結腸癌相關研究
4.1 CLIC1 與結腸癌的發生
CLIC1 在結腸組織中表達上調且在結腸組織惡性轉化過程中起著重要作用。
Taguchi 等[28]發現，在結腸腺瘤和早期結直腸癌患者血漿及瘤組織中的表達明顯升高。楊小松等[29]研究結果顯示，CLIC1 在結直腸的正常黏膜組織、腺瘤組織和癌組織中的表達陽性率依次呈升高趨勢，結果提示，CLIC1 可能與結直腸組織惡性變有關。Petrova 等[30]的研究也提示，CLIC1 基因的過表達可能參與了結腸癌細胞的惡性轉化過程。
盡管有不少研究發現了 CLIC1 在結直腸癌中表達上調，但對于其在結直腸癌發生中的具體機制少有相關報道，有待未來進一步研究證實。
4.2 CLIC1 與結腸癌的轉移
細胞外基質降解和細胞形態改變遷移為惡性腫瘤轉移中兩個非常重要的過程，其主要受腫瘤微環境、腫瘤血管生成、細胞外基質降解、細胞黏附等因素影響[31-32]。CLIC1 在細胞膜上形成氯離子通道，而氯離子通道中的氯通道容積調控陰離子通道（volume-regulated anion/chloride channels，VRAC）在維持細胞容積中發揮著重要作用。近年來愈來愈多的證據[33-34]表明，VRAC 與腫瘤細胞的惡性生物學行為有關，其過高表達或激活可能促進腫瘤的轉移。
惡性腫瘤在轉移過程中會出現細胞形態的改變，通過細胞調節性體積縮小過程來改變細胞的體積，當細胞外基質降解后，體積縮小的癌細胞伸出偽足，從而突破細胞外基質，然后沿基底膜缺損處及狹窄的基底間隙穿過，繼而發生遠處轉移[35]。
有研究者[36]使用 CLIC1 特異性阻斷劑和 RNA 干擾 CLIC1 可明顯降低結腸癌細胞的遷移和侵襲能力，且發現 CLIC1 主要表達于結腸癌細胞膜，通過其氯離子通道功能介導從而調節結腸癌的轉移。王攀等[37]的研究發現，CLIC1 基因在結腸癌組織中表達上調明顯，其蛋白表達與癌組織浸潤程度、淋巴結轉移和 TNM 分期密切相關，從而證實了 CLIC1 與結腸癌轉移有關；該課題組的進一步研究[38]表明，CLIC1 可通過調節缺氧-復氧微環境中的活性氧簇/細胞外信號調節激酶途徑參與結腸癌的轉移。Gurski 等[39]發現，CLIC1 對于內皮細胞和腫瘤細胞中嵌入的纖維蛋白的三維基質的穩定性是至關重要的；偽足的穩定性與 CLIC1 和 β-3 整合素的相互作用有關；隨著 CLIC1 枯竭以及 β-3 整合素耗盡，肌球蛋白輕鏈激酶（MYLK）在細胞中減少，結果提示，CLIC1 對于整合素介導的肌動蛋白在植入纖維蛋白細胞中的重要作用。
以上這些研究結果表明，CLIC1 是腫瘤侵襲、轉移和血管生成的重要因素，但其參與結腸癌轉移的更多具體機制尚需進一步探索。
4.3 CLIC1 與結腸癌的治療
結腸癌在臨床上較易復發，大多數患者的死因并非原發腫瘤所致，而是死于轉移癌[40]。因此，針對其特點，控制腫瘤的轉移，從而對于改善患者的預后及提高患者的遠期生存率具有重要意義。
CLIC1 定位于結腸癌細胞膜，可發揮離子通道的功能；同時可溶型的 CLIC1 可能發揮類似氧化應激的“感受器”功能[38, 41]，而腫瘤的發生及進展與細胞氧化應激密切相關[31]，結果提示，抑制 CLIC1 的功能或表達可能降低腫瘤細胞的氧化應激過程，從而可能影響腫瘤的發生及進展，最終達到改善患者預后和提高生存期的目的。
Fujimoto 等[42]在對乳腺癌的研究中發現，CLIC1 是癌細胞中的主要氯離子電導，并且氯離子通道蛋白抑制劑和 siRNA 介導的抑制作用明顯下調癌細胞中 HER2 的轉錄，結果提示，氯離子通道可調控 HER2 的轉錄，可能氯離子通道蛋白抑制劑對 HER2 靶向治療耐藥的乳腺癌患者有一定的治療作用。He 等[43]在對膽囊癌中的研究中采用 CLIC1 的基因沉默方法，證實了 CLIC1 基因沉默可以促進細胞凋亡并抑制膽囊癌細胞的增殖、遷移和侵襲。同樣，Nanaware 等[44]的研究也表明，CLIC1 的基因沉默方法確有可能成為潛在的治療目標。但是，Chernet 等[45]的研究通過使用 CLIC1 氯通道的超極化來實現抑制腫瘤的發生，這暗示了不需要基因治療的方式。Wang 等[46]采用中藥化合物作為 CLIC1 的抑制劑構建模型，基于結構的對接方法對中藥數據庫進行篩選，利用聚類和配體-蛋白質相互作用分析，從而獲得有效作用的中藥化合物，這種方式也為我們提供了進一步研究的臨床思路。
氯離子通道蛋白抑制劑或 siRNA 能否用于結腸癌患者的治療，有待進一步研究證實其可行性。
5 問題與展望
雖然大量的研究已經證實了 CLIC1 可能參與了結腸癌的發生、發展、轉移、治療等諸多過程。但目前的研究主要在組織標本或體外細胞水平，人體內的研究尚未見報道，許多具體的作用機制尚不清楚。對于調控其表達的關鍵基因、參與結腸癌發生、進展的信號轉導具體途徑以及與其他相關分子的相互作用等目前仍不清楚，有待更進一步研究。隨著現代分子生物學技術不斷深入的發展，對離子通道不斷的研究，并對 CLIC1 的認識愈加清晰，未來或許有望將 CLIC1 作為結腸癌早期診斷的生物標志物及治療的靶點。
胞內氯離子通道蛋白 1（chloride intracellular channel protein 1，CLIC1）是 p64 基因家族的成員之一，主要表達于細胞核，也可存在于細胞漿及細胞膜[1]。近年來較多研究表明，CLIC1 高表達于多種腫瘤組織中，其高表達常與腫瘤的發生及轉移有密切的關系，其亦參與結腸癌的進展過程。筆者現就 CLIC1 在結腸癌中的最新研究進展作一綜述。
1 CLIC1 的分子結構與特點
CLIC1 是第一個被發現的具有多種重要生理功能的人類氯離子通道蛋白家族中的一員，其基因定位于人染色體 6p21.3，其蛋白由 241 個氨基酸殘基組成，相對分子質量大小為 27 000，表達于細胞核、細胞漿及細胞膜中[1]。
CLIC1 具有可溶型和整合膜型兩種正常的形式，可溶型形式可自發轉化成整合膜型的形式，Hossain 等[2]的研究發現，這種轉換是由膜脂質組成特別是膽固醇以及外部因素如氧化作用和 pH 調節，然而目前尚不清楚調節 CLIC1 膜插入的精確生理機制，但其研究結果首次證實了 CLIC1 中的磷脂酰化膜兩種不同結構的取向取決于膽固醇的存在與否。
通過晶體結構分析發現，CLIC1 的晶體結構在 1.4 ?（0.14 nm）分辨率被確定；通過序列分析發現，CLIC1 晶體結構主要有 2 個疏水區，其中 N 末端有 α1 螺旋和 β2 折疊，C 末端為 α6 螺旋。通過人工雙層脂質膜和細胞脂質膜結構的研究[3]發現，CLIC1 的整合膜型形式中 C 末端在膜內側，N 末端是細胞膜結合的位點。CLIC1 的 C 末端與谷胱甘肽 S 轉移酶具有高度的同源性[4-5]；N 末端含有硫氧還原蛋白域，是高度保守區域，可折疊形成谷氧還原蛋白，谷氧還原蛋白的 Trp35 被認為是 CLIC1 蛋白的跨膜結構的起點位[6-7]。
2 CLIC1 的生物學功能和組織分布特點
2.1 CLIC1 的生物學功能
通過蛋白結構分析、點突變等研究方法進一步證實了離子通道蛋白可通過形變并相互結合形成寡聚體而錨定于細胞膜表面，從而發揮著離子通道的作用。CLIC1 表現出外向整流的單一電流電導，與鉀離子、鈉離子及其他陰離子來共同維持細胞膜電位的穩定[8-9]。
CLIC1 不僅通過離子通道，其還可能參與細胞內氧化應激、細胞周期調節、細胞凋亡、血管生成等過程。可溶型的 CLIC1 通過插入脂質雙分子層，從而形成跨膜蛋白[10]，此過程可能會受到細胞內環境所調控[11-12]，具體整合的過程可能與細胞內環境的 pH 值、激酶、氧化狀態、細胞周期等調節有關[11-15]。有研究[14-15]表明，細胞內 pH 值可明顯影響可溶型 CLIC1 構象的穩定性，pH 值的高低可改變蛋白質插入細胞膜的阻力（蛋白質插入）。也有研究[5, 11]表明，氧化環境下可溶型單體 CLIC1 可發生分子構象重排，其 Cys24 和 Cys59 可形成分子內二硫鍵，從而穩定重排的結構，跨膜區的分子進一步多聚化可以在細胞膜形成細胞膜通道[5]。還有研究[16]表明，CLIC1 的 N 末端所包含完整的谷胱甘肽結合域，即通過 Cys24 位點以共價鍵的形式來結合谷胱甘肽，在特定的條件下 CLIC1 發生形變暴露谷胱甘肽結合位點，可能通過未知的酶聯反應進一步形成寡聚體，插入脂質雙分子層后形成氯離子通道結構。此外，一些特定分子也可能影響 CLIC1 的功能，如膽固醇有促進 CLIC1 發生形變從而有利于這些分子插入細胞膜的脂質雙分子層的作用[17]。
2.2 CLIC1 的組織分布特點
近年來研究[18-19]發現，CLIC1 在進化過程中高度保守，其表達水平在物種間差異比較小，并存在于多種組織和器官里。對小鼠的研究[20]發現，CLIC1 的 mRNA 廣泛存在于各種組織中，尤其高表達于骨骼肌、腎臟和肝臟組織中。免疫組織化學檢測結果[21]發現，CLIC1 在氣管、膽囊、肝內膽管、胰腺管、近端腎小管等表面的單層柱狀上皮細胞表達尤為明顯，且存在于細胞的頂端，總體呈極化分布；在食管上皮細胞中 CLIC1 的表達以胞漿內膜為主，在骨骼肌則是彌漫性分布于細胞內胞漿及細胞器中，而在皮膚、消化道平滑肌、心臟、脾臟等組織器官中則表達較少。目前，尚無人體組織器官中的 CLIC1 表達譜的研究報道。
3 CLIC1 與腫瘤的相關研究
CLIC1 在多種惡性腫瘤組織中呈高表達，包括肺癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌、神經膠質瘤、鼻咽癌、胃癌、結直腸癌等，其在這些惡性腫瘤中的高表達與較差的臨床預后關系密切，CLIC1 可能成為惡性腫瘤判斷預后的重要指標之一。
Wang 等[22]發現，CLIC1 與肺腺癌患者的臨床分期及預后關系密切；有研究者[23]通過蛋白質組學分析方法發現，CLIC1 可能在乙型肝炎病毒發生肝癌的過程中發揮著一定的作用；同樣用蛋白質組學分析方法及免疫組織化學方法檢測結果[24-25]發現，CLIC1 在胃癌及卵巢癌組織中也呈較明顯的高表達；Setti 等[26]發現，CLIC1 在神經膠質瘤組織中的表達和病理分期呈明顯的正相關，與生存期則呈負相關；Chang 等[27]比較鼻咽癌患者血漿及其組織中的 CLIC1 表達，結果發現，CLIC1 在鼻咽癌組織和血漿中均呈高表達，因此提出，CLIC1 可能作為血漿分子標志物用于早期檢測鼻咽癌患者。
CLIC1 與更多腫瘤的關系有待更多的研究去進一步證實，或許 CLIC1 可作為腫瘤早期診斷的生物標志物。
4 CLIC1 與結腸癌相關研究
4.1 CLIC1 與結腸癌的發生
CLIC1 在結腸組織中表達上調且在結腸組織惡性轉化過程中起著重要作用。
Taguchi 等[28]發現，在結腸腺瘤和早期結直腸癌患者血漿及瘤組織中的表達明顯升高。楊小松等[29]研究結果顯示，CLIC1 在結直腸的正常黏膜組織、腺瘤組織和癌組織中的表達陽性率依次呈升高趨勢，結果提示，CLIC1 可能與結直腸組織惡性變有關。Petrova 等[30]的研究也提示，CLIC1 基因的過表達可能參與了結腸癌細胞的惡性轉化過程。
盡管有不少研究發現了 CLIC1 在結直腸癌中表達上調，但對于其在結直腸癌發生中的具體機制少有相關報道，有待未來進一步研究證實。
4.2 CLIC1 與結腸癌的轉移
細胞外基質降解和細胞形態改變遷移為惡性腫瘤轉移中兩個非常重要的過程，其主要受腫瘤微環境、腫瘤血管生成、細胞外基質降解、細胞黏附等因素影響[31-32]。CLIC1 在細胞膜上形成氯離子通道，而氯離子通道中的氯通道容積調控陰離子通道（volume-regulated anion/chloride channels，VRAC）在維持細胞容積中發揮著重要作用。近年來愈來愈多的證據[33-34]表明，VRAC 與腫瘤細胞的惡性生物學行為有關，其過高表達或激活可能促進腫瘤的轉移。
惡性腫瘤在轉移過程中會出現細胞形態的改變，通過細胞調節性體積縮小過程來改變細胞的體積，當細胞外基質降解后，體積縮小的癌細胞伸出偽足，從而突破細胞外基質，然后沿基底膜缺損處及狹窄的基底間隙穿過，繼而發生遠處轉移[35]。
有研究者[36]使用 CLIC1 特異性阻斷劑和 RNA 干擾 CLIC1 可明顯降低結腸癌細胞的遷移和侵襲能力，且發現 CLIC1 主要表達于結腸癌細胞膜，通過其氯離子通道功能介導從而調節結腸癌的轉移。王攀等[37]的研究發現，CLIC1 基因在結腸癌組織中表達上調明顯，其蛋白表達與癌組織浸潤程度、淋巴結轉移和 TNM 分期密切相關，從而證實了 CLIC1 與結腸癌轉移有關；該課題組的進一步研究[38]表明，CLIC1 可通過調節缺氧-復氧微環境中的活性氧簇/細胞外信號調節激酶途徑參與結腸癌的轉移。Gurski 等[39]發現，CLIC1 對于內皮細胞和腫瘤細胞中嵌入的纖維蛋白的三維基質的穩定性是至關重要的；偽足的穩定性與 CLIC1 和 β-3 整合素的相互作用有關；隨著 CLIC1 枯竭以及 β-3 整合素耗盡，肌球蛋白輕鏈激酶（MYLK）在細胞中減少，結果提示，CLIC1 對于整合素介導的肌動蛋白在植入纖維蛋白細胞中的重要作用。
以上這些研究結果表明，CLIC1 是腫瘤侵襲、轉移和血管生成的重要因素，但其參與結腸癌轉移的更多具體機制尚需進一步探索。
4.3 CLIC1 與結腸癌的治療
結腸癌在臨床上較易復發，大多數患者的死因并非原發腫瘤所致，而是死于轉移癌[40]。因此，針對其特點，控制腫瘤的轉移，從而對于改善患者的預后及提高患者的遠期生存率具有重要意義。
CLIC1 定位于結腸癌細胞膜，可發揮離子通道的功能；同時可溶型的 CLIC1 可能發揮類似氧化應激的“感受器”功能[38, 41]，而腫瘤的發生及進展與細胞氧化應激密切相關[31]，結果提示，抑制 CLIC1 的功能或表達可能降低腫瘤細胞的氧化應激過程，從而可能影響腫瘤的發生及進展，最終達到改善患者預后和提高生存期的目的。
Fujimoto 等[42]在對乳腺癌的研究中發現，CLIC1 是癌細胞中的主要氯離子電導，并且氯離子通道蛋白抑制劑和 siRNA 介導的抑制作用明顯下調癌細胞中 HER2 的轉錄，結果提示，氯離子通道可調控 HER2 的轉錄，可能氯離子通道蛋白抑制劑對 HER2 靶向治療耐藥的乳腺癌患者有一定的治療作用。He 等[43]在對膽囊癌中的研究中采用 CLIC1 的基因沉默方法，證實了 CLIC1 基因沉默可以促進細胞凋亡并抑制膽囊癌細胞的增殖、遷移和侵襲。同樣，Nanaware 等[44]的研究也表明，CLIC1 的基因沉默方法確有可能成為潛在的治療目標。但是，Chernet 等[45]的研究通過使用 CLIC1 氯通道的超極化來實現抑制腫瘤的發生，這暗示了不需要基因治療的方式。Wang 等[46]采用中藥化合物作為 CLIC1 的抑制劑構建模型，基于結構的對接方法對中藥數據庫進行篩選，利用聚類和配體-蛋白質相互作用分析，從而獲得有效作用的中藥化合物，這種方式也為我們提供了進一步研究的臨床思路。
氯離子通道蛋白抑制劑或 siRNA 能否用于結腸癌患者的治療，有待進一步研究證實其可行性。
5 問題與展望
雖然大量的研究已經證實了 CLIC1 可能參與了結腸癌的發生、發展、轉移、治療等諸多過程。但目前的研究主要在組織標本或體外細胞水平，人體內的研究尚未見報道，許多具體的作用機制尚不清楚。對于調控其表達的關鍵基因、參與結腸癌發生、進展的信號轉導具體途徑以及與其他相關分子的相互作用等目前仍不清楚，有待更進一步研究。隨著現代分子生物學技術不斷深入的發展，對離子通道不斷的研究，并對 CLIC1 的認識愈加清晰，未來或許有望將 CLIC1 作為結腸癌早期診斷的生物標志物及治療的靶點。