引用本文： 黃兆宇, 武睿超, 冉江華, 劉均漢. 大鼠 DCD 供肝原位肝移植術后早期死亡的原因分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(3): 296-300. doi: 10.7507/1007-9424.201709042 復制
肝移植被稱作當代醫學之巔，移植手術已經相當成熟，但供體短缺卻成為制約肝移植的瓶頸[1]。在這種情況下，心臟死亡器官捐獻（DCD）供肝則成為解決器官來源問題的科學決策[2-5]，但由于在器官獲取前缺少可以評估供肝活力的定量指標[6-8]，致使移植后易發生原發性移植肝無功能[9]。要解決供體短缺及提高供體的利用率就必須加大對供肝活力的評估及維持，要評估及維持供肝活力就需要相應的動物模型。大鼠 DCD 供肝原位肝移植模型在此發揮了重要作用。目前對于成功建立大鼠原位肝移植模型的文獻[10-14]報道很多，但是對于成功建立大鼠 DCD 供肝原位肝移植模型的報道較少。本研究采用改良 Kamada 的“二袖套”法[15]在大鼠原位肝移植術的基礎上成功建立了大鼠 DCD 供肝原位肝移植模型，并對其中術后早期死亡的原因進行了分析，針對術后早期的死亡原因采取相應的預防及改進措施，使術后大鼠的存活率明顯提高。
1 材料與方法
1.1 主要材料
顯微外科器械，2.5 倍放大鏡。自制血管套管和膽管支撐管，其中門靜脈套管選用 PE 棉簽管，內徑 0.20 cm，長約 0.30 cm，管柄長約 0.15 cm；肝下下腔靜脈套管選用 PE 吸管，內徑 0.25～0.30 cm，長約 0.30 cm，管柄長約 0.15 cm。膽管支架選用直徑約 0.9 cm 的小兒硬膜外麻醉導管，長約 1.0 cm，兩端修成斜面。
1.2 實驗動物
實驗動物均外購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。成年健康雄性 SD 大鼠 200 只（供、受體各 100 只），體質量 200～250 g，供體體質量比受體體質量輕 20～25 g。所有動物飼養于昆明醫科大學清潔級動物房中，自由進食、進水。
1.3 手術方法
采用 Kamada 等[15]的改良“二袖套”吻合法。
1.3.1 術前準備
供、受體術前均禁食 12 h，但給予葡萄糖水供能。
1.3.2 供體手術
① 采用乙醚吸入麻醉，麻醉滿意后將大鼠仰臥位固定，備皮后聚維酮碘消毒。② 經陰莖背靜脈注入肝素 1 250 U，3～5 min 后開胸夾閉心臟（圖 1a），熱缺血 10 min 計時開始，同時放冰塊于大鼠胸腹部周圍。③ 待熱缺血時間達到實驗要求前 1 min 做腹部正中十字切口進腹，鈍性游離腹主動脈至左右髂總動脈分叉處，用 8 號輸液針頭于左右髂總動脈分叉處向近心端穿入腹主動脈，經胸腔剪斷肝上下腔靜脈，開始用 0～4 ℃ 含肝素的 HTK 液灌注，灌注速度約為 3 mL/min，灌注的同時用 0～4 ℃ 的生理鹽水間斷滴于肝臟表面，待肝臟呈均勻土黃色時停止灌注（圖 1b）。④ 緊貼肝上下腔靜脈用 7-0 帶針縫線縫扎左膈下靜脈。⑤ 順時針方向依次斷離肝周結締組織及韌帶，游離肝尾狀葉和乳頭葉，結扎肝食管靜脈叢，顯露膽總管，用 10 mL 注射器針頭在膽總管上斜刺一小口，將膽管支架沿穿刺口插入膽總管，套入約 0.50 cm，外端殘留約 0.50 cm（圖 1c），固定處留一長約 1.0 cm 的線頭。⑥ 游離門靜脈及其分支，并用 6-0 絲線在貼近門靜脈處結扎脾靜脈和幽門靜脈并剪斷（圖 1d）；剪斷肝動脈；鈍性分離肝下下腔靜脈至左腎靜脈處，緊貼下腔靜脈端結扎右腎靜脈并剪斷；在左腎靜脈水平剪斷肝下下腔靜脈并向頭側牽引，此時右腎上腺靜脈和腰靜脈清晰可見，予以結扎并剪斷；緊貼膈肌環剪斷肝上下腔靜脈，并保持其斷端平整。⑦ 取出供體肝臟，置于 0～4 ℃ 保存液中。⑧ 修整供肝，用彎血管鉗夾住套管柄固定套管，辨別清楚門靜脈的左右方向后，用顯微血管鉗伸入套管中將門靜脈輕輕拉出并反套于套管上后予以結扎固定；采用同樣方法完成肝下下腔靜脈的套管安置（圖 1e）。⑨ 肝上下腔靜脈左右兩個角處用 8-0 帶針縫線吊線（圖 1f）。
1.3.3 受體手術
① 術前 30 min 尾靜脈注射硫酸阿托品溶液、頭孢唑林鈉及氫化可的松。乙醚吸入麻醉，麻醉滿意后將大鼠仰臥位固定，小劑量乙醚持續吸入。② 在大鼠背后墊一 20 mL 注射器，備皮后聚維酮碘消毒，自恥骨聯合上方至劍突開腹，暴露術野（圖 2a）。③ 按順時針方向，依次斷離肝周結締組織及韌帶，7-0 帶針縫線縫扎左膈下靜脈，游離尾狀葉和乳頭葉，暴露肝食管靜脈叢，兩端結扎中間剪斷；分離肝固有動脈，兩端結扎中間剪斷；游離膽總管，在左右肝管處結扎膽管，結扎線留 1.0 cm 的線頭；盡量游離門靜脈周圍的組織，游離肝下下腔靜脈至右腎靜脈處，成束結扎右腎上腺靜脈和腰靜脈，肝上下腔靜脈后方安置一根牽拉皮條；用無損傷動脈夾貼近肝臟分別阻斷門靜脈及肝下下腔靜脈，此時停止乙醚的吸入；經門靜脈用 2 mL 生理鹽水驅血（圖 2b）。④ 完成后提起橡皮條，用血管夾連同部分膈肌夾閉肝上下腔靜脈，貼近肝臟依次剪斷肝上下腔靜脈、肝下下腔靜脈和門靜脈，移除受體肝臟，檢查腹腔有無出血，將供肝原位放入，冰濕紗布覆蓋肝臟，2.5 倍放大鏡下縫合肝上下腔靜脈（圖 2c），縫合完成前注入保存液驅盡氣泡，打結后完成肝下下腔靜脈的吻合，雙人操作完成門靜脈套管的安置（圖 2d）。⑤ 開放門靜脈及肝上下腔靜脈，血液經門靜脈進入肝臟，無肝期結束。⑥ 待肝下下腔靜脈套管內有血液流出時，完成肝下下腔靜脈套管。⑦ 在受體膽總管上剪一小口，供體膽管支架插入受體膽管，結扎固定，移植完成。
1.3.4 術后處理
術后電吹風吹干大鼠背部及胸腹部，采用小太陽復溫，術后自由進食糖水。術后 24 h 腹腔注射氫化可的松及頭孢唑林鈉。術后大鼠單籠飼養，觀察大鼠耳朵顏色及有無瘀斑、眼睛顏色及瞳孔大小、飲食、排便情況及活動狀態（能否在籠內自由活動）。
圖1
示供體手術部分圖
a：夾閉心臟；b：灌注完成的供肝；c：膽管支架的置入；d：結扎門靜脈屬支；e：安置下腔靜脈套管；f：完成吊線的供肝
圖2
示受體手術部分圖
a：受體手術體位；b：從門靜脈沖洗肝臟；c：吻合肝上下腔靜脈；d：門靜脈套管的安置
2 結果
40 d 內完成大鼠 DCD 供肝原位肝移植手術 100 例，術后受體一般情況可。供體手術時間為（20±5）min，受體手術時間為（55±5）min，無肝期為（20±3）min，無肝期至手術結束時間為（12±3）min。術中死亡 9 例，其中術中大出血（出血>2.0 mL）4 例、麻醉意外 1 例、無肝期過長（>26 min）1 例、套管置入失敗 1 例、空氣栓塞 2 例。術后 12 h 內死亡 22 例的主要死亡原因是術后腸道壞死（6 例）、術中失血過多（>2.0 mL） 4 例、術后吻合口滲血（6 例）、術后肺水腫（3 例）、術后血管栓塞（2 例）及不明原因（1 例）；術后 12～24 h 死亡 19 例的主要死亡原因是術后腸道壞死（9 例 ）、術后肺水腫（2 例）、術中失血過多（>2.0 mL） 1 例、術后吻合口滲血（3 例）、術后血管栓塞（1 例）及不明原因（3 例）。術后 24 h 仍存活 50 例。
3 討論
大鼠 DCD 供肝原位肝移植模型的建立是進行各種肝移植臨床研究的基礎，但由于其手術操作復雜，手術期間動物又存在明顯的病理生理變化，加之供肝又經歷了熱缺血、冷保存等使供肝的質量大打折扣。要建立穩定的大鼠 DCD 供肝原位肝移植模型就需要長期反復地練習。在反復的實踐中我們發現，大鼠肝移植術后 24 h 內死亡是移植手術的一個瓶頸，一旦突破這個難關，大鼠的存活率將大大提高。現就術中及術后早期（術后 24 h 內）的死亡原因及相應的應對措施歸納如下。
3.1 術中大鼠死亡的主要原因及改進措施
大鼠 DCD 供肝原位肝移植術中大鼠死亡的主要原因為術者手術操作不當引起，我們進行為期2 個月的預實驗就是為了熟練手術操作的每一個細節，縮短手術時間，提高手術成功率。大鼠術中主要死亡原因有術中大出血、麻醉意外、手術時間過長（尤其是無肝期過長）、門靜脈套管置入失敗及空氣栓塞。
3.1.1 術中出血
肝移植術中出血是造成動物術中死亡的主要原因，根據發生頻率的高低依次為：肝上下腔靜脈吻合口出血或持續的滲血、分離結扎肝固有動脈時不慎損傷肝固有動脈或門靜脈及縫扎左膈下靜脈過程中損傷肝上下腔靜脈或左膈下靜脈、結扎腎上腺靜脈和肝下下腔靜脈后方的腰靜脈叢時不牢固。① 避免肝上下腔靜脈吻合口出血或滲血的關鍵是要有扎實的顯微外科技能，吻合的關鍵是吻合前務必要保證供肝放置位置合適以及兩側血管邊緣相距合適，吻合時確保均勻合適的針距和邊距是避免吻合口出血的關鍵，血管壁兩角處針距 1 mm 左右，其他部位針距 1～2 mm，我們在2.5 倍放大鏡下縫合可以較好地控制均勻合適的針距和邊距，減少吻合口出血或滲血。待縫合完畢前務必排盡靜脈內的空氣，以免開放后導致空氣栓塞。② 在處理左膈下靜脈時由于受大鼠呼吸頻率的影響，分離時極易損傷肝上下腔靜脈，導致難以控制的大出血，我們處理的關鍵是認清左膈下靜脈三角[16]，用 7-0 帶針縫線緊貼肝上下腔靜脈端縫扎左膈下靜脈。③ 分離結扎肝固有動脈時務必仔細小心地操作，如果肝固有動脈暴露不太清晰時不要盲目地分離結扎，可以先分離結扎并剪斷膽總管并向尾側牽拉，此時肝固有動脈清晰可見。④ 在結扎腎上腺靜脈及腰靜脈叢時務必仔細解剖以保證結扎牢固。
3.1.2 麻醉意外
為了防止麻醉意外的發生，本研究中供、受體均選用乙醚吸入麻醉，該方法簡單易行。給大鼠吸入麻醉時，必須嚴密觀察大鼠的呼吸頻率及深度，隨時調整乙醚吸入劑量，以維持最佳的麻醉狀態。若出現呼吸深大則應停止麻醉的吸入，并給予低流量氧氣人工面罩吸入；若不慎麻醉過深, 可在立即撤離麻醉的同時給予搶救，用一手指堵住大鼠的一側鼻孔，另一手用注射器從另一鼻孔推入空氣，見大鼠胸廓明顯起伏證明有效。該方法能搶救大部分麻醉過深的大鼠，能明顯地減少麻醉意外。乙醚對肝功能、生理影響較小，無肝期開始后死亡率低[17]。
3.1.3 縮短無肝期、減少套管失敗導致的出血及空氣栓塞
要縮短無肝期及減少套管失敗導致的出血及空氣栓塞就必須要有較熟練的手術操作及較扎實的縫合技術。我們通過大量的預實驗手術訓練，能讓無肝期控制在（20±3）min，減少了因無肝期過長引起的系列并發癥。若無肝期超過 30 min，移植后原發性移植物無功能的發生率明顯增加[9]。
3.2 術后 24 h 內主要死亡原因及改進措施
建模過程中大鼠術后 24 h 內死亡的主要原因有術中及術后出血、腸道壞死、肺水腫及血管栓塞，其中主要原因是出血，同以往的研究[18]結論一致。術后 12～24 h 大鼠死亡的主要原因是腸道壞死、肺水腫及血管栓塞，其中腸道壞死及肺水腫在以往的研究中引起重視的程度不夠[19-21]。現就腸道壞死、肺水腫及血管栓塞的原因及改進預防措施歸納如下。
3.2.1 腸道壞死
肝移植術后發生腸道壞死的報道較少，但在本研究中已是術后 12～24 h 大鼠的主要致死原因，肝移植術后存在一定程度的腸道微生態的紊亂和腸道屏障功能的受損，再加之 DCD 供肝本身就是有缺陷的肝臟及無肝期腸道持續淤血，可能會導致腸道內微血栓的形成加重腸道壞死。我們針對這個死亡原因采取了以下預防措施：① 肝移植手術操作間要求室溫在 28 ℃ 左右，太高會導致開腹后大量的水分從腹腔丟失，太低將會降低大鼠對手術的耐受力。② 受體開腹后不要將胃腸道移除腹腔，可以將胃腸道稍微推移原來的位置并給予溫濕紗布覆蓋保護。③ 盡量縮短無肝期，開放門靜脈后給予 40 ℃ 左右的溫鹽水腹腔復溫。④ 術后酌情補液且在液體中加入一定量的前列地爾注射液預防腸道栓塞。
3.2.2 肺水腫
肝移植手術操作復雜，對大鼠的創傷較大，且圍手術期的病理生理變化復雜，如門靜脈和下腔靜脈阻斷后導致回心血流量的銳減和開放后的再灌注損傷都會對大鼠多個臟器造成影響，其中肺被認為是最早和最容易受累的器官[22]。我們在實驗中采取了如下的措施來減少血流動力學的改變：① 在無肝期開始前經門靜脈注入 2 mL 的生理鹽水進行驅血，將肝內血驅入體循環，可以減少切除肝臟時的出血。② 為避免前負荷迅速上升對肺造成損傷，在開放門靜脈后不要立即開放肝上下腔靜脈，需待肝下下腔靜脈有少量的灌注液及血液流出后再緩慢開放肝上下腔靜脈。③ 術前給予抗生素及激素時速度不要過快，術后視尾靜脈充盈程度酌情補液，如需補液，補液速度應緩慢。
3.2.3 血管栓塞
術后血管栓塞常見于大血管栓塞和肝內大面積微血栓形成。門靜脈、肝上下腔靜脈等大血管內的栓塞會迅速致死，有文獻[23-24]報道，移植后發生該類血管栓塞時存活時間往往不會超過 6 h。造成肝內微血栓的原因很多，如未灌注完畢后不停地翻動肝臟、缺血再灌注損傷、酸中毒等。為了避免血栓形成，術中及術后我們采取了如下預防措施：① 未徹底灌注完成前不要翻動肝臟，灌注完成后也要按順時針方向游離肝臟，盡量減少對肝臟的翻動。② 在安置門靜脈及肝下下腔靜脈套管前應先打開血管夾排出血塊及高凝血，再用含肝素的生理鹽水沖洗管腔后置入套管。③ 無肝期結束后立即給予 37 ℃ 的鹽水復溫并術后酌情補液及給予適量的前列地爾注射液預防栓塞。
總之，大鼠 DCD 供肝原位肝移植手術操作復雜，手術難度大，對大鼠的創傷也較大。因此，要求我們必須注意術中的各個環節、圍手術期的護理等才能建立穩定的大鼠 DCD 供肝原位肝移植模型，短期生存率才會提高，但 DCD 供肝原位肝移植術后的長期生存有待進一步研究。
肝移植被稱作當代醫學之巔，移植手術已經相當成熟，但供體短缺卻成為制約肝移植的瓶頸[1]。在這種情況下，心臟死亡器官捐獻（DCD）供肝則成為解決器官來源問題的科學決策[2-5]，但由于在器官獲取前缺少可以評估供肝活力的定量指標[6-8]，致使移植后易發生原發性移植肝無功能[9]。要解決供體短缺及提高供體的利用率就必須加大對供肝活力的評估及維持，要評估及維持供肝活力就需要相應的動物模型。大鼠 DCD 供肝原位肝移植模型在此發揮了重要作用。目前對于成功建立大鼠原位肝移植模型的文獻[10-14]報道很多，但是對于成功建立大鼠 DCD 供肝原位肝移植模型的報道較少。本研究采用改良 Kamada 的“二袖套”法[15]在大鼠原位肝移植術的基礎上成功建立了大鼠 DCD 供肝原位肝移植模型，并對其中術后早期死亡的原因進行了分析，針對術后早期的死亡原因采取相應的預防及改進措施，使術后大鼠的存活率明顯提高。
1 材料與方法
1.1 主要材料
顯微外科器械，2.5 倍放大鏡。自制血管套管和膽管支撐管，其中門靜脈套管選用 PE 棉簽管，內徑 0.20 cm，長約 0.30 cm，管柄長約 0.15 cm；肝下下腔靜脈套管選用 PE 吸管，內徑 0.25～0.30 cm，長約 0.30 cm，管柄長約 0.15 cm。膽管支架選用直徑約 0.9 cm 的小兒硬膜外麻醉導管，長約 1.0 cm，兩端修成斜面。
1.2 實驗動物
實驗動物均外購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。成年健康雄性 SD 大鼠 200 只（供、受體各 100 只），體質量 200～250 g，供體體質量比受體體質量輕 20～25 g。所有動物飼養于昆明醫科大學清潔級動物房中，自由進食、進水。
1.3 手術方法
采用 Kamada 等[15]的改良“二袖套”吻合法。
1.3.1 術前準備
供、受體術前均禁食 12 h，但給予葡萄糖水供能。
1.3.2 供體手術
① 采用乙醚吸入麻醉，麻醉滿意后將大鼠仰臥位固定，備皮后聚維酮碘消毒。② 經陰莖背靜脈注入肝素 1 250 U，3～5 min 后開胸夾閉心臟（圖 1a），熱缺血 10 min 計時開始，同時放冰塊于大鼠胸腹部周圍。③ 待熱缺血時間達到實驗要求前 1 min 做腹部正中十字切口進腹，鈍性游離腹主動脈至左右髂總動脈分叉處，用 8 號輸液針頭于左右髂總動脈分叉處向近心端穿入腹主動脈，經胸腔剪斷肝上下腔靜脈，開始用 0～4 ℃ 含肝素的 HTK 液灌注，灌注速度約為 3 mL/min，灌注的同時用 0～4 ℃ 的生理鹽水間斷滴于肝臟表面，待肝臟呈均勻土黃色時停止灌注（圖 1b）。④ 緊貼肝上下腔靜脈用 7-0 帶針縫線縫扎左膈下靜脈。⑤ 順時針方向依次斷離肝周結締組織及韌帶，游離肝尾狀葉和乳頭葉，結扎肝食管靜脈叢，顯露膽總管，用 10 mL 注射器針頭在膽總管上斜刺一小口，將膽管支架沿穿刺口插入膽總管，套入約 0.50 cm，外端殘留約 0.50 cm（圖 1c），固定處留一長約 1.0 cm 的線頭。⑥ 游離門靜脈及其分支，并用 6-0 絲線在貼近門靜脈處結扎脾靜脈和幽門靜脈并剪斷（圖 1d）；剪斷肝動脈；鈍性分離肝下下腔靜脈至左腎靜脈處，緊貼下腔靜脈端結扎右腎靜脈并剪斷；在左腎靜脈水平剪斷肝下下腔靜脈并向頭側牽引，此時右腎上腺靜脈和腰靜脈清晰可見，予以結扎并剪斷；緊貼膈肌環剪斷肝上下腔靜脈，并保持其斷端平整。⑦ 取出供體肝臟，置于 0～4 ℃ 保存液中。⑧ 修整供肝，用彎血管鉗夾住套管柄固定套管，辨別清楚門靜脈的左右方向后，用顯微血管鉗伸入套管中將門靜脈輕輕拉出并反套于套管上后予以結扎固定；采用同樣方法完成肝下下腔靜脈的套管安置（圖 1e）。⑨ 肝上下腔靜脈左右兩個角處用 8-0 帶針縫線吊線（圖 1f）。
1.3.3 受體手術
① 術前 30 min 尾靜脈注射硫酸阿托品溶液、頭孢唑林鈉及氫化可的松。乙醚吸入麻醉，麻醉滿意后將大鼠仰臥位固定，小劑量乙醚持續吸入。② 在大鼠背后墊一 20 mL 注射器，備皮后聚維酮碘消毒，自恥骨聯合上方至劍突開腹，暴露術野（圖 2a）。③ 按順時針方向，依次斷離肝周結締組織及韌帶，7-0 帶針縫線縫扎左膈下靜脈，游離尾狀葉和乳頭葉，暴露肝食管靜脈叢，兩端結扎中間剪斷；分離肝固有動脈，兩端結扎中間剪斷；游離膽總管，在左右肝管處結扎膽管，結扎線留 1.0 cm 的線頭；盡量游離門靜脈周圍的組織，游離肝下下腔靜脈至右腎靜脈處，成束結扎右腎上腺靜脈和腰靜脈，肝上下腔靜脈后方安置一根牽拉皮條；用無損傷動脈夾貼近肝臟分別阻斷門靜脈及肝下下腔靜脈，此時停止乙醚的吸入；經門靜脈用 2 mL 生理鹽水驅血（圖 2b）。④ 完成后提起橡皮條，用血管夾連同部分膈肌夾閉肝上下腔靜脈，貼近肝臟依次剪斷肝上下腔靜脈、肝下下腔靜脈和門靜脈，移除受體肝臟，檢查腹腔有無出血，將供肝原位放入，冰濕紗布覆蓋肝臟，2.5 倍放大鏡下縫合肝上下腔靜脈（圖 2c），縫合完成前注入保存液驅盡氣泡，打結后完成肝下下腔靜脈的吻合，雙人操作完成門靜脈套管的安置（圖 2d）。⑤ 開放門靜脈及肝上下腔靜脈，血液經門靜脈進入肝臟，無肝期結束。⑥ 待肝下下腔靜脈套管內有血液流出時，完成肝下下腔靜脈套管。⑦ 在受體膽總管上剪一小口，供體膽管支架插入受體膽管，結扎固定，移植完成。
1.3.4 術后處理
術后電吹風吹干大鼠背部及胸腹部，采用小太陽復溫，術后自由進食糖水。術后 24 h 腹腔注射氫化可的松及頭孢唑林鈉。術后大鼠單籠飼養，觀察大鼠耳朵顏色及有無瘀斑、眼睛顏色及瞳孔大小、飲食、排便情況及活動狀態（能否在籠內自由活動）。
圖1
示供體手術部分圖
a：夾閉心臟；b：灌注完成的供肝；c：膽管支架的置入；d：結扎門靜脈屬支；e：安置下腔靜脈套管；f：完成吊線的供肝
圖2
示受體手術部分圖
a：受體手術體位；b：從門靜脈沖洗肝臟；c：吻合肝上下腔靜脈；d：門靜脈套管的安置
2 結果
40 d 內完成大鼠 DCD 供肝原位肝移植手術 100 例，術后受體一般情況可。供體手術時間為（20±5）min，受體手術時間為（55±5）min，無肝期為（20±3）min，無肝期至手術結束時間為（12±3）min。術中死亡 9 例，其中術中大出血（出血>2.0 mL）4 例、麻醉意外 1 例、無肝期過長（>26 min）1 例、套管置入失敗 1 例、空氣栓塞 2 例。術后 12 h 內死亡 22 例的主要死亡原因是術后腸道壞死（6 例）、術中失血過多（>2.0 mL） 4 例、術后吻合口滲血（6 例）、術后肺水腫（3 例）、術后血管栓塞（2 例）及不明原因（1 例）；術后 12～24 h 死亡 19 例的主要死亡原因是術后腸道壞死（9 例 ）、術后肺水腫（2 例）、術中失血過多（>2.0 mL） 1 例、術后吻合口滲血（3 例）、術后血管栓塞（1 例）及不明原因（3 例）。術后 24 h 仍存活 50 例。
3 討論
大鼠 DCD 供肝原位肝移植模型的建立是進行各種肝移植臨床研究的基礎，但由于其手術操作復雜，手術期間動物又存在明顯的病理生理變化，加之供肝又經歷了熱缺血、冷保存等使供肝的質量大打折扣。要建立穩定的大鼠 DCD 供肝原位肝移植模型就需要長期反復地練習。在反復的實踐中我們發現，大鼠肝移植術后 24 h 內死亡是移植手術的一個瓶頸，一旦突破這個難關，大鼠的存活率將大大提高。現就術中及術后早期（術后 24 h 內）的死亡原因及相應的應對措施歸納如下。
3.1 術中大鼠死亡的主要原因及改進措施
大鼠 DCD 供肝原位肝移植術中大鼠死亡的主要原因為術者手術操作不當引起，我們進行為期2 個月的預實驗就是為了熟練手術操作的每一個細節，縮短手術時間，提高手術成功率。大鼠術中主要死亡原因有術中大出血、麻醉意外、手術時間過長（尤其是無肝期過長）、門靜脈套管置入失敗及空氣栓塞。
3.1.1 術中出血
肝移植術中出血是造成動物術中死亡的主要原因，根據發生頻率的高低依次為：肝上下腔靜脈吻合口出血或持續的滲血、分離結扎肝固有動脈時不慎損傷肝固有動脈或門靜脈及縫扎左膈下靜脈過程中損傷肝上下腔靜脈或左膈下靜脈、結扎腎上腺靜脈和肝下下腔靜脈后方的腰靜脈叢時不牢固。① 避免肝上下腔靜脈吻合口出血或滲血的關鍵是要有扎實的顯微外科技能，吻合的關鍵是吻合前務必要保證供肝放置位置合適以及兩側血管邊緣相距合適，吻合時確保均勻合適的針距和邊距是避免吻合口出血的關鍵，血管壁兩角處針距 1 mm 左右，其他部位針距 1～2 mm，我們在2.5 倍放大鏡下縫合可以較好地控制均勻合適的針距和邊距，減少吻合口出血或滲血。待縫合完畢前務必排盡靜脈內的空氣，以免開放后導致空氣栓塞。② 在處理左膈下靜脈時由于受大鼠呼吸頻率的影響，分離時極易損傷肝上下腔靜脈，導致難以控制的大出血，我們處理的關鍵是認清左膈下靜脈三角[16]，用 7-0 帶針縫線緊貼肝上下腔靜脈端縫扎左膈下靜脈。③ 分離結扎肝固有動脈時務必仔細小心地操作，如果肝固有動脈暴露不太清晰時不要盲目地分離結扎，可以先分離結扎并剪斷膽總管并向尾側牽拉，此時肝固有動脈清晰可見。④ 在結扎腎上腺靜脈及腰靜脈叢時務必仔細解剖以保證結扎牢固。
3.1.2 麻醉意外
為了防止麻醉意外的發生，本研究中供、受體均選用乙醚吸入麻醉，該方法簡單易行。給大鼠吸入麻醉時，必須嚴密觀察大鼠的呼吸頻率及深度，隨時調整乙醚吸入劑量，以維持最佳的麻醉狀態。若出現呼吸深大則應停止麻醉的吸入，并給予低流量氧氣人工面罩吸入；若不慎麻醉過深, 可在立即撤離麻醉的同時給予搶救，用一手指堵住大鼠的一側鼻孔，另一手用注射器從另一鼻孔推入空氣，見大鼠胸廓明顯起伏證明有效。該方法能搶救大部分麻醉過深的大鼠，能明顯地減少麻醉意外。乙醚對肝功能、生理影響較小，無肝期開始后死亡率低[17]。
3.1.3 縮短無肝期、減少套管失敗導致的出血及空氣栓塞
要縮短無肝期及減少套管失敗導致的出血及空氣栓塞就必須要有較熟練的手術操作及較扎實的縫合技術。我們通過大量的預實驗手術訓練，能讓無肝期控制在（20±3）min，減少了因無肝期過長引起的系列并發癥。若無肝期超過 30 min，移植后原發性移植物無功能的發生率明顯增加[9]。
3.2 術后 24 h 內主要死亡原因及改進措施
建模過程中大鼠術后 24 h 內死亡的主要原因有術中及術后出血、腸道壞死、肺水腫及血管栓塞，其中主要原因是出血，同以往的研究[18]結論一致。術后 12～24 h 大鼠死亡的主要原因是腸道壞死、肺水腫及血管栓塞，其中腸道壞死及肺水腫在以往的研究中引起重視的程度不夠[19-21]。現就腸道壞死、肺水腫及血管栓塞的原因及改進預防措施歸納如下。
3.2.1 腸道壞死
肝移植術后發生腸道壞死的報道較少，但在本研究中已是術后 12～24 h 大鼠的主要致死原因，肝移植術后存在一定程度的腸道微生態的紊亂和腸道屏障功能的受損，再加之 DCD 供肝本身就是有缺陷的肝臟及無肝期腸道持續淤血，可能會導致腸道內微血栓的形成加重腸道壞死。我們針對這個死亡原因采取了以下預防措施：① 肝移植手術操作間要求室溫在 28 ℃ 左右，太高會導致開腹后大量的水分從腹腔丟失，太低將會降低大鼠對手術的耐受力。② 受體開腹后不要將胃腸道移除腹腔，可以將胃腸道稍微推移原來的位置并給予溫濕紗布覆蓋保護。③ 盡量縮短無肝期，開放門靜脈后給予 40 ℃ 左右的溫鹽水腹腔復溫。④ 術后酌情補液且在液體中加入一定量的前列地爾注射液預防腸道栓塞。
3.2.2 肺水腫
肝移植手術操作復雜，對大鼠的創傷較大，且圍手術期的病理生理變化復雜，如門靜脈和下腔靜脈阻斷后導致回心血流量的銳減和開放后的再灌注損傷都會對大鼠多個臟器造成影響，其中肺被認為是最早和最容易受累的器官[22]。我們在實驗中采取了如下的措施來減少血流動力學的改變：① 在無肝期開始前經門靜脈注入 2 mL 的生理鹽水進行驅血，將肝內血驅入體循環，可以減少切除肝臟時的出血。② 為避免前負荷迅速上升對肺造成損傷，在開放門靜脈后不要立即開放肝上下腔靜脈，需待肝下下腔靜脈有少量的灌注液及血液流出后再緩慢開放肝上下腔靜脈。③ 術前給予抗生素及激素時速度不要過快，術后視尾靜脈充盈程度酌情補液，如需補液，補液速度應緩慢。
3.2.3 血管栓塞
術后血管栓塞常見于大血管栓塞和肝內大面積微血栓形成。門靜脈、肝上下腔靜脈等大血管內的栓塞會迅速致死，有文獻[23-24]報道，移植后發生該類血管栓塞時存活時間往往不會超過 6 h。造成肝內微血栓的原因很多，如未灌注完畢后不停地翻動肝臟、缺血再灌注損傷、酸中毒等。為了避免血栓形成，術中及術后我們采取了如下預防措施：① 未徹底灌注完成前不要翻動肝臟，灌注完成后也要按順時針方向游離肝臟，盡量減少對肝臟的翻動。② 在安置門靜脈及肝下下腔靜脈套管前應先打開血管夾排出血塊及高凝血，再用含肝素的生理鹽水沖洗管腔后置入套管。③ 無肝期結束后立即給予 37 ℃ 的鹽水復溫并術后酌情補液及給予適量的前列地爾注射液預防栓塞。
總之，大鼠 DCD 供肝原位肝移植手術操作復雜，手術難度大，對大鼠的創傷也較大。因此，要求我們必須注意術中的各個環節、圍手術期的護理等才能建立穩定的大鼠 DCD 供肝原位肝移植模型，短期生存率才會提高，但 DCD 供肝原位肝移植術后的長期生存有待進一步研究。
