引用本文： 許晶晶, 劉峰, 楊廷桐, 陸建福. 乳腺浸潤性導管癌微環境中的 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 p53 基因的表達 . 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(3): 328-333. doi: 10.7507/1007-9424.201709032 復制
乳腺癌的發病率在女性惡性腫瘤中位居第1 位[1-2]。因乳腺癌細胞存在異質性，且乳腺癌呈現出逐年上升與年輕化的趨勢[3]，因此如何評估乳腺癌的轉移狀態與預后就成為臨床上防治乳腺癌的焦點所在。有研究[4-5]提示：乳腺癌腫瘤簇內和間質中的腫瘤浸潤 T 淋巴細胞（TIL）在腫瘤的浸潤、轉移及預后中發揮著極其重要的免疫作用，但國內外研究的結果存在較大的分歧。本研究通過對 85 例乳腺浸潤性導管癌腫瘤簇內與間質中 CD4+和 CD8+ T 細胞比例及 p53 基因表達的研究，探討了它們之間的相關性及其在乳腺癌浸潤、轉移及預后中的作用，旨在為臨床防治乳腺癌與評估其預后提供新的視野。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究的納入標準：① 女性患者；② 初診病例，且均經病理學檢查確診為乳腺浸潤性導管癌。排除標準：① 男性乳腺癌患者；② 既往有惡性腫瘤病史者。回顧性收集解放軍第 371 醫院于 2010–2012 年期間行手術切除的 85 例乳腺浸潤性導管癌標本，手術方式均為改良乳腺癌根治術和單純的乳房切除術。85 例患者的年齡為 22～73 歲，中位年齡為 46 歲；臨床分期：0～Ⅰ 期 26 例（30.6%），Ⅱ～Ⅲ 期 59 例（69.4%）；腫瘤直徑：<2 cm 者 45 例（52.9%），2～5 cm 者 36 例（42.4%），>5 cm 者 4 例（4.7%）。組織學分級：Ⅰ 級 71 例（83.5%），Ⅱ 級 10 例（11.8%），Ⅲ 級 4 例（4.7%）；分子分型：Luminal A 型 19 例（22.4%），Luminal B 型 29 例（34.1%），人類表皮生長因子受體 2（HER-2）型 34 例（40.0%），Basal-like 型 3 例（3.5%）；發生前哨淋巴結轉移 32 例（37.6%），無前哨淋巴結轉移 53 例（62.4%）。本研究經解放軍第 371 醫院倫理委員會批準同意。
1.2 免疫組織化學染色方法及結果判定
選取所需的腫瘤組織蠟塊，行 4 μm 厚切片，經烤片、脫蠟、水化及高溫高壓抗原修復后，再采用 EN Vision 二步法進行免疫組織化學染色。首先加入一抗，包括 CD4（抗體克隆號：SP35）、CD8（抗體克隆號：SP16）及 p53（抗體克隆號：DO-7），4 ℃ 冰箱過夜；次日水洗后滴加辣根過氧化物酶標記二抗，恒溫孵育；最后行 DAB 顯色、蘇木精復染、分化及封片，在顯微鏡下進行觀察及結果判斷。具體操作同試劑盒說明書。以具有棕褐色顆粒即陽性染色的扁桃體組織作為陽性對照，以 PBS 溶液處理的切片（PBS 溶液代替一抗和二抗）作為陰性對照。
CD4 和 CD8 的陽性染色位于胞質或胞膜，p53 基因的陽性染色位于胞核，陽性染色呈棕黃色或棕褐色[6-8]。在高倍鏡（40 倍）下計數（10 個視野）。CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞的比例為陽性炎癥細胞占間質/腫瘤細胞簇中所有有核細胞的百分比。p53 基因染色結果的判定依據：陽性細胞所占百分比<5% 計為 0 分，5%～25% 計為 1 分，26%～50% 計為 2 分，51%～75% 計為 3 分，>76% 計為 4 分；再根據染色強度計分：不著色計為 0 分，淡黃色計為 1 分，棕黃色計為 2 分，棕褐色計為 3 分。取兩項得分之積作為最終的得分，其中>1 分判定為陽性，表明存在 p53 基因突變，≤1 分判定為陰性（野生型）[8]。
1.3 隨訪
術后采用電話、家訪、患者來院復查等方式就患者的生存狀況進行隨訪。本組患者的隨訪截止時間為 2016 年 12 月 28 日。患者的生存期定義為手術結束到患者死亡或者隨訪終止的時間。本組有 79 例患者獲訪，隨訪時間 2～84 個月，中位隨訪時間為 32.2 個月。
1.4 統計學方法
采用 Graphpad 5.0 統計軟件對數據進行統計學分析。CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例以及 CD4+/CD8+ T 細胞比值均以均數±標準差（
±s）表示，組間均數的比較采用 t 檢驗（成組或配對）。生存分析采用 log-rank 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 腫瘤簇中和間質內 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值比較
85 例患者中，p53 基因表達陽性 27 例（31.8%），陰性 58 例（68.2%），見圖 1–4。不管是在腫瘤簇中還是在間質內，CD8+ T 細胞比例均低于 CD4+ T 細胞比例（P<0.01）。與腫瘤簇中比較，間質內的 CD4+ T 細胞比例和 CD8+ T 細胞比例均較高，而 CD4+/CD8+ T 細胞比值較低，差異均有統計學意義（P<0.05）。具體見表 1。
圖1
示存在 p53 基因突變、淋巴結未轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中的 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 細胞；b：CD8+ T 細胞
圖2
示存在 p53 基因突變、淋巴結轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中的 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 細胞；b：CD8+ T 細胞
圖3
示 p53 基因未突變、淋巴結轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中的 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 細胞；b：CD8+ T 細胞
圖4
示 p53 基因未突變、淋巴結未轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中的 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 細胞；b：CD8+ T 細胞
表1
腫瘤簇中和間質內的 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值（
，n=85）
2.2 前哨淋巴結轉移組和前哨淋巴結未轉移組患者的 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值比較
在前哨淋巴結轉移組和未轉移組患者中，與腫瘤簇中比較，間質內的 CD4+和 CD8+ T 細胞比例均較高（P<0.01），而 CD4+/CD8+ T 細胞比值均較低（P<0.05）。在腫瘤簇中，與前哨淋巴結轉移組患者比較，前哨淋巴結未轉移組患者的 CD4+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值的差異均無統計學意義（P>0.05），但前哨淋巴結未轉移組患者的 CD8+ T 細胞比例較低（P<0.05）。在腫瘤間質中，與前哨淋巴結轉移組患者比較，前哨淋巴結未轉移組患者的 CD4+ T 細胞比例和 CD8+ T 細胞比例均較低（P<0.05），CD4+/CD8+ T 細胞比值較高（P<0.05）。具體見表 2。
表2
前哨淋巴結轉移組和未轉移組患者的 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值比較
2.3 p53 基因突變組和未突變組患者的 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值比較
在 p53 基因突變組和未突變組患者中，與腫瘤簇中比較，間質內的 CD4+和 CD8+ T 細胞比例均增高（P<0.05），且 p53 基因未突變組患者間質內的 CD4+/CD8+ T 細胞比值較腫瘤簇低（P<0.05），但 p53 基因突變組腫瘤簇中和間質內的CD4+/CD8+ T 細胞比值比較差異無統計學意義（P>0.05）。不管是在腫瘤簇中還是在間質內，與 p53 基因突變組比較，p53 基因未突變組患者的 CD4+ T 細胞比例及 CD8+ T 細胞比例均較低（P<0.05），而 CD4+/CD8+ T 細胞比值均較高（P<0.05）。具體見表 3。
表3
p53 基因突變組和未突變組患者的 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值比較
2.4 乳腺浸潤性導管癌的預后與 CD8+ T 細胞浸潤程度和 p53 基因表達的關系
根據文獻[5]，本研究選擇了間質內的 CD8+ T 細胞比例和 p53 基因的表達兩項指標，探索其與患者預后的關系。根據間質內 CD8+ T 細胞比例的均值[5]，將患者分為 CD8+ T 細胞高浸潤組（35 例）與低浸潤組（50 例）。Graphpad 生存分析結果顯示，間質內 CD8+ T 細胞浸潤程度和 p53 基因表達均與患者的預后相關：高浸潤者與低浸潤者的 5 年生存率分別為 78.3% 和 85.9%，生存情況比較差異有統計學意義（P<0.05）；p53 基因突變組與未突變組患者的 5 年生存率分別為 67.2% 和 89.5%，生存情況比較差異有統計學意義（P<0.05）。p53 基因突變和 CD8+ T 細胞高浸潤提示患者的預后不良，見圖 5 和圖 6。
圖5
示 CD8+ T 細胞高浸潤和低浸潤患者的生存曲線
圖6
示 p53 基因突變和未突變患者的生存曲線
3 討論
乳腺癌已位居女性惡性腫瘤發病的首位，由于乳腺癌患者存在個體生物學特征的極大不同，故對于臨床的腫瘤轉移、預后以及治療的預測存在不確定性，如何對乳腺癌患者進行精準化的個體化治療，這是臨床醫師和患者的需求，因此加大對腫瘤與機體免疫功能之間的研究勢在必行。研究[9]發現，腫瘤微環境中的組織成分在腫瘤的浸潤、轉移、破壞正常組織等過程中起著重要的作用。腫瘤的發生到轉移是腫瘤微環境的實質和間質之間相互作用的結果，腫瘤微環境中的免疫狀態，尤其是細胞介導的免疫反應能直接反映機體局部對腫瘤的反應情況[10]。TIL 是新近發現的與腫瘤免疫相關的重要成分，CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞便是 TIL 中的一員，在腫瘤微環境內對于腫瘤的發展、轉移、預后等發揮非常重要的作用[11]。以往的研究多為血液中淋巴亞群的分析[12-13]，不能完全反映腫瘤微環境中的情況，且對于腫瘤微環境的研究甚少。本研究重點在于直接研究腫瘤微環境中的 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞，以直接反映機體腫瘤微環境中的免疫狀態，并探討其與乳腺癌轉移及預后的關系。
TIL 主要由 CD4+ T 細胞（輔助性 T 淋巴細胞）和 CD8+ T 細胞（細胞毒性 T 淋巴細胞）組成，是機體免疫系統對腫瘤細胞的特異性免疫表達[14]。兩者與腫瘤細胞的演進密切相關：CD4+ T 細胞提呈抗原，通過直接或間接作用于 B 細胞產生抗體，也可以作用于 CD8+ T 細胞，使其激活[15]；CD8+ T 細胞激活后分泌的細胞因子能直接殺傷腫瘤細胞[16]。CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞兩者相輔相成，調節、平衡機體正常的免疫應答反應[17]。乳腺浸潤性導管癌患者的腫瘤組織中存在 T 細胞亞群的浸潤[18]。CD8+ T 細胞比例的變化影響免疫功能，其比例越高，免疫抑制作用越強，且影響 CD4+/CD8+ T 細胞比值，該比值下降被認為是免疫抑制的表現，最終免疫狀態失衡，進而促使腫瘤細胞在體內迅速發展[19-20]，因此研究腫瘤微環境中 TIL 的改變能直接反映機體抗腫瘤反應的狀況。目前，國內對 CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞以及 CD4+/CD8+ T 細胞比值與 p53 基因突變之間關系的研究鮮有報道，因此本研究通過檢測乳腺浸潤性導管癌微環境中的 CD4+ T 細胞比例和 CD8+ T 細胞比例，以及 p53 基因在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達，探討三者與乳腺浸潤性導管癌轉移及預后的關系。
本研究發現，不管是在腫瘤簇中還是在間質內，CD8+ T 細胞比例均低于 CD4+ T 細胞比例（P<0.01）；與腫瘤簇中比較，間質內的 CD4+ T 細胞比例和 CD8+ T 細胞比例均較高，而 CD4+/CD8+ T 細胞比值較低，說明 TIL 在腫瘤中的分布存在不同。筆者推測：這種現象或許是乳腺癌發生、發展與浸潤的一個重要的機制。在前哨淋巴結轉移方面，前哨淋巴結轉移組患者間質內的 CD4+ T 細胞比例高于前哨淋巴結未轉移組，提示 CD4+ T 細胞的浸潤和淋巴結轉移之間的關系密切，這與 Macchetti 等[21]的研究結論基本一致。其機制可能是，機體腫瘤細胞刺激了 CD4+ T 細胞反應性增加，CD4+ T 細胞同時又促進了乳腺癌的轉移，這可能是乳腺癌浸潤和轉移的原因之一。這也充分說明了乳腺癌患者體內存在不同程度的細胞免疫狀態紊亂[22]。本研究還發現，不管是在腫瘤簇中還是在間質內，前哨淋巴結轉移組患者的 CD8+ T 細胞比例均較前哨淋巴結未轉移組高，且生存分析發現，CD8+ T 細胞高浸潤者的生存情況較低浸潤者差。這與文獻[5]報道的一致。
本研究也發現：腫瘤間質內 CD4+/CD8+ T 細胞比值較腫瘤簇中低，前哨淋巴結轉移組患者間質內 CD4+/CD8+ T 細胞的比值也較前哨淋巴結未轉移組低，這一結果與文獻[21, 23]結果一致，也與何偉華等[24]的研究結果相符。CD4+/CD8+ T 細胞比值下降甚至倒置被認為是細胞免疫耐受、受抑制的表現。其具體機制為，腫瘤細胞釋放大量的免疫抑制因子使 CD4+ T 細胞的功能下降，CD8+ T 細胞的數量或活性增高，從而表現為比值下降。同時 CD8+ T 細胞又對 CD4+ T 細胞進行調節，阻止其形成和成熟，這種現象有利于腫瘤的生長[25]。本研究還發現，在腫瘤簇中，前哨淋巴結轉移組的 CD4+/CD8+ T 細胞比值與前哨淋巴結未轉移組的差異無統計學意義，該結果與文獻[21, 23]不一致。考慮因素為：本研究例數較少，需要再進一步收集病例，完善數據；此外也有可能是存在其他免疫機制。有研究[26]表明，在惡性腫瘤細胞的演進過程中，腫瘤細胞會產生白介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β（TGF-β）等免疫抑制因子，抑制淋巴細胞的增殖和分化。另外，CD4+ T 細胞有較強的分泌功能，能分泌 IL-2、IL-3、干擾素 γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，參與機體免疫反應的調節，可通過促進 CD4+ T 細胞的增殖、分化和激活而間接影響靶細胞的殺傷[27]。CD4+CD25+Treg（調節性 T 細胞）對機體的耐受作用影響免疫系統對腫瘤細胞的清除，CD4+CD25+Treg 可能通過對機體的免疫抑制而促進腫瘤的生長，是腫瘤免疫逃逸的重要機制之一[28]。由于機體內是一個復雜的網絡調控體系，且影響腫瘤預后與淋巴結轉移的因素太多，因此可能會導致研究間結果的不同，有待未來更深入的研究進行驗證。
p53 是抑癌基因，在很多腫瘤組織中發生突變，參與多種腫瘤的發生和發展[8, 29]。本研究發現，在乳腺癌組織中 p53 基因突變率為 31.8%（27/85）。進一步研究發現，在 p53 基因突變組患者的腫瘤簇中和間質內，其 CD4+ T 細胞比例和 CD8+ T 細胞比例均較 p53 基因未突變組高，而 CD4+/CD8+ T 細胞比值較 p53 基因未突變組低。筆者推測：p53 基因的突變可能是導致 TIL（CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞）分布和比例不同的重要因素。然而 p53 基因突變如何影響免疫細胞的比例和分布？為何又在患者預后方面存在明顯的不同？為何又能影響患者的生存？其在腫瘤細胞免疫方面的機制如何？這些尚不清楚，需要進一步研究。
綜上所述，本研究結果提示，CD4+/CD8+ T 細胞比值降低使機體處于免疫抑制狀態，易導致腫瘤轉移；p53 基因突變組患者的腫瘤微環境呈現較強的免疫抑制狀態，但其調控機制還有待進一步研究證實。此外，它們之間相互作用的機制以及如何優化免疫表型設計和個體化聯合免疫治療，也需要進一步的深入研究。
乳腺癌的發病率在女性惡性腫瘤中位居第1 位[1-2]。因乳腺癌細胞存在異質性，且乳腺癌呈現出逐年上升與年輕化的趨勢[3]，因此如何評估乳腺癌的轉移狀態與預后就成為臨床上防治乳腺癌的焦點所在。有研究[4-5]提示：乳腺癌腫瘤簇內和間質中的腫瘤浸潤 T 淋巴細胞（TIL）在腫瘤的浸潤、轉移及預后中發揮著極其重要的免疫作用，但國內外研究的結果存在較大的分歧。本研究通過對 85 例乳腺浸潤性導管癌腫瘤簇內與間質中 CD4+和 CD8+ T 細胞比例及 p53 基因表達的研究，探討了它們之間的相關性及其在乳腺癌浸潤、轉移及預后中的作用，旨在為臨床防治乳腺癌與評估其預后提供新的視野。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究的納入標準：① 女性患者；② 初診病例，且均經病理學檢查確診為乳腺浸潤性導管癌。排除標準：① 男性乳腺癌患者；② 既往有惡性腫瘤病史者。回顧性收集解放軍第 371 醫院于 2010–2012 年期間行手術切除的 85 例乳腺浸潤性導管癌標本，手術方式均為改良乳腺癌根治術和單純的乳房切除術。85 例患者的年齡為 22～73 歲，中位年齡為 46 歲；臨床分期：0～Ⅰ 期 26 例（30.6%），Ⅱ～Ⅲ 期 59 例（69.4%）；腫瘤直徑：<2 cm 者 45 例（52.9%），2～5 cm 者 36 例（42.4%），>5 cm 者 4 例（4.7%）。組織學分級：Ⅰ 級 71 例（83.5%），Ⅱ 級 10 例（11.8%），Ⅲ 級 4 例（4.7%）；分子分型：Luminal A 型 19 例（22.4%），Luminal B 型 29 例（34.1%），人類表皮生長因子受體 2（HER-2）型 34 例（40.0%），Basal-like 型 3 例（3.5%）；發生前哨淋巴結轉移 32 例（37.6%），無前哨淋巴結轉移 53 例（62.4%）。本研究經解放軍第 371 醫院倫理委員會批準同意。
1.2 免疫組織化學染色方法及結果判定
選取所需的腫瘤組織蠟塊，行 4 μm 厚切片，經烤片、脫蠟、水化及高溫高壓抗原修復后，再采用 EN Vision 二步法進行免疫組織化學染色。首先加入一抗，包括 CD4（抗體克隆號：SP35）、CD8（抗體克隆號：SP16）及 p53（抗體克隆號：DO-7），4 ℃ 冰箱過夜；次日水洗后滴加辣根過氧化物酶標記二抗，恒溫孵育；最后行 DAB 顯色、蘇木精復染、分化及封片，在顯微鏡下進行觀察及結果判斷。具體操作同試劑盒說明書。以具有棕褐色顆粒即陽性染色的扁桃體組織作為陽性對照，以 PBS 溶液處理的切片（PBS 溶液代替一抗和二抗）作為陰性對照。
CD4 和 CD8 的陽性染色位于胞質或胞膜，p53 基因的陽性染色位于胞核，陽性染色呈棕黃色或棕褐色[6-8]。在高倍鏡（40 倍）下計數（10 個視野）。CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞的比例為陽性炎癥細胞占間質/腫瘤細胞簇中所有有核細胞的百分比。p53 基因染色結果的判定依據：陽性細胞所占百分比<5% 計為 0 分，5%～25% 計為 1 分，26%～50% 計為 2 分，51%～75% 計為 3 分，>76% 計為 4 分；再根據染色強度計分：不著色計為 0 分，淡黃色計為 1 分，棕黃色計為 2 分，棕褐色計為 3 分。取兩項得分之積作為最終的得分，其中>1 分判定為陽性，表明存在 p53 基因突變，≤1 分判定為陰性（野生型）[8]。
1.3 隨訪
術后采用電話、家訪、患者來院復查等方式就患者的生存狀況進行隨訪。本組患者的隨訪截止時間為 2016 年 12 月 28 日。患者的生存期定義為手術結束到患者死亡或者隨訪終止的時間。本組有 79 例患者獲訪，隨訪時間 2～84 個月，中位隨訪時間為 32.2 個月。
1.4 統計學方法
采用 Graphpad 5.0 統計軟件對數據進行統計學分析。CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例以及 CD4+/CD8+ T 細胞比值均以均數±標準差（
±s）表示，組間均數的比較采用 t 檢驗（成組或配對）。生存分析采用 log-rank 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 腫瘤簇中和間質內 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值比較
85 例患者中，p53 基因表達陽性 27 例（31.8%），陰性 58 例（68.2%），見圖 1–4。不管是在腫瘤簇中還是在間質內，CD8+ T 細胞比例均低于 CD4+ T 細胞比例（P<0.01）。與腫瘤簇中比較，間質內的 CD4+ T 細胞比例和 CD8+ T 細胞比例均較高，而 CD4+/CD8+ T 細胞比值較低，差異均有統計學意義（P<0.05）。具體見表 1。
圖1
示存在 p53 基因突變、淋巴結未轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中的 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 細胞；b：CD8+ T 細胞
圖2
示存在 p53 基因突變、淋巴結轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中的 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 細胞；b：CD8+ T 細胞
圖3
示 p53 基因未突變、淋巴結轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中的 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 細胞；b：CD8+ T 細胞
圖4
示 p53 基因未突變、淋巴結未轉移的乳腺浸潤性導管癌組織中的 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞（EN Vision 二步法 ×200）
a：CD4+ T 細胞；b：CD8+ T 細胞
表1
腫瘤簇中和間質內的 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值（
，n=85）
2.2 前哨淋巴結轉移組和前哨淋巴結未轉移組患者的 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值比較
在前哨淋巴結轉移組和未轉移組患者中，與腫瘤簇中比較，間質內的 CD4+和 CD8+ T 細胞比例均較高（P<0.01），而 CD4+/CD8+ T 細胞比值均較低（P<0.05）。在腫瘤簇中，與前哨淋巴結轉移組患者比較，前哨淋巴結未轉移組患者的 CD4+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值的差異均無統計學意義（P>0.05），但前哨淋巴結未轉移組患者的 CD8+ T 細胞比例較低（P<0.05）。在腫瘤間質中，與前哨淋巴結轉移組患者比較，前哨淋巴結未轉移組患者的 CD4+ T 細胞比例和 CD8+ T 細胞比例均較低（P<0.05），CD4+/CD8+ T 細胞比值較高（P<0.05）。具體見表 2。
表2
前哨淋巴結轉移組和未轉移組患者的 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值比較
2.3 p53 基因突變組和未突變組患者的 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值比較
在 p53 基因突變組和未突變組患者中，與腫瘤簇中比較，間質內的 CD4+和 CD8+ T 細胞比例均增高（P<0.05），且 p53 基因未突變組患者間質內的 CD4+/CD8+ T 細胞比值較腫瘤簇低（P<0.05），但 p53 基因突變組腫瘤簇中和間質內的CD4+/CD8+ T 細胞比值比較差異無統計學意義（P>0.05）。不管是在腫瘤簇中還是在間質內，與 p53 基因突變組比較，p53 基因未突變組患者的 CD4+ T 細胞比例及 CD8+ T 細胞比例均較低（P<0.05），而 CD4+/CD8+ T 細胞比值均較高（P<0.05）。具體見表 3。
表3
p53 基因突變組和未突變組患者的 CD4+ T 細胞比例、CD8+ T 細胞比例及 CD4+/CD8+ T 細胞比值比較
2.4 乳腺浸潤性導管癌的預后與 CD8+ T 細胞浸潤程度和 p53 基因表達的關系
根據文獻[5]，本研究選擇了間質內的 CD8+ T 細胞比例和 p53 基因的表達兩項指標，探索其與患者預后的關系。根據間質內 CD8+ T 細胞比例的均值[5]，將患者分為 CD8+ T 細胞高浸潤組（35 例）與低浸潤組（50 例）。Graphpad 生存分析結果顯示，間質內 CD8+ T 細胞浸潤程度和 p53 基因表達均與患者的預后相關：高浸潤者與低浸潤者的 5 年生存率分別為 78.3% 和 85.9%，生存情況比較差異有統計學意義（P<0.05）；p53 基因突變組與未突變組患者的 5 年生存率分別為 67.2% 和 89.5%，生存情況比較差異有統計學意義（P<0.05）。p53 基因突變和 CD8+ T 細胞高浸潤提示患者的預后不良，見圖 5 和圖 6。
圖5
示 CD8+ T 細胞高浸潤和低浸潤患者的生存曲線
圖6
示 p53 基因突變和未突變患者的生存曲線
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乳腺癌已位居女性惡性腫瘤發病的首位，由于乳腺癌患者存在個體生物學特征的極大不同，故對于臨床的腫瘤轉移、預后以及治療的預測存在不確定性，如何對乳腺癌患者進行精準化的個體化治療，這是臨床醫師和患者的需求，因此加大對腫瘤與機體免疫功能之間的研究勢在必行。研究[9]發現，腫瘤微環境中的組織成分在腫瘤的浸潤、轉移、破壞正常組織等過程中起著重要的作用。腫瘤的發生到轉移是腫瘤微環境的實質和間質之間相互作用的結果，腫瘤微環境中的免疫狀態，尤其是細胞介導的免疫反應能直接反映機體局部對腫瘤的反應情況[10]。TIL 是新近發現的與腫瘤免疫相關的重要成分，CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞便是 TIL 中的一員，在腫瘤微環境內對于腫瘤的發展、轉移、預后等發揮非常重要的作用[11]。以往的研究多為血液中淋巴亞群的分析[12-13]，不能完全反映腫瘤微環境中的情況，且對于腫瘤微環境的研究甚少。本研究重點在于直接研究腫瘤微環境中的 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞，以直接反映機體腫瘤微環境中的免疫狀態，并探討其與乳腺癌轉移及預后的關系。
TIL 主要由 CD4+ T 細胞（輔助性 T 淋巴細胞）和 CD8+ T 細胞（細胞毒性 T 淋巴細胞）組成，是機體免疫系統對腫瘤細胞的特異性免疫表達[14]。兩者與腫瘤細胞的演進密切相關：CD4+ T 細胞提呈抗原，通過直接或間接作用于 B 細胞產生抗體，也可以作用于 CD8+ T 細胞，使其激活[15]；CD8+ T 細胞激活后分泌的細胞因子能直接殺傷腫瘤細胞[16]。CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞兩者相輔相成，調節、平衡機體正常的免疫應答反應[17]。乳腺浸潤性導管癌患者的腫瘤組織中存在 T 細胞亞群的浸潤[18]。CD8+ T 細胞比例的變化影響免疫功能，其比例越高，免疫抑制作用越強，且影響 CD4+/CD8+ T 細胞比值，該比值下降被認為是免疫抑制的表現，最終免疫狀態失衡，進而促使腫瘤細胞在體內迅速發展[19-20]，因此研究腫瘤微環境中 TIL 的改變能直接反映機體抗腫瘤反應的狀況。目前，國內對 CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞以及 CD4+/CD8+ T 細胞比值與 p53 基因突變之間關系的研究鮮有報道，因此本研究通過檢測乳腺浸潤性導管癌微環境中的 CD4+ T 細胞比例和 CD8+ T 細胞比例，以及 p53 基因在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達，探討三者與乳腺浸潤性導管癌轉移及預后的關系。
本研究發現，不管是在腫瘤簇中還是在間質內，CD8+ T 細胞比例均低于 CD4+ T 細胞比例（P<0.01）；與腫瘤簇中比較，間質內的 CD4+ T 細胞比例和 CD8+ T 細胞比例均較高，而 CD4+/CD8+ T 細胞比值較低，說明 TIL 在腫瘤中的分布存在不同。筆者推測：這種現象或許是乳腺癌發生、發展與浸潤的一個重要的機制。在前哨淋巴結轉移方面，前哨淋巴結轉移組患者間質內的 CD4+ T 細胞比例高于前哨淋巴結未轉移組，提示 CD4+ T 細胞的浸潤和淋巴結轉移之間的關系密切，這與 Macchetti 等[21]的研究結論基本一致。其機制可能是，機體腫瘤細胞刺激了 CD4+ T 細胞反應性增加，CD4+ T 細胞同時又促進了乳腺癌的轉移，這可能是乳腺癌浸潤和轉移的原因之一。這也充分說明了乳腺癌患者體內存在不同程度的細胞免疫狀態紊亂[22]。本研究還發現，不管是在腫瘤簇中還是在間質內，前哨淋巴結轉移組患者的 CD8+ T 細胞比例均較前哨淋巴結未轉移組高，且生存分析發現，CD8+ T 細胞高浸潤者的生存情況較低浸潤者差。這與文獻[5]報道的一致。
本研究也發現：腫瘤間質內 CD4+/CD8+ T 細胞比值較腫瘤簇中低，前哨淋巴結轉移組患者間質內 CD4+/CD8+ T 細胞的比值也較前哨淋巴結未轉移組低，這一結果與文獻[21, 23]結果一致，也與何偉華等[24]的研究結果相符。CD4+/CD8+ T 細胞比值下降甚至倒置被認為是細胞免疫耐受、受抑制的表現。其具體機制為，腫瘤細胞釋放大量的免疫抑制因子使 CD4+ T 細胞的功能下降，CD8+ T 細胞的數量或活性增高，從而表現為比值下降。同時 CD8+ T 細胞又對 CD4+ T 細胞進行調節，阻止其形成和成熟，這種現象有利于腫瘤的生長[25]。本研究還發現，在腫瘤簇中，前哨淋巴結轉移組的 CD4+/CD8+ T 細胞比值與前哨淋巴結未轉移組的差異無統計學意義，該結果與文獻[21, 23]不一致。考慮因素為：本研究例數較少，需要再進一步收集病例，完善數據；此外也有可能是存在其他免疫機制。有研究[26]表明，在惡性腫瘤細胞的演進過程中，腫瘤細胞會產生白介素-10（IL-10）、轉化生長因子-β（TGF-β）等免疫抑制因子，抑制淋巴細胞的增殖和分化。另外，CD4+ T 細胞有較強的分泌功能，能分泌 IL-2、IL-3、干擾素 γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，參與機體免疫反應的調節，可通過促進 CD4+ T 細胞的增殖、分化和激活而間接影響靶細胞的殺傷[27]。CD4+CD25+Treg（調節性 T 細胞）對機體的耐受作用影響免疫系統對腫瘤細胞的清除，CD4+CD25+Treg 可能通過對機體的免疫抑制而促進腫瘤的生長，是腫瘤免疫逃逸的重要機制之一[28]。由于機體內是一個復雜的網絡調控體系，且影響腫瘤預后與淋巴結轉移的因素太多，因此可能會導致研究間結果的不同，有待未來更深入的研究進行驗證。
p53 是抑癌基因，在很多腫瘤組織中發生突變，參與多種腫瘤的發生和發展[8, 29]。本研究發現，在乳腺癌組織中 p53 基因突變率為 31.8%（27/85）。進一步研究發現，在 p53 基因突變組患者的腫瘤簇中和間質內，其 CD4+ T 細胞比例和 CD8+ T 細胞比例均較 p53 基因未突變組高，而 CD4+/CD8+ T 細胞比值較 p53 基因未突變組低。筆者推測：p53 基因的突變可能是導致 TIL（CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞）分布和比例不同的重要因素。然而 p53 基因突變如何影響免疫細胞的比例和分布？為何又在患者預后方面存在明顯的不同？為何又能影響患者的生存？其在腫瘤細胞免疫方面的機制如何？這些尚不清楚，需要進一步研究。
綜上所述，本研究結果提示，CD4+/CD8+ T 細胞比值降低使機體處于免疫抑制狀態，易導致腫瘤轉移；p53 基因突變組患者的腫瘤微環境呈現較強的免疫抑制狀態，但其調控機制還有待進一步研究證實。此外，它們之間相互作用的機制以及如何優化免疫表型設計和個體化聯合免疫治療，也需要進一步的深入研究。
