引用本文： 徐宏勇, 徐立. 一種特異性靶向性淋巴細胞對荷瘤裸鼠的治療觀察. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(3): 283-288. doi: 10.7507/1007-9424.201709005 復制
癌胚抗原（CEA）表達于多種腫瘤[1]，尤其在消化道惡性腫瘤中明顯[2-3]，基于其生物學特性，將其作為腫瘤標志物可廣泛應用于對腫瘤的早期檢測，可為臨床腫瘤診斷提供依據并判斷預后[4]；抗 CEA 單克隆抗體也用于對消化道腫瘤的診治方面。基于 T 細胞活化的雙信號學說，T 細胞的活化需要由抗原提呈細胞提供的兩個信號[5]，一個信號是主要組織相容性復合體抗原，由腫瘤細胞抗原提供的抗原特異性刺激信號；另一個信號由反應 T 細胞共刺激分子提供，常包括 CD3ζ 及 CD28 和 B7-1 分子。我們將共刺激信號對 T 細胞的活化作用和抗 CEA 單鏈抗體對腫瘤的識別功能結合起來，構建了真核表達載體[6]，并制備出了具有 CEA 陽性靶向性和有活化功能的淋巴細胞。籍此觀察對荷 CEA 陽性 KATOⅢ胃癌細胞裸鼠的治療效應，并探索 CEA 陽性靶向性淋巴細胞治療胃腸道腫瘤的可能性。
1 材料與方法
1.1 主要實驗材料
① CEA 陽性 KATOⅢ胃癌細胞系及 CEA 陰性 BGC-823 胃癌細胞系，用抗 CEA 的 T84.66 單鏈抗體（scFv）檢測證實（抗 CEA 的 T84.66 scFv 由本項目組經原核表達純化而制備[7]）。② 健康人外周血樣從 10 名健康志愿者抽取。③ BALB/c 裸鼠，4～6 周齡，雄雌不限，體質量 18～20 g，在無特定病原體條件下飼養。④ 脂質體 lipofectamineTM 2000 （LF-2000）為美國 Invitrogen 公司產品；RPMI1640 購自美國 Gibco 公司；膜聯蛋白Ⅴ-異硫氫酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒為澳大利亞 Bender Medsystems 公司產品。⑤ 白細胞介素（IL）-2 由第四軍醫大學基因所制備；質粒大量提取盒為上海華舜生物公司產品。⑥ 細胞培養板購自美國 Costar 公司；流式細胞儀為 Counter 公司產品；γ 計數器為安萊公司產品；淋巴細胞分離液購自上海生化制劑一廠。
1.2 方法
1.2.1 重組真核表達載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 的構建及擴增
① 重組真核表達載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 構建方法詳見文獻[6]，進行目標基因 anti-CEA-scFv 片段的擴增，并從人白細胞中克隆出 CD3ζ 片段，通過分子生物學方法將 anti-CEA-scFv 及 CD3ζ 片段依次克隆于真核表達載體 pcDNA3.0，從而獲得重組真核表達載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0。② 重組真核表達載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 擴增方法詳見文獻[6]，將重組真核表達載體轉化入 E. coli TG1 細胞，經培養擴增后，抽提質粒載體，用密度分光儀測定 DNA 定量后備用。
1.2.2 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分離與培養
詳細步驟按文獻[8]的方法進行。無菌抽取健康志愿者的外周血，EDTA 抗凝，Ficoli 密度梯度離心法分離并獲得 PBMC。在末次離心后，將獲取的 PBMC 重懸于含胎牛血清的 RPMI 1640 培養液，原代培養并計數。用 2 mL RPMI 1640+10% 胎牛血清+IL-2（工作濃度為 500 U/mL）重懸細胞；置于培養瓶中在 37 ℃、5% CO2 孵箱中培養。
1.2.3 CEA 陽性靶向性淋巴細胞的制備
用脂質體介導的細胞轉染方法，按照 LF-2000 產品說明書進行操作。首先將 PBMC（2～6）×105個/mL 接種于 12 孔培養板，加入無血清的培養基 1 mL。用 100 μL 無血清的 RPMI 1640 培養液稀釋的 4 μL LF-2000，室溫孵育 5 min。將擬轉染的重組真核表達載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 DNA 的淋巴細胞簡稱為靶淋巴細胞，轉染空載體 pcDNA3.0 DNA 的淋巴細胞簡稱為空載體淋巴細胞。靶淋巴細胞用無血清的 RPMI 1640 培養液稀釋 2 μg 重組真核表達載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 DNA，與已稀釋好的 LF-2000 充分混合，并在室溫下孵育 20 min 形成 DNA-LF-2000 混合物；培養板中每孔 PBMC 中加入 200 μL 上述 DNA-LF-2000 混合物，孵育 6 h 后換液以減輕脂質體對淋巴細胞的毒性，以此獲得靶淋巴細胞。空載體淋巴細胞用 2 μg pcDNA3.0 DNA 與已稀釋好的 LF-2000 充分混合，并在室溫下孵育 20 min 形成 DNA-LF-2000 混合物；培養板中每孔 PBMC 中加入 200 μL 上述 DNA-LF-2000 混合物，以此獲得空載體淋巴細胞。轉染各組原代淋巴細胞原代培養，以待觀察對荷瘤小鼠的治療效果。
1.2.4 不同淋巴細胞與胃癌細胞共培養[8-9 ]
將 KATOⅢ胃癌細胞及 BGC-823 胃癌細胞分別培養于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件，在其對數生長期傳代使其貼壁生長。同時將不同淋巴細胞原代收集后計數，調至每份樣品 5×105個細胞，將不同淋巴細胞和胃癌細胞靶效比按 4∶1 的比例共培養。① 倒置顯微鏡觀察不同淋巴細胞與胃癌細胞共培養 24 h 后的識別情況。識別率的計數方法同病理學計數方法，取 10 個視野，取平均值作為其結合識別率。② 觀察不同淋巴細胞與 KATOⅢ胃癌細胞共培養 24 h 及 48 h 時胃癌細胞的形態學變化。③ 用靶淋巴細胞和空載體淋巴細胞分別與 KATOⅢ 和 BGC-823 胃癌細胞分別共培養 36 h 后離心，棄上清，加入終濃度 2% 的多聚甲醛固定液 500 μL 重懸細胞，通過流式細胞儀檢測 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌細胞凋亡信號膜聯蛋白Ⅴ的表達，以判斷不同淋巴細胞與 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌細胞共培養后對胃癌細胞凋亡的影響。
1.2.5 人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分組
將處于對數生長期的 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌細胞分別用生理鹽水制成細胞懸液，工作濃度為 5×106個細胞/100 μL。將上述每種胃癌細胞懸液 100 μL 分別接種于 BALB/c 裸鼠右側臀部皮下，每次各注射淋巴細胞數量為 5×105個。將建立荷 KATOⅢ胃癌細胞成功的裸鼠分為靶淋巴細胞+KATOⅢ 細胞組、空載體淋巴細胞+KATOⅢ細胞組及只荷 KATOⅢ胃癌細胞裸鼠而不注射淋巴細胞組即空白對照組 3 個亞組；建立荷 BGC-823 胃癌細胞成功的裸鼠分為靶淋巴細胞+BGC-823 細胞組和空載體淋巴細胞+BGC-823 細胞組。每組 8 只荷瘤裸鼠。分別通過尾靜脈注射靶淋巴細胞或空載體淋巴細胞于 KATOⅢ瘤裸鼠和 BGC-823 瘤裸鼠。空白對照組 8 只荷 KATOⅢ胃癌細胞裸鼠不注射淋巴細胞。觀察各組荷瘤裸鼠的生長情況，1 次/4 d，共觀察 40 d；腫瘤生長情況觀察，用游標卡尺測量腫瘤結節長徑（a）和短徑（b），1 次/5 d，計算腫瘤體積，其公式為 V=a×b2×0.5（mm3），根據腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 10.0 統計軟件進行分析，采用單因素方差分析，方差中 2 組間均數比較用最小顯著差法（LSD）。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 靶淋巴細胞對胃癌細胞的識別情況
在倒置顯微鏡高倍鏡（×200 倍）下觀察，共培養 24 h 時即發現靶淋巴細胞可與 KATOⅢ胃癌細胞緊密結合，連續取 10 個觀察視野內靶淋巴細胞對 KATOⅢ胃癌細胞的識別率為 72.3%，提示該淋巴細胞對 KATOⅢ胃癌細胞的識別能力較強；靶淋巴細胞對 BGC-823 胃癌細胞識別率為 7.8%，提示該淋巴細胞對 BGC-823 胃癌細胞的識別能力較弱。
2.2 靶淋巴細胞對胃癌細胞的殺傷作用
2.2.1 形態學觀察
在倒置顯微鏡下可見，靶淋巴細胞與 KATOⅢ胃癌細胞共培養 24 h 時，胃癌細胞增殖緩慢，細胞形態發生變化，局部發生凋亡（圖 1a）；共培養 48 h 時，胃癌細胞進一步增殖緩慢，局部凋亡明顯，出現壞死（圖 1b）；空載體淋巴細胞與 KATOⅢ胃癌細胞共培養 24 h 時，胃癌細胞增殖活躍；48 h 時腫瘤細胞無明顯受損害變化。靶淋巴細胞與 BGC-823 胃癌細胞共培養 24 h 或 48 h時，增殖均無明顯變化（圖 1c）；空載體淋巴細胞與 BGC-823 胃癌細胞共培養 24 h 時增殖未受明顯影響（圖 1d），48 h 時胃癌細胞增殖活躍，無明顯受損形態學改變。
圖1
不同淋巴細胞培養不同時相時胃癌細胞的形態學觀察結果（倒置顯微鏡 ×200）
a：靶淋巴細胞與 KATOⅢ胃癌細胞共培養 24 h；b：靶淋巴細胞與 KATOⅢ胃癌細胞共培養 48 h；c：靶淋巴細胞與 BGC-823 胃癌細胞共培養 24 h；d：空載體淋巴細胞與 BGC-823 胃癌細胞共培養 24 h
2.2.2 對細胞凋亡的影響
當靶淋巴細胞和空載體淋巴細胞分別與 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌細胞分別共培養 36 h 時，靶淋巴細胞+KATOⅢ細胞組的凋亡率明顯高于空載體淋巴細胞+KATOⅢ細胞組（P=0.032），而靶淋巴細胞+BGC-823 細胞組和空載體淋巴細胞+BGC-823 細胞組的凋亡率比較差異無統計學意義（P=0.118）。見表 1。
表1
不同淋巴細胞對不同胃癌細胞的凋亡影響（
）
2.3 靶淋巴細胞對荷瘤裸鼠腫瘤大小的影響
在觀察 40 d 內腫瘤生長曲線見圖 2。靶淋巴細胞+KATOⅢ細胞組的腫瘤體積明顯小于空載體淋巴細胞+KATOⅢ細胞組（F=5.010，P<0.01）和空白對照組（F=7.560，P<0.01）；空載體淋巴細胞+KATOⅢ細胞組和空白對照組間比較差異無統計學意義（F=1.890，P>0.05）。靶淋巴細胞+BGC-823 細胞組與空載體淋巴細胞+BGC-823 細胞組間比較差異無統計學意義（F=1.210，P>0.05）。靶淋巴細胞+KATOⅢ細胞組的腫瘤體積明顯小于靶淋巴細胞+BGC-823 細胞組（F=4.982，P<0.01）。
圖2
各組荷瘤裸鼠腫瘤生長曲線
3 討論
消化道腫瘤是常見且發病率較高的惡性腫瘤，手術治療及術后放化療尤為重要，但術后放化療不良反應大，因而探索不良反應少、對患者身心影響較小的免疫治療越來越受到重視。近年來的特異性免疫治療，尤其瞄準消化道腫瘤特異性抗原的靶向免疫治療顯示出潛在的希望和活力。
CEA 在多種消化道腫瘤中呈陽性表達，陽性率高達 90%[10]。目前已經將抗 CEA 單抗 Fab 段的核酸序列克隆化，針對 CEA 的單克隆抗體相繼出現，其中抗 CEA 的 T84.66 scFv 的功能已經明確[11-12]，其對 CEA 陽性的腫瘤具有較高的親和力及特異性[13]，而對正常組織不結合，這對消化道腫瘤尤其胃癌的診斷具有重要意義。目前，將 CEA 作為腫瘤標志物可廣泛應用于腫瘤的臨床診治和判斷其預后。
十幾年來，因在包括 CEA 在內多種腫瘤抗原的研究方面取得長足進展，腫瘤的生物治療逐漸受到重視[14]。腫瘤基因治療因此也被認為是當前最具發展潛力的腫瘤治療手段之一[15-17]。
腫瘤基因治療相當大的層面要借助于免疫治療得以實現。因為腫瘤發生、發展往往與機體免疫下調息息相關。
腫瘤免疫治療包括體液免疫治療及細胞免疫治療兩方面，通常二者結合更能發揮效用。本研究中將二者有機結合起來。在體液免疫方面，具備識別腫瘤特異性抗原功能的單鏈抗體，在腫瘤的識別中表現出明顯的優勢[18]，將其整合于淋巴細胞上，就會賦予淋巴細胞以識別腫瘤細胞的功能。在細胞免疫方面，促進 T 淋巴細胞活化就更能發揮其對腫瘤細胞的細胞毒作用；T 細胞活化的共刺激信號的功能一直被重視[19-20]，合理上調其活化功能，便于對免疫細胞的活化，這對臨床免疫非常關鍵[21]。本研究中引入 T 細胞活化的共刺激信號 CD3ζ 分子及抗 CEA 單鏈抗體，構建對胃癌靶向性融合基因的真核表達載體[6]，通過融合基因的表達使淋巴細胞具備識別腫瘤及本身活化的雙重功能，上調淋巴細胞的功能進而提高免疫療效，為基因治療提供了一個重要方法[22-23]，因其并非引入毒性分子對靶細胞的殺傷作用，所以在治療上顯得更為安全和可靠。如此設計將抗原抗體反應的特異性同 T 細胞活化所需雙信號相結合，更能降低 T 細胞的活化閾值，提高 T 細胞的活化水平[24-25]，從而使得 CEA 靶向性淋巴細胞的殺傷功能不再受主要組織相容性復合體抗原的限制。
即使限于體外細胞與實驗動物階段，通過本研究發現，靶淋巴細胞對 CEA 陽性的 KATOⅢ胃癌細胞顯示出較為理想的療效。通過觀察靶淋巴細胞與 CEA 陽性的 KATOⅢ胃癌細胞共培養發現，共培養 24 h 后，靶淋巴細胞可識別并引起 KATOⅢ胃癌細胞的凋亡；共培養 48 h 后，KATOⅢ胃癌細胞發生凋亡甚至壞死不可避免。在空載體淋巴細胞與 KATOⅢ胃癌細胞以及靶淋巴細胞與胃癌 BGC-823 細胞共培養發現，兩者并無結合。該結果提示，靶淋巴細胞中 scFv-CD3ζ 嵌合分子中抗 CEA 單鏈抗體得以表達并未影響各自的功能，從而具備了活化特性及腫瘤識別。
為了進一步觀察 CEA 靶向性淋巴細胞對 CEA 陽性胃癌細胞 KATOⅢ的殺傷效應，本研究通過檢測胃癌細胞的凋亡發現，CEA 靶向性淋巴細胞可引起 KATOⅢ胃癌細胞的凋亡，明顯高于其對 BGC-823 胃癌細胞引起的凋亡率，差異有統計學意義；也明顯高于空載體淋巴細胞引起的 KATOⅢ細胞的凋亡率，差異也有統計學意義。提示 CEA 靶向性淋巴細胞對 CEA 陽性胃癌細胞殺傷效應明顯，優于對 CEA 陰性癌細胞。未導入抗 CEA 抗體成分的淋巴細胞可能因失去了對腫瘤的識別能力，殺傷效應欠佳。
本研究分別構建胃癌細胞 KATOⅢ 及 BGC-823 荷瘤裸鼠動物模型，將靶淋巴細胞注射荷瘤裸鼠后，觀察靶淋巴細胞在體內治療效應，在不同時間內檢測腫瘤生長情況。結果顯示，靶淋巴細胞對荷瘤裸鼠的治療效果是不同的，靶淋巴細胞對荷 CEA 陽性 KATOⅢ胃癌細胞裸鼠的腫瘤具有明顯的抑制作用，明顯優于荷 CEA 陰性的 BGC-823 胃癌細胞裸鼠組。體內試驗結果證實，用靶淋巴細胞治療荷瘤裸鼠療效明顯。
本研究的初步結果提示，靶淋巴細胞可特異性地抑制荷 CEA 陽性胃癌細胞裸鼠的腫瘤生長。或許，靶淋巴細胞將為腫瘤治療提供一種比較有希望的思路。
癌胚抗原（CEA）表達于多種腫瘤[1]，尤其在消化道惡性腫瘤中明顯[2-3]，基于其生物學特性，將其作為腫瘤標志物可廣泛應用于對腫瘤的早期檢測，可為臨床腫瘤診斷提供依據并判斷預后[4]；抗 CEA 單克隆抗體也用于對消化道腫瘤的診治方面。基于 T 細胞活化的雙信號學說，T 細胞的活化需要由抗原提呈細胞提供的兩個信號[5]，一個信號是主要組織相容性復合體抗原，由腫瘤細胞抗原提供的抗原特異性刺激信號；另一個信號由反應 T 細胞共刺激分子提供，常包括 CD3ζ 及 CD28 和 B7-1 分子。我們將共刺激信號對 T 細胞的活化作用和抗 CEA 單鏈抗體對腫瘤的識別功能結合起來，構建了真核表達載體[6]，并制備出了具有 CEA 陽性靶向性和有活化功能的淋巴細胞。籍此觀察對荷 CEA 陽性 KATOⅢ胃癌細胞裸鼠的治療效應，并探索 CEA 陽性靶向性淋巴細胞治療胃腸道腫瘤的可能性。
1 材料與方法
1.1 主要實驗材料
① CEA 陽性 KATOⅢ胃癌細胞系及 CEA 陰性 BGC-823 胃癌細胞系，用抗 CEA 的 T84.66 單鏈抗體（scFv）檢測證實（抗 CEA 的 T84.66 scFv 由本項目組經原核表達純化而制備[7]）。② 健康人外周血樣從 10 名健康志愿者抽取。③ BALB/c 裸鼠，4～6 周齡，雄雌不限，體質量 18～20 g，在無特定病原體條件下飼養。④ 脂質體 lipofectamineTM 2000 （LF-2000）為美國 Invitrogen 公司產品；RPMI1640 購自美國 Gibco 公司；膜聯蛋白Ⅴ-異硫氫酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒為澳大利亞 Bender Medsystems 公司產品。⑤ 白細胞介素（IL）-2 由第四軍醫大學基因所制備；質粒大量提取盒為上海華舜生物公司產品。⑥ 細胞培養板購自美國 Costar 公司；流式細胞儀為 Counter 公司產品；γ 計數器為安萊公司產品；淋巴細胞分離液購自上海生化制劑一廠。
1.2 方法
1.2.1 重組真核表達載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 的構建及擴增
① 重組真核表達載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 構建方法詳見文獻[6]，進行目標基因 anti-CEA-scFv 片段的擴增，并從人白細胞中克隆出 CD3ζ 片段，通過分子生物學方法將 anti-CEA-scFv 及 CD3ζ 片段依次克隆于真核表達載體 pcDNA3.0，從而獲得重組真核表達載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0。② 重組真核表達載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 擴增方法詳見文獻[6]，將重組真核表達載體轉化入 E. coli TG1 細胞，經培養擴增后，抽提質粒載體，用密度分光儀測定 DNA 定量后備用。
1.2.2 外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分離與培養
詳細步驟按文獻[8]的方法進行。無菌抽取健康志愿者的外周血，EDTA 抗凝，Ficoli 密度梯度離心法分離并獲得 PBMC。在末次離心后，將獲取的 PBMC 重懸于含胎牛血清的 RPMI 1640 培養液，原代培養并計數。用 2 mL RPMI 1640+10% 胎牛血清+IL-2（工作濃度為 500 U/mL）重懸細胞；置于培養瓶中在 37 ℃、5% CO2 孵箱中培養。
1.2.3 CEA 陽性靶向性淋巴細胞的制備
用脂質體介導的細胞轉染方法，按照 LF-2000 產品說明書進行操作。首先將 PBMC（2～6）×105個/mL 接種于 12 孔培養板，加入無血清的培養基 1 mL。用 100 μL 無血清的 RPMI 1640 培養液稀釋的 4 μL LF-2000，室溫孵育 5 min。將擬轉染的重組真核表達載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 DNA 的淋巴細胞簡稱為靶淋巴細胞，轉染空載體 pcDNA3.0 DNA 的淋巴細胞簡稱為空載體淋巴細胞。靶淋巴細胞用無血清的 RPMI 1640 培養液稀釋 2 μg 重組真核表達載體 anti-CEA-scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 DNA，與已稀釋好的 LF-2000 充分混合，并在室溫下孵育 20 min 形成 DNA-LF-2000 混合物；培養板中每孔 PBMC 中加入 200 μL 上述 DNA-LF-2000 混合物，孵育 6 h 后換液以減輕脂質體對淋巴細胞的毒性，以此獲得靶淋巴細胞。空載體淋巴細胞用 2 μg pcDNA3.0 DNA 與已稀釋好的 LF-2000 充分混合，并在室溫下孵育 20 min 形成 DNA-LF-2000 混合物；培養板中每孔 PBMC 中加入 200 μL 上述 DNA-LF-2000 混合物，以此獲得空載體淋巴細胞。轉染各組原代淋巴細胞原代培養，以待觀察對荷瘤小鼠的治療效果。
1.2.4 不同淋巴細胞與胃癌細胞共培養[8-9 ]
將 KATOⅢ胃癌細胞及 BGC-823 胃癌細胞分別培養于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件，在其對數生長期傳代使其貼壁生長。同時將不同淋巴細胞原代收集后計數，調至每份樣品 5×105個細胞，將不同淋巴細胞和胃癌細胞靶效比按 4∶1 的比例共培養。① 倒置顯微鏡觀察不同淋巴細胞與胃癌細胞共培養 24 h 后的識別情況。識別率的計數方法同病理學計數方法，取 10 個視野，取平均值作為其結合識別率。② 觀察不同淋巴細胞與 KATOⅢ胃癌細胞共培養 24 h 及 48 h 時胃癌細胞的形態學變化。③ 用靶淋巴細胞和空載體淋巴細胞分別與 KATOⅢ 和 BGC-823 胃癌細胞分別共培養 36 h 后離心，棄上清，加入終濃度 2% 的多聚甲醛固定液 500 μL 重懸細胞，通過流式細胞儀檢測 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌細胞凋亡信號膜聯蛋白Ⅴ的表達，以判斷不同淋巴細胞與 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌細胞共培養后對胃癌細胞凋亡的影響。
1.2.5 人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分組
將處于對數生長期的 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌細胞分別用生理鹽水制成細胞懸液，工作濃度為 5×106個細胞/100 μL。將上述每種胃癌細胞懸液 100 μL 分別接種于 BALB/c 裸鼠右側臀部皮下，每次各注射淋巴細胞數量為 5×105個。將建立荷 KATOⅢ胃癌細胞成功的裸鼠分為靶淋巴細胞+KATOⅢ 細胞組、空載體淋巴細胞+KATOⅢ細胞組及只荷 KATOⅢ胃癌細胞裸鼠而不注射淋巴細胞組即空白對照組 3 個亞組；建立荷 BGC-823 胃癌細胞成功的裸鼠分為靶淋巴細胞+BGC-823 細胞組和空載體淋巴細胞+BGC-823 細胞組。每組 8 只荷瘤裸鼠。分別通過尾靜脈注射靶淋巴細胞或空載體淋巴細胞于 KATOⅢ瘤裸鼠和 BGC-823 瘤裸鼠。空白對照組 8 只荷 KATOⅢ胃癌細胞裸鼠不注射淋巴細胞。觀察各組荷瘤裸鼠的生長情況，1 次/4 d，共觀察 40 d；腫瘤生長情況觀察，用游標卡尺測量腫瘤結節長徑（a）和短徑（b），1 次/5 d，計算腫瘤體積，其公式為 V=a×b2×0.5（mm3），根據腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 10.0 統計軟件進行分析，采用單因素方差分析，方差中 2 組間均數比較用最小顯著差法（LSD）。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 靶淋巴細胞對胃癌細胞的識別情況
在倒置顯微鏡高倍鏡（×200 倍）下觀察，共培養 24 h 時即發現靶淋巴細胞可與 KATOⅢ胃癌細胞緊密結合，連續取 10 個觀察視野內靶淋巴細胞對 KATOⅢ胃癌細胞的識別率為 72.3%，提示該淋巴細胞對 KATOⅢ胃癌細胞的識別能力較強；靶淋巴細胞對 BGC-823 胃癌細胞識別率為 7.8%，提示該淋巴細胞對 BGC-823 胃癌細胞的識別能力較弱。
2.2 靶淋巴細胞對胃癌細胞的殺傷作用
2.2.1 形態學觀察
在倒置顯微鏡下可見，靶淋巴細胞與 KATOⅢ胃癌細胞共培養 24 h 時，胃癌細胞增殖緩慢，細胞形態發生變化，局部發生凋亡（圖 1a）；共培養 48 h 時，胃癌細胞進一步增殖緩慢，局部凋亡明顯，出現壞死（圖 1b）；空載體淋巴細胞與 KATOⅢ胃癌細胞共培養 24 h 時，胃癌細胞增殖活躍；48 h 時腫瘤細胞無明顯受損害變化。靶淋巴細胞與 BGC-823 胃癌細胞共培養 24 h 或 48 h時，增殖均無明顯變化（圖 1c）；空載體淋巴細胞與 BGC-823 胃癌細胞共培養 24 h 時增殖未受明顯影響（圖 1d），48 h 時胃癌細胞增殖活躍，無明顯受損形態學改變。
圖1
不同淋巴細胞培養不同時相時胃癌細胞的形態學觀察結果（倒置顯微鏡 ×200）
a：靶淋巴細胞與 KATOⅢ胃癌細胞共培養 24 h；b：靶淋巴細胞與 KATOⅢ胃癌細胞共培養 48 h；c：靶淋巴細胞與 BGC-823 胃癌細胞共培養 24 h；d：空載體淋巴細胞與 BGC-823 胃癌細胞共培養 24 h
2.2.2 對細胞凋亡的影響
當靶淋巴細胞和空載體淋巴細胞分別與 KATOⅢ和 BGC-823 胃癌細胞分別共培養 36 h 時，靶淋巴細胞+KATOⅢ細胞組的凋亡率明顯高于空載體淋巴細胞+KATOⅢ細胞組（P=0.032），而靶淋巴細胞+BGC-823 細胞組和空載體淋巴細胞+BGC-823 細胞組的凋亡率比較差異無統計學意義（P=0.118）。見表 1。
表1
不同淋巴細胞對不同胃癌細胞的凋亡影響（
）
2.3 靶淋巴細胞對荷瘤裸鼠腫瘤大小的影響
在觀察 40 d 內腫瘤生長曲線見圖 2。靶淋巴細胞+KATOⅢ細胞組的腫瘤體積明顯小于空載體淋巴細胞+KATOⅢ細胞組（F=5.010，P<0.01）和空白對照組（F=7.560，P<0.01）；空載體淋巴細胞+KATOⅢ細胞組和空白對照組間比較差異無統計學意義（F=1.890，P>0.05）。靶淋巴細胞+BGC-823 細胞組與空載體淋巴細胞+BGC-823 細胞組間比較差異無統計學意義（F=1.210，P>0.05）。靶淋巴細胞+KATOⅢ細胞組的腫瘤體積明顯小于靶淋巴細胞+BGC-823 細胞組（F=4.982，P<0.01）。
圖2
各組荷瘤裸鼠腫瘤生長曲線
3 討論
消化道腫瘤是常見且發病率較高的惡性腫瘤，手術治療及術后放化療尤為重要，但術后放化療不良反應大，因而探索不良反應少、對患者身心影響較小的免疫治療越來越受到重視。近年來的特異性免疫治療，尤其瞄準消化道腫瘤特異性抗原的靶向免疫治療顯示出潛在的希望和活力。
CEA 在多種消化道腫瘤中呈陽性表達，陽性率高達 90%[10]。目前已經將抗 CEA 單抗 Fab 段的核酸序列克隆化，針對 CEA 的單克隆抗體相繼出現，其中抗 CEA 的 T84.66 scFv 的功能已經明確[11-12]，其對 CEA 陽性的腫瘤具有較高的親和力及特異性[13]，而對正常組織不結合，這對消化道腫瘤尤其胃癌的診斷具有重要意義。目前，將 CEA 作為腫瘤標志物可廣泛應用于腫瘤的臨床診治和判斷其預后。
十幾年來，因在包括 CEA 在內多種腫瘤抗原的研究方面取得長足進展，腫瘤的生物治療逐漸受到重視[14]。腫瘤基因治療因此也被認為是當前最具發展潛力的腫瘤治療手段之一[15-17]。
腫瘤基因治療相當大的層面要借助于免疫治療得以實現。因為腫瘤發生、發展往往與機體免疫下調息息相關。
腫瘤免疫治療包括體液免疫治療及細胞免疫治療兩方面，通常二者結合更能發揮效用。本研究中將二者有機結合起來。在體液免疫方面，具備識別腫瘤特異性抗原功能的單鏈抗體，在腫瘤的識別中表現出明顯的優勢[18]，將其整合于淋巴細胞上，就會賦予淋巴細胞以識別腫瘤細胞的功能。在細胞免疫方面，促進 T 淋巴細胞活化就更能發揮其對腫瘤細胞的細胞毒作用；T 細胞活化的共刺激信號的功能一直被重視[19-20]，合理上調其活化功能，便于對免疫細胞的活化，這對臨床免疫非常關鍵[21]。本研究中引入 T 細胞活化的共刺激信號 CD3ζ 分子及抗 CEA 單鏈抗體，構建對胃癌靶向性融合基因的真核表達載體[6]，通過融合基因的表達使淋巴細胞具備識別腫瘤及本身活化的雙重功能，上調淋巴細胞的功能進而提高免疫療效，為基因治療提供了一個重要方法[22-23]，因其并非引入毒性分子對靶細胞的殺傷作用，所以在治療上顯得更為安全和可靠。如此設計將抗原抗體反應的特異性同 T 細胞活化所需雙信號相結合，更能降低 T 細胞的活化閾值，提高 T 細胞的活化水平[24-25]，從而使得 CEA 靶向性淋巴細胞的殺傷功能不再受主要組織相容性復合體抗原的限制。
即使限于體外細胞與實驗動物階段，通過本研究發現，靶淋巴細胞對 CEA 陽性的 KATOⅢ胃癌細胞顯示出較為理想的療效。通過觀察靶淋巴細胞與 CEA 陽性的 KATOⅢ胃癌細胞共培養發現，共培養 24 h 后，靶淋巴細胞可識別并引起 KATOⅢ胃癌細胞的凋亡；共培養 48 h 后，KATOⅢ胃癌細胞發生凋亡甚至壞死不可避免。在空載體淋巴細胞與 KATOⅢ胃癌細胞以及靶淋巴細胞與胃癌 BGC-823 細胞共培養發現，兩者并無結合。該結果提示，靶淋巴細胞中 scFv-CD3ζ 嵌合分子中抗 CEA 單鏈抗體得以表達并未影響各自的功能，從而具備了活化特性及腫瘤識別。
為了進一步觀察 CEA 靶向性淋巴細胞對 CEA 陽性胃癌細胞 KATOⅢ的殺傷效應，本研究通過檢測胃癌細胞的凋亡發現，CEA 靶向性淋巴細胞可引起 KATOⅢ胃癌細胞的凋亡，明顯高于其對 BGC-823 胃癌細胞引起的凋亡率，差異有統計學意義；也明顯高于空載體淋巴細胞引起的 KATOⅢ細胞的凋亡率，差異也有統計學意義。提示 CEA 靶向性淋巴細胞對 CEA 陽性胃癌細胞殺傷效應明顯，優于對 CEA 陰性癌細胞。未導入抗 CEA 抗體成分的淋巴細胞可能因失去了對腫瘤的識別能力，殺傷效應欠佳。
本研究分別構建胃癌細胞 KATOⅢ 及 BGC-823 荷瘤裸鼠動物模型，將靶淋巴細胞注射荷瘤裸鼠后，觀察靶淋巴細胞在體內治療效應，在不同時間內檢測腫瘤生長情況。結果顯示，靶淋巴細胞對荷瘤裸鼠的治療效果是不同的，靶淋巴細胞對荷 CEA 陽性 KATOⅢ胃癌細胞裸鼠的腫瘤具有明顯的抑制作用，明顯優于荷 CEA 陰性的 BGC-823 胃癌細胞裸鼠組。體內試驗結果證實，用靶淋巴細胞治療荷瘤裸鼠療效明顯。
本研究的初步結果提示，靶淋巴細胞可特異性地抑制荷 CEA 陽性胃癌細胞裸鼠的腫瘤生長。或許，靶淋巴細胞將為腫瘤治療提供一種比較有希望的思路。
