引用本文： 姚磊, 林雨佳, 高爽, 姜明山, 馬東來, 王夫景, 喬鵬飛. miR-34a 通過調控 TGF-β/Smad4 信號通路激活自噬而降低結腸癌細胞對奧沙利鉑的耐藥性. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(6): 680-688. doi: 10.7507/1007-9424.201708098 復制
根據 2012 年世界衛生組織癌癥研究中心數據，全球每年新發結直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）140 萬例，僅次于乳腺癌和肺癌，位居腫瘤發病率的第 3 位；因 CRC 死亡人數達 69 萬例，居腫瘤死因的第 4 位[1]。根據我國腫瘤登記中心的統計，2015 年我國新發 CRC 37 萬例，死亡人數達 19.1 萬例，CRC 的發生率及死亡率均呈上升趨勢，在腫瘤中均位居第 5 位[2]。根據美國癌癥聯合委員會第 7 版 TNM 分期標準[3]，目前Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期 CRC 患者的 5 年生存率分別為 90.1%、72.6%、53.8% 和 10.4%[4]。然而，CRC 患者在被確診時有 50%～60% 的患者的腫瘤已發生轉移，這其中有 80%～90% 的患者已經錯失手術時機[5-6]。因此，化療在 CRC 的治療過程中不可或缺。目前，以奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）為代表藥物的第 3 代鉑化合物聯合化療被認為是輔助治療結腸癌的標準化治療方案，但由于結腸癌細胞對 OXA 產生了耐藥性，因而在臨床中該方案的總體療效并不理想[7]。微小 RNA（microRNA，miR）是真核生物中的一類長度為 20～25 個核苷酸、參與基因轉錄后水平調控的小分子非編碼 RNA。作為一類高度保守的 miR，其在生物體內發揮重要的調節作用。近年研究[8]證實，miR-34a 與腫瘤的發生、發展以及耐藥機制關系密切。另有研究[9]報道，miR-34a 通過調節腫瘤細胞的自噬水平來調控腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。筆者團隊以往的研究[10]表明，miR-34a 通過抑制轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad 信號通路來抑制人類膽管癌的侵襲轉移和上皮間質轉化。然而，miR-34a 調控的 TGF-β/Smad 信號通路與結腸癌細胞腫瘤耐藥性的關系仍不明確。因此，本研究旨在探討 miR-34a 調節結腸癌細胞對 OXA 的耐藥作用及其機制。
1 材料和方法
1.1 研究對象
回顧性收集 2013–2015 年期間于哈爾濱醫科大學附屬第二醫院接受根治性手術、術后接受了以 OXA 為基礎藥物的同種聯合化療方案的結腸癌患者 47 例，其中男 20 例，女 27 例；年齡 48～75 歲，平均年齡為 61 歲；所有結腸癌患者均經術后病理學檢查確診。在患者獲得知情同意的情況下，分別于化療前和化療完成后 24 h 采集血樣。本研究取得哈爾濱醫科大學倫理審查委員會的批準。
1.2 主要材料、試劑和設備
PCR 引物合成、has-miR-34a mimics 及 has-miR-34a mimics 對照均購自上海吉瑪公司；TRIzol、LipofectamineTM 2000、驢抗鼠 Alexa Fluor 680 二抗以及驢抗兔 Alexa Fluor 680 二抗均購自美國 Invitrogen 公司；PCR 逆轉錄采用 High Capacity cDNA Reverse Transcription 試劑盒，miRNA 分離純化采用 mir Vana miRNA 分離試劑盒，均購自美國 Applied Biosystems 公司； 胎牛血清及 DMEM 培養基購自 Gibco 公司；一抗 LC3、Beclin1、TGF-β、Smad4 及 β-actin 均購自美國 Santa Cruz 公司；細胞計數試劑盒（CCK-8）購自武漢博士德公司；單丹磺酰尸胺（MDC）和自噬抑制劑 3-MA 均購自美國 Sigma 公司；凋亡試劑盒購自美國 Becton Dickinson 公司；自噬激活劑雷帕霉素購自美國 CST 公司；人結腸癌細胞株 HT29 購自中國科學院細胞庫。
1.3 細胞培養
結腸癌 HT29 細胞常規培養于加入 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養基中，加入 1% 雙抗（青霉素和鏈霉素的濃度均為 100 U/mL），置于 37 ℃、5% CO2 培養箱中恒溫培養。48～72 h 傳代。實驗細胞均為活力良好的對數生長期細胞。
1.4 結腸癌耐 OXA 細胞株的制備及培養
調整 HT29 細胞的細胞密度為 1×104 個/mL，接種于 6 孔板中，在培養基中加入 2 μmol/L OXA。每培養 48 h 后將培養濃度增加 1 μmol/L，重復 10 次后獲得人結腸癌耐 OXA 細胞株，即 HT29-OXA 細胞，再將 HT29-OXA 細胞培養于含 2 μmol/L OXA 的培養基內備用[11]。
1.5 實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）法檢測 miR-34a、TGF-β mRNA 及 Smad4 mRNA 的表達
采用 TRIzol 試劑盒提取結腸癌細胞系和患者血液中的總 RNA，按試劑盒說明書逆轉錄為 cDNA。設計、合成 Smad4、TGF-β、β-actin、miR-34a 以及 U6 基因的引物以進行 qRT-PCR 擴增（LC3、Beclin1、TGF-β 以及 Smad4 mRNA 的表達水平以 β-actin 為內參；miR-34a 的表達水平以 U6 基因為內參，引物序列見表 1，具體操作均按試劑盒說明書進行。根據 Ct 值計算目的基因的相對表達水平[10]。
表1
qRT-PCR 引物序列
1.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測目的蛋白的表達
提取結腸癌細胞系總蛋白，以聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后采用半干法轉膜，10% 脫脂牛奶封閉2 h 后，分別加入目的蛋白的一抗，4 ℃ 過夜孵育，次日加入 Alexa Fluor 680 驢抗鼠 IgG（H+L）或 Alexa Fluor 680 驢抗兔 IgG（H+L）二抗（1∶5 000），37 ℃ 孵育 1 h。清洗后利用 Odyssey?紅外成像系統檢測目的蛋白的相對表達水平[8]。目的蛋白的一抗信息見表 2。
表2
目的蛋白的一抗
1.7 miR-34a 轉染結腸癌細胞系
采用 miRBase 數據庫獲取 miR-34a 序列，由上海吉瑪公司設計合成 miR-34a 質粒，取對數生長期的 HT29 及 HT29-OXA 細胞接種于 96 孔板中（3×103個/mL），按試劑盒說明書操作，使用 LipofetamineTM 2000 將 miR-34a 質粒或空白對照質粒轉染結腸癌細胞。實驗分 3 組：空白對照組、陰性對照組及 miR-34a 質粒轉染組。每組設 3 個平行孔，實驗重復 3 次。轉染 48 h 后采用 qRT-PCR 方法檢測 3 組細胞中 miR-34a 的表達水平，采用 Western blot 方法檢測 TGF-β、Smad4 以及自噬、凋亡相關蛋白的表達水平，采用流式細胞儀分析細胞凋亡及自噬水平變化[10]。
1.8 分析細胞生存率
取對數生長期的 HT29 及 HT29-OXA 細胞接種于 96 孔板中（3×103 個/mL），以含 10% 血清的培養基培養 24 h 后將培養基更換為含有不同濃度 OXA（0、1、5、10、15、20、50 及 100 μmol/L）的無血清培養基繼續培養 24 h。每孔加入 CCK-8 工作液 10 μL，培養 2 h 后，在 570 nm 處測定吸光度。實驗分 6 組：以未經處理的細胞作為空白對照組，10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 的細胞為 OXA 組，以 5 μmol/L 自噬抑制劑 3-MA 處理 2 h 的細胞為3-MA 組，以 10 μmol/L 自噬激活劑雷帕霉素處理2 h 的細胞為雷帕霉素組，以 5 μmol/L 自噬抑制劑3-MA 處理 2 h 并以 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 的細胞為 3-MA+OXA 組，以 10 μmol/L 雷帕霉素處理 2 h 并以 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 的細胞為雷帕霉素+OXA 組。每組設 3 個平行孔，實驗重復3 次。根據公式計算細胞存活率（%）：實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%[9]。
1.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡和自噬
以流式細胞儀對細胞凋亡和自噬水平進行評估[10]。計數 1×104個對數生長期的 HT29 及 HT29-OXA 細胞，以 PBS 溶液制備 400 μL 細胞懸液；加入 10 μL 辣根過氧化酶標記的膜聯蛋白 V（Annexin V-FITC）和 5 μL 碘化丙啶（PI），在室溫下避光孵育 30 min 后以流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗分 7 組：以未經處理的細胞作為空白對照組，miR-34a 質粒轉染組，以經 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 的細胞為 OXA 組，以經 5 μmol/L 自噬抑制劑 3-MA 處理 2 h 的細胞為 3-MA 組，以轉染 miR-34a 質粒并以 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 的細胞為 miR-34a 轉染+OXA 組，以 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h并加入 5 μmol/L 自噬抑制劑 3-MA 處理 2 h 的細胞為 OXA+3-MA 組，以轉染 miR-34a 質粒并以10 μmol/L 濃度 OXA 處理細胞 48 h 后、加入5 μmol/L 自噬抑制劑 3-MA 處理 2 h 的細胞為miR-34a 轉染+OXA+3-MA 組。每組設 3 個平行孔，實驗重復 3 次。計數 1×104個對數生長期的 HT29 及 HT29-OXA 細胞，制備 400 μL 的 PBS 細胞懸液，然后加入 0.05 mmol/L 的 MDC，37 ℃ 孵育 45 min 后，PBS 溶液清洗 3 次，流式細胞儀檢測分析 MDC 染色陽性細胞，評估細胞自噬水平。實驗分 4 組：以未經處理的細胞作為空白對照組，miR-34a 轉染組，10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 組（OXA 組），轉染 miR-34a 質粒并以 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 細胞組（miR-34a 轉染+OXA 組）。每組設 3 個平行孔，實驗重復 3 次。細胞凋亡和自噬的檢測步驟均根據試劑盒說明書進行。
1.10 統計學方法
采用 SPSS 21.0（IBM，美國）或 GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software，美國）統計軟件進行統計學分析。2 組計量資料的差異比較采用兩樣本 t 檢驗或方差分析；Smad4 mRNA 和 miR-34a 表達的相關性分析采用簡單相關分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 接受 OXA 治療的結腸癌患者化療前后血清中 miR-34a、TGF-β mRNA 及 Smad4 mRNA 的表達
qRT-PCR 結果顯示，與化療前比較，化療后接受 OXA 治療的結腸癌患者的血清中 miR-34a 的表達水平較低，TGF-β mRNA 及 Smad4 mRNA 的表達水平較高，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖 1。相關性分析結果表明，miR-34a 和 Smad4 mRNA 的表達間呈負相關性關系（r=–0.283，P=0.029），見圖 1。
圖1
示接受 OXA 治療的結腸癌患者血清中 miR-34a、TGF-β mRNA 及 Smad4 mRNA 的表達
a：miR-34a 的相對表達水平；b：TGF-β mRNA 的相對表達水平；c：Smad4 mRNA 的相對表達水平；d：miR-34a 與 Smad4 mRNA 表達水平關系的散點圖；與化療前比較，*
2.2 miR-34a/TGF-β/Smad4 信號通路通過抑制自噬參與調節結腸癌細胞對 OXA 的耐藥性
CCK-8 結果顯示，OXA 對 HT29 及 HT29-OXA 細胞均具有明顯的生長抑制作用，HT29-OXA 細胞因對 OXA 產生了耐藥性，其存活能力明顯高于同等濃度 OXA 處理的 HT29 細胞（圖 2a）。該結果提示，構建 OXA 耐藥細胞成功。如圖 2b 所示，HT29 和 HT29-OXA 細胞中 miR-34a 的表達在 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 時下調，且在 HT29-OXA 組中 miR-34a 下調更加顯著。OXA 處理 HT29 和 HT29-OXA 細胞后， 細胞中 TGF-β 和 Smad4 mRNA 及其蛋白的表達均明顯上調，且 HT29-OXA 組上調更明顯（圖 2c–圖 2e）。該結果提示，miR-34a/TGF-β/Smad4 信號通路通過抑制自噬參與調節結腸癌細胞對 OXA 的耐藥性。
圖2
miR-34a 通過抑制 TGF-β/Smad4 信號通路調節結腸癌細胞的耐藥性
a：CCK-8 實驗結果提示，OXA 對 HT29 及 HT29-OXA 細胞均具有明顯的生長抑制作用，HT29-OXA 細胞的存活能力明顯高于 HT29 細胞；b：OXA 處理抑制了 miR-34a 在 HT29 和 HT29-OXA 細胞中的表達；c、d 和 e：OXA 促進 TGF-β mRNA 和 Smad4 mRNA 在 HT29 和 HT29-OXA 細胞中的表達；同細胞類型中與空白對照組比較，*
2.3 miR-34a 通過靶向調節 Smad4 表達抑制 TGF-β信號通路的激活
TargetScan 軟件分析結果與本研究前期實驗結果相一致[10]，Smad4 基因 3′-非編碼區與 miR-34a 存在堿基互補位點（圖 3a）。圖 3b 結果顯示，miR-34a成功轉染結腸癌細胞系；與空白對照組和陰性對照組比較，miR-34a 轉染組細胞中 Smad4 及 TGF-β 蛋白的表達減弱（圖 3c）。該結果提示，miR-34a 通過靶向調節 Smad4 的表達抑制 TGF-β 信號通路的激活。
圖3
miR-34a 靶向調節 Smad4 表達抑制 TGF-β 信號通路
a：TargetScan 分析結果提示 miR-34a 與 Smad4 基因的 3′-非編碼區存在堿基互補位點；b：同細胞類型中與空白對照組和陰性對照組比較，*
2.4 自噬的激活誘導結腸癌細胞對 OXA 耐藥
本研究結果顯示：以 OXA 處理 HT29 和 HT29-OXA 細胞后，導致 MDC 染色陽性率均增高，HT29-OXA 細胞 MDC 染色陽性率增高更加顯著（圖 4a和圖 4b）。Western blot 結果顯示，不論是否給予 OXA 處理，HT29-OXA 細胞的 LC3 Ⅱ和 Beclin1的表達水平均明顯高于 HT29 細胞（圖 4c）。自噬抑制劑 3-MA 促進了 OXA 誘導的細胞凋亡；自噬激活劑雷帕霉素抵抗 OXA 誘導的細胞凋亡（圖 4d）。
圖4
自噬促進結腸癌細胞對 OXA 耐藥
a 和 b：OXA 激活 HT29 和 HT29-OXA 細胞自噬，HT29-OXA 細胞自噬更活躍，同細胞類型中與空白對照組比較，**
2.5 miR-34a 通過靶向調節 TGF-β/Smad4 信號通路抑制 OXA 誘導的結腸癌細胞自噬的激活
本研究結果顯示，與空白對照組比較，miR-34a 轉染組 HT29 和 HT29-OXA 細胞的 MDC 染色陽性率均明顯降低，OXA 處理組 MDC 染色陽性率均明顯增高；同細胞類型中與 OXA 組比較，同時轉染 miR-34a mimics 并以 OXA 處理結腸癌細胞時，MDC 染色陽性率均明顯降低（圖 5a和5b）。Western blot 結果顯示，與空白對照組比較，miR-34a 轉染組 HT29 和 HT29-OXA 細胞中 LC3Ⅱ、Beclin1、TGF-β 及 Smad4 蛋白的表達均下調，OXA 組 LC3Ⅱ、Beclin1、TGF-β 及 Smad4 蛋白的表達均明顯上調；同細胞類型中與 OXA 組比較，同時轉染 miR-34a mimics 并以 OXA 處理結腸癌細胞時，細胞中 LC3Ⅱ、Beclin1、TGF-β 以及 Smad4 蛋白的表達均明顯下調（圖 5c）。該結果提示，miR-34a 通過抑制 TGF-β/Smad4 信號通路調節 OXA 誘導的結腸癌細胞自噬的激活。
圖5
miR-34a 抑制 TGF-β/Smad4 信號通路抑自噬
a 和 b：miR-34a 抑制細胞自噬，OXA 促進細胞自噬，miR-34a 轉染+OXA 組細胞的自噬被抑制，同細胞類型內與空白對照組比較，**
2.6 過表達 miR-34a 抑制 TGF-β/Smad4 信號通路抑制自噬，促進 OXA 誘導的 結腸癌細胞凋亡
為了明確結腸癌細胞中 OXA 誘導的細胞凋亡機制，本研究以 miR-34a mimics 轉染結腸癌細胞系，并以自噬抑制劑 3-MA 和 OXA 分別處理結腸癌細胞，評估細胞凋亡情況。實驗結果如圖 6a 和圖 6b所示，3-MA 提高了 HT29 和 HT29-OXA 細胞中 OXA 誘導的細胞凋亡；Western blot 結果提示，3-MA 導致各組結腸癌細胞中 LC3Ⅱ、BeclinⅠ、TGF-β 以及 Smad4 的表達下調（圖 6c）。該結果提示，自噬的激活可能作為一種保護機制抑制 OXA 誘導的結腸癌細胞凋亡，miR-34a/TGF-β/Smad4 信號通路在此過程中發揮重要的調控作用。
圖6
過表達 miR-34a 通過抑制 TGF-β/Smad4 信號通路來抑制自噬，促進 OXA 誘導的結腸癌細胞凋亡
a 和 b：3-MA 促進 HT29 和 HT29-OXA 細胞凋亡，同細胞類型中與空白對照組比較，**
3 討論
本研究發現，在接受 OXA 系統化療后，患者外周血中的 miR-34a 水平顯著降低；進一步研究證實，miR-34a 通過靶向調節 Smad4 的表達抑制自噬的激活；更重要的是，自噬抑制劑促進 miR-34a 誘導的細胞凋亡；miR-34a 可通過抑制結腸癌細胞的自噬來增加結腸癌細胞的耐藥性。有文獻[12]報道，TGF-β/Smad4 信號通路在對自噬的調節中發揮重要作用。本研究進一步證實，OXA 治療通過抑制 miR-34a 的表達和激活 TGF-β/Smad4 信號通路，導致自噬水平上調，被激活的自噬具有抵抗 OXA 誘導的細胞凋亡的作用。
結腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，其發病率和死亡率均有上升趨勢。結腸癌起病隱匿，大部分患者診斷時已為中晚期，即使接受手術治療，5 年生存率僅為 25% 左右；因此，化學藥物治療在 CRC 的治療中占有不可或缺的地位[13]。自噬在細胞生命過程中發揮重要的調控作用[14]，細胞自噬與凋亡的關系也是目前研究的熱點[15]。近年有研究[16]報道，自噬可削弱化療效果和增強腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。Lv 等[17]發現，過表達 CD44v6d 基因可通過激活自噬誘導腫瘤細胞產生耐藥。另有文獻[18]報道：自噬具有抵抗 OXA 誘導的結腸癌干細胞凋亡和促進細胞存活的作用。自噬作為一種提高腫瘤耐藥性、促進腫瘤細胞存活的潛在機制，選擇性抑制細胞自噬將有可能改善化療效果。本研究的結果提示，OXA 誘導結腸癌細胞自噬激活，自噬保護結腸癌細胞抵抗 OXA 誘導的細胞凋亡。
miRs 在腫瘤的發生和發展過程中發揮重要的調控作用[19]。miRs 的異常表達可影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，進而產生耐藥[20]。已有文獻[21-22]證實，miR-34a 是一種通過靶向抑制不同癌基因表達的抗癌基因，其與腫瘤細胞的耐藥性關系密切。本研究發現，接受 OXA 治療的結腸癌患者外周血中 miR-34a 的表達水平降低；在抗 OXA 結腸癌細胞系中，miR-34a 的表達水平降低；外源性過表達 miR-34a 促進 OXA 誘導的結腸癌細胞凋亡。
在 miR-34a 的靶基因中，Smad4 被認為是激活自噬的一個關鍵調控因子，是 TGF-β/Smad 信號通路的核心因子[23]。本研究結果表明，在接受 OXA 化療后，結腸癌患者外周血中 TGF-β 和 Smad4 mRNA 的表達量增加；miR-34a 與 Smad4 mRNA 的表達水平呈負相關關系，miR-34a 可抑制 TGF-β 和 Smad4 蛋白的表達。基因軟件分析結果結合雙熒光素酶報告實驗結果提示，在結腸癌細胞系中 miR-34a 可靶向抑制 Smad4 蛋白的表達，TGF-β/Smad 信號通路至少在一定程度上參與調節 miR-34a抑制細胞自噬，并誘導結腸癌細胞產生對 OXA 的耐藥性。外源性轉染 miR-34a 質粒可通過抑制細胞的自噬，降低結腸癌細胞的耐藥性，提高 OXA 的治療效果。自噬抑制劑 3-MA 增強了 OXA 以及外源性 miR-34a 誘導的細胞凋亡水平。
綜上所述，本研究結果表明，miR-34a 通過抑制 TGF-β/Smad4 信號通路的激活抑制自噬，降低結腸癌細胞對 OXA 的耐藥性，提高 OXA 的治療效果。
根據 2012 年世界衛生組織癌癥研究中心數據，全球每年新發結直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）140 萬例，僅次于乳腺癌和肺癌，位居腫瘤發病率的第 3 位；因 CRC 死亡人數達 69 萬例，居腫瘤死因的第 4 位[1]。根據我國腫瘤登記中心的統計，2015 年我國新發 CRC 37 萬例，死亡人數達 19.1 萬例，CRC 的發生率及死亡率均呈上升趨勢，在腫瘤中均位居第 5 位[2]。根據美國癌癥聯合委員會第 7 版 TNM 分期標準[3]，目前Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期 CRC 患者的 5 年生存率分別為 90.1%、72.6%、53.8% 和 10.4%[4]。然而，CRC 患者在被確診時有 50%～60% 的患者的腫瘤已發生轉移，這其中有 80%～90% 的患者已經錯失手術時機[5-6]。因此，化療在 CRC 的治療過程中不可或缺。目前，以奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）為代表藥物的第 3 代鉑化合物聯合化療被認為是輔助治療結腸癌的標準化治療方案，但由于結腸癌細胞對 OXA 產生了耐藥性，因而在臨床中該方案的總體療效并不理想[7]。微小 RNA（microRNA，miR）是真核生物中的一類長度為 20～25 個核苷酸、參與基因轉錄后水平調控的小分子非編碼 RNA。作為一類高度保守的 miR，其在生物體內發揮重要的調節作用。近年研究[8]證實，miR-34a 與腫瘤的發生、發展以及耐藥機制關系密切。另有研究[9]報道，miR-34a 通過調節腫瘤細胞的自噬水平來調控腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。筆者團隊以往的研究[10]表明，miR-34a 通過抑制轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad 信號通路來抑制人類膽管癌的侵襲轉移和上皮間質轉化。然而，miR-34a 調控的 TGF-β/Smad 信號通路與結腸癌細胞腫瘤耐藥性的關系仍不明確。因此，本研究旨在探討 miR-34a 調節結腸癌細胞對 OXA 的耐藥作用及其機制。
1 材料和方法
1.1 研究對象
回顧性收集 2013–2015 年期間于哈爾濱醫科大學附屬第二醫院接受根治性手術、術后接受了以 OXA 為基礎藥物的同種聯合化療方案的結腸癌患者 47 例，其中男 20 例，女 27 例；年齡 48～75 歲，平均年齡為 61 歲；所有結腸癌患者均經術后病理學檢查確診。在患者獲得知情同意的情況下，分別于化療前和化療完成后 24 h 采集血樣。本研究取得哈爾濱醫科大學倫理審查委員會的批準。
1.2 主要材料、試劑和設備
PCR 引物合成、has-miR-34a mimics 及 has-miR-34a mimics 對照均購自上海吉瑪公司；TRIzol、LipofectamineTM 2000、驢抗鼠 Alexa Fluor 680 二抗以及驢抗兔 Alexa Fluor 680 二抗均購自美國 Invitrogen 公司；PCR 逆轉錄采用 High Capacity cDNA Reverse Transcription 試劑盒，miRNA 分離純化采用 mir Vana miRNA 分離試劑盒，均購自美國 Applied Biosystems 公司； 胎牛血清及 DMEM 培養基購自 Gibco 公司；一抗 LC3、Beclin1、TGF-β、Smad4 及 β-actin 均購自美國 Santa Cruz 公司；細胞計數試劑盒（CCK-8）購自武漢博士德公司；單丹磺酰尸胺（MDC）和自噬抑制劑 3-MA 均購自美國 Sigma 公司；凋亡試劑盒購自美國 Becton Dickinson 公司；自噬激活劑雷帕霉素購自美國 CST 公司；人結腸癌細胞株 HT29 購自中國科學院細胞庫。
1.3 細胞培養
結腸癌 HT29 細胞常規培養于加入 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養基中，加入 1% 雙抗（青霉素和鏈霉素的濃度均為 100 U/mL），置于 37 ℃、5% CO2 培養箱中恒溫培養。48～72 h 傳代。實驗細胞均為活力良好的對數生長期細胞。
1.4 結腸癌耐 OXA 細胞株的制備及培養
調整 HT29 細胞的細胞密度為 1×104 個/mL，接種于 6 孔板中，在培養基中加入 2 μmol/L OXA。每培養 48 h 后將培養濃度增加 1 μmol/L，重復 10 次后獲得人結腸癌耐 OXA 細胞株，即 HT29-OXA 細胞，再將 HT29-OXA 細胞培養于含 2 μmol/L OXA 的培養基內備用[11]。
1.5 實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）法檢測 miR-34a、TGF-β mRNA 及 Smad4 mRNA 的表達
采用 TRIzol 試劑盒提取結腸癌細胞系和患者血液中的總 RNA，按試劑盒說明書逆轉錄為 cDNA。設計、合成 Smad4、TGF-β、β-actin、miR-34a 以及 U6 基因的引物以進行 qRT-PCR 擴增（LC3、Beclin1、TGF-β 以及 Smad4 mRNA 的表達水平以 β-actin 為內參；miR-34a 的表達水平以 U6 基因為內參，引物序列見表 1，具體操作均按試劑盒說明書進行。根據 Ct 值計算目的基因的相對表達水平[10]。
表1
qRT-PCR 引物序列
1.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測目的蛋白的表達
提取結腸癌細胞系總蛋白，以聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后采用半干法轉膜，10% 脫脂牛奶封閉2 h 后，分別加入目的蛋白的一抗，4 ℃ 過夜孵育，次日加入 Alexa Fluor 680 驢抗鼠 IgG（H+L）或 Alexa Fluor 680 驢抗兔 IgG（H+L）二抗（1∶5 000），37 ℃ 孵育 1 h。清洗后利用 Odyssey?紅外成像系統檢測目的蛋白的相對表達水平[8]。目的蛋白的一抗信息見表 2。
表2
目的蛋白的一抗
1.7 miR-34a 轉染結腸癌細胞系
采用 miRBase 數據庫獲取 miR-34a 序列，由上海吉瑪公司設計合成 miR-34a 質粒，取對數生長期的 HT29 及 HT29-OXA 細胞接種于 96 孔板中（3×103個/mL），按試劑盒說明書操作，使用 LipofetamineTM 2000 將 miR-34a 質粒或空白對照質粒轉染結腸癌細胞。實驗分 3 組：空白對照組、陰性對照組及 miR-34a 質粒轉染組。每組設 3 個平行孔，實驗重復 3 次。轉染 48 h 后采用 qRT-PCR 方法檢測 3 組細胞中 miR-34a 的表達水平，采用 Western blot 方法檢測 TGF-β、Smad4 以及自噬、凋亡相關蛋白的表達水平，采用流式細胞儀分析細胞凋亡及自噬水平變化[10]。
1.8 分析細胞生存率
取對數生長期的 HT29 及 HT29-OXA 細胞接種于 96 孔板中（3×103 個/mL），以含 10% 血清的培養基培養 24 h 后將培養基更換為含有不同濃度 OXA（0、1、5、10、15、20、50 及 100 μmol/L）的無血清培養基繼續培養 24 h。每孔加入 CCK-8 工作液 10 μL，培養 2 h 后，在 570 nm 處測定吸光度。實驗分 6 組：以未經處理的細胞作為空白對照組，10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 的細胞為 OXA 組，以 5 μmol/L 自噬抑制劑 3-MA 處理 2 h 的細胞為3-MA 組，以 10 μmol/L 自噬激活劑雷帕霉素處理2 h 的細胞為雷帕霉素組，以 5 μmol/L 自噬抑制劑3-MA 處理 2 h 并以 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 的細胞為 3-MA+OXA 組，以 10 μmol/L 雷帕霉素處理 2 h 并以 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 的細胞為雷帕霉素+OXA 組。每組設 3 個平行孔，實驗重復3 次。根據公式計算細胞存活率（%）：實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%[9]。
1.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡和自噬
以流式細胞儀對細胞凋亡和自噬水平進行評估[10]。計數 1×104個對數生長期的 HT29 及 HT29-OXA 細胞，以 PBS 溶液制備 400 μL 細胞懸液；加入 10 μL 辣根過氧化酶標記的膜聯蛋白 V（Annexin V-FITC）和 5 μL 碘化丙啶（PI），在室溫下避光孵育 30 min 后以流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗分 7 組：以未經處理的細胞作為空白對照組，miR-34a 質粒轉染組，以經 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 的細胞為 OXA 組，以經 5 μmol/L 自噬抑制劑 3-MA 處理 2 h 的細胞為 3-MA 組，以轉染 miR-34a 質粒并以 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 的細胞為 miR-34a 轉染+OXA 組，以 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h并加入 5 μmol/L 自噬抑制劑 3-MA 處理 2 h 的細胞為 OXA+3-MA 組，以轉染 miR-34a 質粒并以10 μmol/L 濃度 OXA 處理細胞 48 h 后、加入5 μmol/L 自噬抑制劑 3-MA 處理 2 h 的細胞為miR-34a 轉染+OXA+3-MA 組。每組設 3 個平行孔，實驗重復 3 次。計數 1×104個對數生長期的 HT29 及 HT29-OXA 細胞，制備 400 μL 的 PBS 細胞懸液，然后加入 0.05 mmol/L 的 MDC，37 ℃ 孵育 45 min 后，PBS 溶液清洗 3 次，流式細胞儀檢測分析 MDC 染色陽性細胞，評估細胞自噬水平。實驗分 4 組：以未經處理的細胞作為空白對照組，miR-34a 轉染組，10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 組（OXA 組），轉染 miR-34a 質粒并以 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 細胞組（miR-34a 轉染+OXA 組）。每組設 3 個平行孔，實驗重復 3 次。細胞凋亡和自噬的檢測步驟均根據試劑盒說明書進行。
1.10 統計學方法
采用 SPSS 21.0（IBM，美國）或 GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software，美國）統計軟件進行統計學分析。2 組計量資料的差異比較采用兩樣本 t 檢驗或方差分析；Smad4 mRNA 和 miR-34a 表達的相關性分析采用簡單相關分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 接受 OXA 治療的結腸癌患者化療前后血清中 miR-34a、TGF-β mRNA 及 Smad4 mRNA 的表達
qRT-PCR 結果顯示，與化療前比較，化療后接受 OXA 治療的結腸癌患者的血清中 miR-34a 的表達水平較低，TGF-β mRNA 及 Smad4 mRNA 的表達水平較高，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖 1。相關性分析結果表明，miR-34a 和 Smad4 mRNA 的表達間呈負相關性關系（r=–0.283，P=0.029），見圖 1。
圖1
示接受 OXA 治療的結腸癌患者血清中 miR-34a、TGF-β mRNA 及 Smad4 mRNA 的表達
a：miR-34a 的相對表達水平；b：TGF-β mRNA 的相對表達水平；c：Smad4 mRNA 的相對表達水平；d：miR-34a 與 Smad4 mRNA 表達水平關系的散點圖；與化療前比較，*
2.2 miR-34a/TGF-β/Smad4 信號通路通過抑制自噬參與調節結腸癌細胞對 OXA 的耐藥性
CCK-8 結果顯示，OXA 對 HT29 及 HT29-OXA 細胞均具有明顯的生長抑制作用，HT29-OXA 細胞因對 OXA 產生了耐藥性，其存活能力明顯高于同等濃度 OXA 處理的 HT29 細胞（圖 2a）。該結果提示，構建 OXA 耐藥細胞成功。如圖 2b 所示，HT29 和 HT29-OXA 細胞中 miR-34a 的表達在 10 μmol/L 濃度 OXA 處理 48 h 時下調，且在 HT29-OXA 組中 miR-34a 下調更加顯著。OXA 處理 HT29 和 HT29-OXA 細胞后， 細胞中 TGF-β 和 Smad4 mRNA 及其蛋白的表達均明顯上調，且 HT29-OXA 組上調更明顯（圖 2c–圖 2e）。該結果提示，miR-34a/TGF-β/Smad4 信號通路通過抑制自噬參與調節結腸癌細胞對 OXA 的耐藥性。
圖2
miR-34a 通過抑制 TGF-β/Smad4 信號通路調節結腸癌細胞的耐藥性
a：CCK-8 實驗結果提示，OXA 對 HT29 及 HT29-OXA 細胞均具有明顯的生長抑制作用，HT29-OXA 細胞的存活能力明顯高于 HT29 細胞；b：OXA 處理抑制了 miR-34a 在 HT29 和 HT29-OXA 細胞中的表達；c、d 和 e：OXA 促進 TGF-β mRNA 和 Smad4 mRNA 在 HT29 和 HT29-OXA 細胞中的表達；同細胞類型中與空白對照組比較，*
2.3 miR-34a 通過靶向調節 Smad4 表達抑制 TGF-β信號通路的激活
TargetScan 軟件分析結果與本研究前期實驗結果相一致[10]，Smad4 基因 3′-非編碼區與 miR-34a 存在堿基互補位點（圖 3a）。圖 3b 結果顯示，miR-34a成功轉染結腸癌細胞系；與空白對照組和陰性對照組比較，miR-34a 轉染組細胞中 Smad4 及 TGF-β 蛋白的表達減弱（圖 3c）。該結果提示，miR-34a 通過靶向調節 Smad4 的表達抑制 TGF-β 信號通路的激活。
圖3
miR-34a 靶向調節 Smad4 表達抑制 TGF-β 信號通路
a：TargetScan 分析結果提示 miR-34a 與 Smad4 基因的 3′-非編碼區存在堿基互補位點；b：同細胞類型中與空白對照組和陰性對照組比較，*
2.4 自噬的激活誘導結腸癌細胞對 OXA 耐藥
本研究結果顯示：以 OXA 處理 HT29 和 HT29-OXA 細胞后，導致 MDC 染色陽性率均增高，HT29-OXA 細胞 MDC 染色陽性率增高更加顯著（圖 4a和圖 4b）。Western blot 結果顯示，不論是否給予 OXA 處理，HT29-OXA 細胞的 LC3 Ⅱ和 Beclin1的表達水平均明顯高于 HT29 細胞（圖 4c）。自噬抑制劑 3-MA 促進了 OXA 誘導的細胞凋亡；自噬激活劑雷帕霉素抵抗 OXA 誘導的細胞凋亡（圖 4d）。
圖4
自噬促進結腸癌細胞對 OXA 耐藥
a 和 b：OXA 激活 HT29 和 HT29-OXA 細胞自噬，HT29-OXA 細胞自噬更活躍，同細胞類型中與空白對照組比較，**
2.5 miR-34a 通過靶向調節 TGF-β/Smad4 信號通路抑制 OXA 誘導的結腸癌細胞自噬的激活
本研究結果顯示，與空白對照組比較，miR-34a 轉染組 HT29 和 HT29-OXA 細胞的 MDC 染色陽性率均明顯降低，OXA 處理組 MDC 染色陽性率均明顯增高；同細胞類型中與 OXA 組比較，同時轉染 miR-34a mimics 并以 OXA 處理結腸癌細胞時，MDC 染色陽性率均明顯降低（圖 5a和5b）。Western blot 結果顯示，與空白對照組比較，miR-34a 轉染組 HT29 和 HT29-OXA 細胞中 LC3Ⅱ、Beclin1、TGF-β 及 Smad4 蛋白的表達均下調，OXA 組 LC3Ⅱ、Beclin1、TGF-β 及 Smad4 蛋白的表達均明顯上調；同細胞類型中與 OXA 組比較，同時轉染 miR-34a mimics 并以 OXA 處理結腸癌細胞時，細胞中 LC3Ⅱ、Beclin1、TGF-β 以及 Smad4 蛋白的表達均明顯下調（圖 5c）。該結果提示，miR-34a 通過抑制 TGF-β/Smad4 信號通路調節 OXA 誘導的結腸癌細胞自噬的激活。
圖5
miR-34a 抑制 TGF-β/Smad4 信號通路抑自噬
a 和 b：miR-34a 抑制細胞自噬，OXA 促進細胞自噬，miR-34a 轉染+OXA 組細胞的自噬被抑制，同細胞類型內與空白對照組比較，**
2.6 過表達 miR-34a 抑制 TGF-β/Smad4 信號通路抑制自噬，促進 OXA 誘導的 結腸癌細胞凋亡
為了明確結腸癌細胞中 OXA 誘導的細胞凋亡機制，本研究以 miR-34a mimics 轉染結腸癌細胞系，并以自噬抑制劑 3-MA 和 OXA 分別處理結腸癌細胞，評估細胞凋亡情況。實驗結果如圖 6a 和圖 6b所示，3-MA 提高了 HT29 和 HT29-OXA 細胞中 OXA 誘導的細胞凋亡；Western blot 結果提示，3-MA 導致各組結腸癌細胞中 LC3Ⅱ、BeclinⅠ、TGF-β 以及 Smad4 的表達下調（圖 6c）。該結果提示，自噬的激活可能作為一種保護機制抑制 OXA 誘導的結腸癌細胞凋亡，miR-34a/TGF-β/Smad4 信號通路在此過程中發揮重要的調控作用。
圖6
過表達 miR-34a 通過抑制 TGF-β/Smad4 信號通路來抑制自噬，促進 OXA 誘導的結腸癌細胞凋亡
a 和 b：3-MA 促進 HT29 和 HT29-OXA 細胞凋亡，同細胞類型中與空白對照組比較，**
3 討論
本研究發現，在接受 OXA 系統化療后，患者外周血中的 miR-34a 水平顯著降低；進一步研究證實，miR-34a 通過靶向調節 Smad4 的表達抑制自噬的激活；更重要的是，自噬抑制劑促進 miR-34a 誘導的細胞凋亡；miR-34a 可通過抑制結腸癌細胞的自噬來增加結腸癌細胞的耐藥性。有文獻[12]報道，TGF-β/Smad4 信號通路在對自噬的調節中發揮重要作用。本研究進一步證實，OXA 治療通過抑制 miR-34a 的表達和激活 TGF-β/Smad4 信號通路，導致自噬水平上調，被激活的自噬具有抵抗 OXA 誘導的細胞凋亡的作用。
結腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，其發病率和死亡率均有上升趨勢。結腸癌起病隱匿，大部分患者診斷時已為中晚期，即使接受手術治療，5 年生存率僅為 25% 左右；因此，化學藥物治療在 CRC 的治療中占有不可或缺的地位[13]。自噬在細胞生命過程中發揮重要的調控作用[14]，細胞自噬與凋亡的關系也是目前研究的熱點[15]。近年有研究[16]報道，自噬可削弱化療效果和增強腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。Lv 等[17]發現，過表達 CD44v6d 基因可通過激活自噬誘導腫瘤細胞產生耐藥。另有文獻[18]報道：自噬具有抵抗 OXA 誘導的結腸癌干細胞凋亡和促進細胞存活的作用。自噬作為一種提高腫瘤耐藥性、促進腫瘤細胞存活的潛在機制，選擇性抑制細胞自噬將有可能改善化療效果。本研究的結果提示，OXA 誘導結腸癌細胞自噬激活，自噬保護結腸癌細胞抵抗 OXA 誘導的細胞凋亡。
miRs 在腫瘤的發生和發展過程中發揮重要的調控作用[19]。miRs 的異常表達可影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，進而產生耐藥[20]。已有文獻[21-22]證實，miR-34a 是一種通過靶向抑制不同癌基因表達的抗癌基因，其與腫瘤細胞的耐藥性關系密切。本研究發現，接受 OXA 治療的結腸癌患者外周血中 miR-34a 的表達水平降低；在抗 OXA 結腸癌細胞系中，miR-34a 的表達水平降低；外源性過表達 miR-34a 促進 OXA 誘導的結腸癌細胞凋亡。
在 miR-34a 的靶基因中，Smad4 被認為是激活自噬的一個關鍵調控因子，是 TGF-β/Smad 信號通路的核心因子[23]。本研究結果表明，在接受 OXA 化療后，結腸癌患者外周血中 TGF-β 和 Smad4 mRNA 的表達量增加；miR-34a 與 Smad4 mRNA 的表達水平呈負相關關系，miR-34a 可抑制 TGF-β 和 Smad4 蛋白的表達。基因軟件分析結果結合雙熒光素酶報告實驗結果提示，在結腸癌細胞系中 miR-34a 可靶向抑制 Smad4 蛋白的表達，TGF-β/Smad 信號通路至少在一定程度上參與調節 miR-34a抑制細胞自噬，并誘導結腸癌細胞產生對 OXA 的耐藥性。外源性轉染 miR-34a 質粒可通過抑制細胞的自噬，降低結腸癌細胞的耐藥性，提高 OXA 的治療效果。自噬抑制劑 3-MA 增強了 OXA 以及外源性 miR-34a 誘導的細胞凋亡水平。
綜上所述，本研究結果表明，miR-34a 通過抑制 TGF-β/Smad4 信號通路的激活抑制自噬，降低結腸癌細胞對 OXA 的耐藥性，提高 OXA 的治療效果。
