引用本文： 姚建鋒, 孫學軍, 閻立昆, 李小軍, 賀賽, 鄭見寶, 張曉龍, 王小強. c-Met 基因慢病毒載體的構建及其配體肝細胞生長因子對 SW480 細胞侵襲能力的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(12): 1456-1462. doi: 10.7507/1007-9424.201707057 復制
c-Met 蛋白是肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）的上皮特異性受體，屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族成員，可調控一種“侵襲性生長”的遺傳程序[1]，參與許多生理發育過程[2-3]以及腫瘤的侵襲和轉移[4-8]。HGF 是 c-Met 的配體，具有強烈促分裂和組織形成[9]、誘導上皮細胞遷移[10]、誘導血管生長[11]、參與腫瘤細胞增殖和侵襲的信號轉導過程[12]。然而在結直腸癌患者中，HGF 究竟是直接通過結合 c-Met 受體還是通過其他途徑來提高轉移能力，c-Met 在與其配體 HGF 結合后所發揮的功能是 HGF 完全作用導致的還是 HGF 部分調節所引起的，目前尚不十分清楚，因而仍需進一步研究。我們的前期研究[13]結果發現，c-Met 在結腸癌 SW480 細胞中表達較高，且 HGF 可促進該細胞的增殖和增加其體外侵襲能力。本研究通過構建 shRNA 慢病毒載體并包裝成慢病毒顆粒 shRNA-c-Met，然后用其感染 SW480 細胞進而下調 SW480 細胞內 c-Met 的表達，觀察 c-Met 下調后 HGF 對 SW480 細胞侵襲能力的影響。
1 材料與方法
1.1 主要儀器與試劑
SW480 細胞株、大腸桿菌菌株 DH5α、GV115 通用引物、Agel、Eco RⅠ酶切和慢病毒質粒 PGC-LV及相關包裝質粒均購自上海吉凱基因公司。HGF 和兔抗人 c-Met 單克隆抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司，羊抗兔多克隆二抗購自 Santa Cruz 公司，Matrigel 膠購自美國 Becton Dickinson 公司，DMEM 培養基購自 Gibco 公司，SYBR 實時定量 PCR（RT-PCR）試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。慢病毒包裝細胞 293T 細胞株購自美國典型菌種保藏中心，Trizol 和 LipofectamineTM2000 購自美國 Invitrogen 公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自 Biosea 公司，Transwell 試劑盒購自 Corning 公司。
1.2 方法
1.2.1 c-Met 基因的 RNA 干擾模板序列的設計
針對目的基因序列，依據公用網站中的 RNA 干擾序列設計原則，設計 4 條 RNA 干擾靶點序列，選擇最佳的動力學參數靶點用于后續實驗流程。應用在線 shRNA 設計軟件確定靶序列 5′-TCAACTTCTTTGTAGGCAATA-3′ 作為候選序列，檢索證實其與人類其他已知基因序列無同源性，該寡核苷酸序列以正反向組合，中間添加 Loop 序列，使寡核苷酸形成發卡結構，兩端分別帶有酶切位點，由此合成 shRNA-c-Met，其正義鏈為 5′-CCGGTCAACTTCTTTGTAGGCAATACTCGAGTATTGCCTACAAAGAAGTTGATTTTTG-3′，反義鏈為 5′-AATTCAAAAATCAACTTCTTTGTAGGCAATACTCGAGTATTGCCTACAAAGAAGTTGA-3′。同時合成序列 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′ 作為對照，其正義鏈為 5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGACAATTTTTG-3′，反義鏈為 5′-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGACAA-3′。以上序列由上海吉凱基因公司合成。靶序列的擴增片段長度為 341 bp。
1.2.2 shRNA-c-Met 慢病毒表達載體的構建
將合成后成對的引物干粉在退火緩沖液中溶解，90 ℃ 水浴 15 min，然后自然冷卻至室溫，理論配對。用 T4 DNA 連接酶將雙酶切線性化的載體和 DNA 片段（退火產物）于適當的緩沖液中行連接反應，轉化連接產物到 DH5α 感受態細胞，將 150 μL 已轉化的 DH5α 感受態細胞轉移至含有 20 mmol/L MgSO4 和氨芐霉素抗性（100 μg/mL）的溶菌肉湯（LB）瓊脂培養基上，置平板于室溫直至液體被吸收，再將平皿倒置，37 ℃ 培養，16 h 后采用 RT-PCR 鑒定陽性克隆。
1.2.3 陽性克隆的鑒定及測序
在 10 μL LB 溶液中重新懸混已挑取的轉化子，取 1 μL 作為模板，GV115 通用引物行 RT-PCR 擴增，采用 2% 瓊脂糖對產物進行凝膠電泳，挑選陽性克隆，搖菌。用質粒抽提試劑盒小量提取質粒，將抽提好的陽性克隆質粒送檢測序。
1.2.4 shRNA-c-Met 慢病毒質粒的包裝、感染及實驗分組
制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒，轉染前 24 h，對對數生長期的 293T 細胞進行胰蛋白酶消化，在含 10% 血清的培養基中調整細胞密度至 1.2×107個/20 mL，于 15 cm 細胞培養皿中進行再接種，于37 ℃、5% CO2 培養箱內培養，在24 h 后待細胞密度達到 70%～80% 時用于轉染。按照 LipofectamineTM2000使用說明將制備好的慢病毒顆粒共轉染 293T 細胞，8 h 后更換培養基為完全培養基，培養 48 h 后收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液上樣離心 10 min，除去細胞碎片后，移出病毒濃縮液，分裝后于–80 ℃ 保存。實驗分為正常對照組（NC 組）：正常目的細胞加 shRNA 陰性對照病毒感染細胞（NC 組又分為 NC-20 和 NC-40 2 個亞組，分別代表正常目的細胞感染 shRNA 陰性對照病毒后在 Transwell 外室中分別加入濃度為 20 和 40 ng/mL 的 HGF）。c-Met 基因敲除組（KD 組）：正常目的細胞加 RNA 干擾靶點病毒感染細胞（KD 組又分為 KD-20 和 KD-40 2 個亞組，分別代表正常目的細胞感染目的基因 shRNA-c-Met 病毒后在 Transwell 外室中分別加入濃度為 20 和 40 ng/mL 的 HGF；KD1、KD2、KD3 和 KD4 組分別表示針對目的基因不同的 RNA 干擾靶點，以挑選其中最有效的干擾靶點）。空白對照組（CON 組）：正常目的細胞加未感染任何病毒的細胞。按實驗設計的組別分別加入慢病毒顆粒，進行 SW480 細胞轉染。
1.2.5 RT-PCR 法檢測各組 c-Met mRNA 的表達并計算基因敲減效率
收集生長良好的 SW480 細胞，按照 Trizol 操作步驟進行 RNA 提取，參照M-MLV 操作說明反轉錄生成 cDNA，用 RT-PCR 試劑盒檢測 c-Met mRNA 表達情況。c-Met 基因上游引物為 5′-AGTCATAGGAAGAGGGCATT-3′，下游引物為 5′-CTTCACTTCGCAGGCAGA-3′，擴增片段長度為 206 bp；GAPDH 基因上游引物為 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物為 5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴增片段長度為 121 bp。采用兩步法進行 RT-PCR 檢測，用 Δct 表示 c-Met mRNA 的相對表達量，其計算公式按操作手冊所提供：Δct=目的基因ct值–GAPDH基因ct值 ，重復步驟 3 次，取均值；進而計算基因敲減效率，其計算公式按操作手冊所提供：基因敲減效率=（NC 組c-Met mRNA 表達量–KD 組 c-Met mRNA 表達量）×100%。
1.2.6 Western blot 法檢測各組 c-Met 蛋白表達
用 0.25% 胰酶消化轉染后的細胞，加超純水，調整細胞密度為 1×107個/100 μL，同時加入相等體積上樣緩沖液，煮沸 20 min 后上樣離心 5 min，取上清液上樣，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結束后，轉移蛋白到聚偏氟乙烯膜上，轉膜后，用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 緩沖液 4 ℃ 封閉、過夜。次日，用 TBST 緩沖液反復洗膜 3 次，加入多克隆兔抗 c-Met 抗體和多克隆兔抗 GAPDH 抗體（1∶2 000），室溫孵育 1 h，再次 TBST 洗膜 3 次，采用化學發光法曝光、顯影，計算機圖像分析系統檢測影片的灰度值，結果用 c-Met/GAPDH 相對值表示。
1.2.7 采用流式細胞儀檢測細胞凋亡
轉染細胞培養 72 h 后收集細胞。配置標記液，每 100 μL 標記液可標記 1×105～1×106個細胞，含 Annexin V-FITC 1 μL 和碘化丙啶（PI）10 μL，重新懸混細胞后，再避光、室溫孵育 5 min，加入結合緩沖液 400 μL，在 488 nm 激發波長下行流式細胞儀檢測，每次計數 10 000 個細胞，結果用凋亡率表示，凋亡率=凋亡細胞數/（凋亡細胞數＋正常細胞數）×100%。
1.2.8 沉默 c-Met 后 Transwell 侵襲實驗
將各組穩定轉染細胞用低血清培養液配制成單細胞懸液，濃度為 2×105個細胞/mL，于 Transwell 小室上室接種 100 μL，下室加入 600 μL 含 30% FBS 培養基，37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，30 min 后將不同濃度 HGF 加入到各組，6 h 后移去非轉移細胞，用 Giemsa 染色液于膜下表面染色轉移細胞，3～5 min 后沖洗、晾干，顯微鏡下照相，揭下底膜，置 10% 醋酸 200 μL于 96 孔板中，待完全溶解后取 100 μL加入到另一孔中，進行 570 nm 時的光密度（OD）值檢測，計算細胞轉移率，其計算公式為：細胞轉移率=接種時 OD 值/染色后 OD 值×100%，其間接反映了穿至下室膜的細胞數，代表了細胞的侵襲能力，觀察 5 個不同視野，計數5 000 個細胞/孔，重復 3 次，計算平均值表示細胞的侵襲能力。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 16.0 統計分析軟件對數據進行分析。計量資料用均數±標準差（
±s）表示，多組間指標比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 攜帶目的基因 c-Met 的慢病毒質粒的鑒定 結果
攜帶目的基因 c-Met 的重組慢病毒質粒的 PCR 產物長度為 341 bp（插入片段長度為 34 bp），經雙酶切后沒有插入片段的空載體 PCR 產物 307 bp，鑒定結果與預期相符，見圖 1。
圖1
慢病毒質粒 RT-PCR 產物電泳圖 1：CON 組；2：NC 組；3：Marker；4–8：攜帶目的基因 c-Met 的陽性克隆組
2.2 c-Met mRNA 在各轉染組細胞中的表達及基因敲減效率情況
各組細胞中 c-Met mRNA 表達和基因敲減效率見表 1。c-Met mRNA 表達在 KD1、KD2 及 KD3 組與 NC 組比較差異均無統計學意義（P>0.05），KD4 組的 c-Met mRNA 表達明顯低于 NC 組（P<0.05）。結果提示，相對于 NC 組，KD4 組 SW480 細胞中c-Met mRNA 表達水平降低明顯，其基因敲減效率最高，達 81.4%，為最有效靶點。
表1
各轉染組細胞中 c-Met mRNA 表達和基因敲減效率
2.3 RNA 干擾下調 SW480 細胞中 c-Met 蛋白表達水平
Western blot 檢測的定性結果見圖 2。半定量結果見表 2。從表 2 可見，KD 組 SW480 細胞中c-Met 蛋白表達明顯低于 NC 組（P=0.015）和 CON 組（P=0.010），結果提示，RNA 干擾效率高。
圖2
Western blot 檢測各組細胞中 c-Met 蛋白的表達 1：KD 組；2：NC 組；3：CON 組
表2
各轉染組細胞中 c-Met 蛋白表達情況（
±s）
2.4 慢病毒轉染對轉染細胞凋亡率的影響
細胞凋亡檢測結果見圖 3 和表 3。從表 3 可見，KD 組 SW480 細胞凋亡率明顯高于 NC 組（P<0.001）和 CON 組（P<0.001）。
表3
各組細胞凋亡率情況（%，
±s）
圖3
流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況 a：CON 組；b：NC 組；c：KD 組
2.5 HGF 對慢病毒感染后 SW480 細胞侵襲能力的影響
Transwell 侵襲實驗結果見表 4。從表 4 可見，細胞轉移率在 KD 組、KD-20 組和 KD-40 組均分別明顯低于 NC 組（P<0.001）、NC-20 組（P=0.015）及 NC-40 組（P=0.017）；與 NC 組比較，NC-20 組和 NC-40 組的細胞轉移率明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.001、P<0.001），且 NC-40 組的細胞轉移率明顯高于 NC-20 組（P=0.005）；同樣，與 KD 組比較，KD-20 組和 KD-40 組的細胞轉移率明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.001、P<0.001），KD-40 組的細胞轉移率明顯高于 KD-20 組（P=0.014）。
3 討論
表4
各組細胞轉移率情況（%，
±s）
c-Met 在相當一部分人類腫瘤中呈高表達[14-18]，與腫瘤的發生、發展、轉移及患者的預后有密切關系[19-23]。有研究[24]表明，c-Met 及其配體 HGF 是調節腫瘤細胞浸潤和轉移的關鍵細胞因子，可誘導表達 c-Met 的靶細胞發揮多種作用，包括細胞增殖、分化、侵襲和遷移。HGF/c-Met 信號通路在很多生理過程中發揮重要作用，其異常可導致腫瘤的形成和轉移的發生[25]。
我們的前期研究[13]結果發現，c-Met 在結腸癌 SW480 細胞中呈高表達，HGF 可促進該細胞的增殖及增加其體外的侵襲能力；同時慢病毒載體的感染效率強，能夠提供高效的基因轉染及長期穩定的蛋白表達。
本研究中用 RNA 干擾 SW480 細胞中 c-Met 基因的表達，結果提示，RNA 干擾成功下調了 SW480 細胞中 c-Met 基因的表達，且其蛋白表達水平顯著降低，表明 RNA 干擾效率較高；進一步通過慢病毒載體的構建及轉染，發現低表達 c-Met 蛋白的 KD 組的細胞凋亡率明顯高于 c-Met 蛋白相對高表達的 NC 組和 CON 組，結果提示，c-Met 基因表達下調可能與細胞凋亡機制有一定的關系。
HGF 和 c-Met 在多種腫瘤中過度表達提供了其與腫瘤形成和轉移密切相關的證據。Stabile 等[26]的研究發現，盡管在高濃度 HGF 存在情況下，當抑制 c-Met 表達時，仍可使腫瘤細胞的抗腫瘤能力增強。Bradley 等[27]運用 RNA 干擾下調 c-Met 基因的表達，可顯著降低腫瘤細胞的遷移及侵襲能力；然而盡管在 HGF 誘導下，轉染后的腫瘤細胞的遷移及侵襲能力仍顯著下降。本研究采用 Transwell 侵襲實驗檢測 HGF 對干擾 c-Met 基因表達后 SW480 細胞侵襲能力的影響，結果發現，穩定轉染細胞 SW480 后，c-Met 基因表達下調，相對于 NC 組，KD 組的細胞轉移率明顯降低，說明 c-Met 的抑制可能逆轉了腫瘤細胞的惡性表型，使之侵襲能力下降；進一步施加外源性 HGF 對 SW480 細胞進行干預，NC 組和 KD 組分別加入不同濃度的 HGF 后，2 組的細胞轉移率均明顯升高即侵襲能力明顯提高，且有隨濃度上升其侵襲能力逐漸增加趨勢，結果提示，除了 c-Met 能促進侵襲能力外，HGF 還可直接促進 SW480 細胞的侵襲能力。
盡管 HGF 和 c-Met 均能夠促進結腸癌細胞 SW480 的增殖及侵襲能力，然而 HGF 究竟是借助c-Met 完成這一過程，還是各自獨立發揮作用，仍不十分清楚。從慢病毒干擾后的 Transwell 侵襲實驗可以看出，NC-20 與 KD-20 組的細胞轉移率的變化和 NC-40 與 KD-40 組的細胞轉移率的變化應該都是由 c-Met 敲減后所造成的，本應是相同的，然而本研究中這 2 組數據并不一致，結果提示，除了 c-Met 本身變化會對 SW480 細胞造成影響外，HGF 還可能通過其他途徑影響了腫瘤細胞的侵襲能力，如 Hass 等[28]在泌尿系腫瘤研究中就發現了 c-Met 調控存在 HGF 依賴和非依賴現象；Mungunsukh 等[29]發現，HGF 亞型 NK2 在胚胎形成及細胞增殖過程中活化 c-Met 的途徑并不相同；Zhang 等[30]亦認為 Met 基因除受 HGF 調控外，還受到其他如表皮生長因子受體和 G 蛋白偶聯受體的自動調節和活化。從上述研究可以看出，c-Met 在與其配體 HGF 結合后所發揮的功能并不是 HGF 完全作用導致的，而是 HGF 部分調節所引起的。盡管采用阻斷 HGF/c-Met 通路來抑制結直腸癌侵襲、轉移的報道并不少，但該方法并不能完全阻斷可能存在的 c-Met 的其他調節途徑，因而進一步聯合阻斷 HGF/c-Met 通路以及 c-Met 可能存在的其他調節途徑，尋找可能存在的 c-Met 其他調節途徑將是我們下一步的工作重點。
c-Met 蛋白是肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）的上皮特異性受體，屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族成員，可調控一種“侵襲性生長”的遺傳程序[1]，參與許多生理發育過程[2-3]以及腫瘤的侵襲和轉移[4-8]。HGF 是 c-Met 的配體，具有強烈促分裂和組織形成[9]、誘導上皮細胞遷移[10]、誘導血管生長[11]、參與腫瘤細胞增殖和侵襲的信號轉導過程[12]。然而在結直腸癌患者中，HGF 究竟是直接通過結合 c-Met 受體還是通過其他途徑來提高轉移能力，c-Met 在與其配體 HGF 結合后所發揮的功能是 HGF 完全作用導致的還是 HGF 部分調節所引起的，目前尚不十分清楚，因而仍需進一步研究。我們的前期研究[13]結果發現，c-Met 在結腸癌 SW480 細胞中表達較高，且 HGF 可促進該細胞的增殖和增加其體外侵襲能力。本研究通過構建 shRNA 慢病毒載體并包裝成慢病毒顆粒 shRNA-c-Met，然后用其感染 SW480 細胞進而下調 SW480 細胞內 c-Met 的表達，觀察 c-Met 下調后 HGF 對 SW480 細胞侵襲能力的影響。
1 材料與方法
1.1 主要儀器與試劑
SW480 細胞株、大腸桿菌菌株 DH5α、GV115 通用引物、Agel、Eco RⅠ酶切和慢病毒質粒 PGC-LV及相關包裝質粒均購自上海吉凱基因公司。HGF 和兔抗人 c-Met 單克隆抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司，羊抗兔多克隆二抗購自 Santa Cruz 公司，Matrigel 膠購自美國 Becton Dickinson 公司，DMEM 培養基購自 Gibco 公司，SYBR 實時定量 PCR（RT-PCR）試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。慢病毒包裝細胞 293T 細胞株購自美國典型菌種保藏中心，Trizol 和 LipofectamineTM2000 購自美國 Invitrogen 公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自 Biosea 公司，Transwell 試劑盒購自 Corning 公司。
1.2 方法
1.2.1 c-Met 基因的 RNA 干擾模板序列的設計
針對目的基因序列，依據公用網站中的 RNA 干擾序列設計原則，設計 4 條 RNA 干擾靶點序列，選擇最佳的動力學參數靶點用于后續實驗流程。應用在線 shRNA 設計軟件確定靶序列 5′-TCAACTTCTTTGTAGGCAATA-3′ 作為候選序列，檢索證實其與人類其他已知基因序列無同源性，該寡核苷酸序列以正反向組合，中間添加 Loop 序列，使寡核苷酸形成發卡結構，兩端分別帶有酶切位點，由此合成 shRNA-c-Met，其正義鏈為 5′-CCGGTCAACTTCTTTGTAGGCAATACTCGAGTATTGCCTACAAAGAAGTTGATTTTTG-3′，反義鏈為 5′-AATTCAAAAATCAACTTCTTTGTAGGCAATACTCGAGTATTGCCTACAAAGAAGTTGA-3′。同時合成序列 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′ 作為對照，其正義鏈為 5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGACAATTTTTG-3′，反義鏈為 5′-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGACAA-3′。以上序列由上海吉凱基因公司合成。靶序列的擴增片段長度為 341 bp。
1.2.2 shRNA-c-Met 慢病毒表達載體的構建
將合成后成對的引物干粉在退火緩沖液中溶解，90 ℃ 水浴 15 min，然后自然冷卻至室溫，理論配對。用 T4 DNA 連接酶將雙酶切線性化的載體和 DNA 片段（退火產物）于適當的緩沖液中行連接反應，轉化連接產物到 DH5α 感受態細胞，將 150 μL 已轉化的 DH5α 感受態細胞轉移至含有 20 mmol/L MgSO4 和氨芐霉素抗性（100 μg/mL）的溶菌肉湯（LB）瓊脂培養基上，置平板于室溫直至液體被吸收，再將平皿倒置，37 ℃ 培養，16 h 后采用 RT-PCR 鑒定陽性克隆。
1.2.3 陽性克隆的鑒定及測序
在 10 μL LB 溶液中重新懸混已挑取的轉化子，取 1 μL 作為模板，GV115 通用引物行 RT-PCR 擴增，采用 2% 瓊脂糖對產物進行凝膠電泳，挑選陽性克隆，搖菌。用質粒抽提試劑盒小量提取質粒，將抽提好的陽性克隆質粒送檢測序。
1.2.4 shRNA-c-Met 慢病毒質粒的包裝、感染及實驗分組
制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒，轉染前 24 h，對對數生長期的 293T 細胞進行胰蛋白酶消化，在含 10% 血清的培養基中調整細胞密度至 1.2×107個/20 mL，于 15 cm 細胞培養皿中進行再接種，于37 ℃、5% CO2 培養箱內培養，在24 h 后待細胞密度達到 70%～80% 時用于轉染。按照 LipofectamineTM2000使用說明將制備好的慢病毒顆粒共轉染 293T 細胞，8 h 后更換培養基為完全培養基，培養 48 h 后收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液上樣離心 10 min，除去細胞碎片后，移出病毒濃縮液，分裝后于–80 ℃ 保存。實驗分為正常對照組（NC 組）：正常目的細胞加 shRNA 陰性對照病毒感染細胞（NC 組又分為 NC-20 和 NC-40 2 個亞組，分別代表正常目的細胞感染 shRNA 陰性對照病毒后在 Transwell 外室中分別加入濃度為 20 和 40 ng/mL 的 HGF）。c-Met 基因敲除組（KD 組）：正常目的細胞加 RNA 干擾靶點病毒感染細胞（KD 組又分為 KD-20 和 KD-40 2 個亞組，分別代表正常目的細胞感染目的基因 shRNA-c-Met 病毒后在 Transwell 外室中分別加入濃度為 20 和 40 ng/mL 的 HGF；KD1、KD2、KD3 和 KD4 組分別表示針對目的基因不同的 RNA 干擾靶點，以挑選其中最有效的干擾靶點）。空白對照組（CON 組）：正常目的細胞加未感染任何病毒的細胞。按實驗設計的組別分別加入慢病毒顆粒，進行 SW480 細胞轉染。
1.2.5 RT-PCR 法檢測各組 c-Met mRNA 的表達并計算基因敲減效率
收集生長良好的 SW480 細胞，按照 Trizol 操作步驟進行 RNA 提取，參照M-MLV 操作說明反轉錄生成 cDNA，用 RT-PCR 試劑盒檢測 c-Met mRNA 表達情況。c-Met 基因上游引物為 5′-AGTCATAGGAAGAGGGCATT-3′，下游引物為 5′-CTTCACTTCGCAGGCAGA-3′，擴增片段長度為 206 bp；GAPDH 基因上游引物為 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物為 5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴增片段長度為 121 bp。采用兩步法進行 RT-PCR 檢測，用 Δct 表示 c-Met mRNA 的相對表達量，其計算公式按操作手冊所提供：Δct=目的基因ct值–GAPDH基因ct值 ，重復步驟 3 次，取均值；進而計算基因敲減效率，其計算公式按操作手冊所提供：基因敲減效率=（NC 組c-Met mRNA 表達量–KD 組 c-Met mRNA 表達量）×100%。
1.2.6 Western blot 法檢測各組 c-Met 蛋白表達
用 0.25% 胰酶消化轉染后的細胞，加超純水，調整細胞密度為 1×107個/100 μL，同時加入相等體積上樣緩沖液，煮沸 20 min 后上樣離心 5 min，取上清液上樣，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結束后，轉移蛋白到聚偏氟乙烯膜上，轉膜后，用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 緩沖液 4 ℃ 封閉、過夜。次日，用 TBST 緩沖液反復洗膜 3 次，加入多克隆兔抗 c-Met 抗體和多克隆兔抗 GAPDH 抗體（1∶2 000），室溫孵育 1 h，再次 TBST 洗膜 3 次，采用化學發光法曝光、顯影，計算機圖像分析系統檢測影片的灰度值，結果用 c-Met/GAPDH 相對值表示。
1.2.7 采用流式細胞儀檢測細胞凋亡
轉染細胞培養 72 h 后收集細胞。配置標記液，每 100 μL 標記液可標記 1×105～1×106個細胞，含 Annexin V-FITC 1 μL 和碘化丙啶（PI）10 μL，重新懸混細胞后，再避光、室溫孵育 5 min，加入結合緩沖液 400 μL，在 488 nm 激發波長下行流式細胞儀檢測，每次計數 10 000 個細胞，結果用凋亡率表示，凋亡率=凋亡細胞數/（凋亡細胞數＋正常細胞數）×100%。
1.2.8 沉默 c-Met 后 Transwell 侵襲實驗
將各組穩定轉染細胞用低血清培養液配制成單細胞懸液，濃度為 2×105個細胞/mL，于 Transwell 小室上室接種 100 μL，下室加入 600 μL 含 30% FBS 培養基，37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，30 min 后將不同濃度 HGF 加入到各組，6 h 后移去非轉移細胞，用 Giemsa 染色液于膜下表面染色轉移細胞，3～5 min 后沖洗、晾干，顯微鏡下照相，揭下底膜，置 10% 醋酸 200 μL于 96 孔板中，待完全溶解后取 100 μL加入到另一孔中，進行 570 nm 時的光密度（OD）值檢測，計算細胞轉移率，其計算公式為：細胞轉移率=接種時 OD 值/染色后 OD 值×100%，其間接反映了穿至下室膜的細胞數，代表了細胞的侵襲能力，觀察 5 個不同視野，計數5 000 個細胞/孔，重復 3 次，計算平均值表示細胞的侵襲能力。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 16.0 統計分析軟件對數據進行分析。計量資料用均數±標準差（
±s）表示，多組間指標比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 攜帶目的基因 c-Met 的慢病毒質粒的鑒定 結果
攜帶目的基因 c-Met 的重組慢病毒質粒的 PCR 產物長度為 341 bp（插入片段長度為 34 bp），經雙酶切后沒有插入片段的空載體 PCR 產物 307 bp，鑒定結果與預期相符，見圖 1。
圖1
慢病毒質粒 RT-PCR 產物電泳圖 1：CON 組；2：NC 組；3：Marker；4–8：攜帶目的基因 c-Met 的陽性克隆組
2.2 c-Met mRNA 在各轉染組細胞中的表達及基因敲減效率情況
各組細胞中 c-Met mRNA 表達和基因敲減效率見表 1。c-Met mRNA 表達在 KD1、KD2 及 KD3 組與 NC 組比較差異均無統計學意義（P>0.05），KD4 組的 c-Met mRNA 表達明顯低于 NC 組（P<0.05）。結果提示，相對于 NC 組，KD4 組 SW480 細胞中c-Met mRNA 表達水平降低明顯，其基因敲減效率最高，達 81.4%，為最有效靶點。
表1
各轉染組細胞中 c-Met mRNA 表達和基因敲減效率
2.3 RNA 干擾下調 SW480 細胞中 c-Met 蛋白表達水平
Western blot 檢測的定性結果見圖 2。半定量結果見表 2。從表 2 可見，KD 組 SW480 細胞中c-Met 蛋白表達明顯低于 NC 組（P=0.015）和 CON 組（P=0.010），結果提示，RNA 干擾效率高。
圖2
Western blot 檢測各組細胞中 c-Met 蛋白的表達 1：KD 組；2：NC 組；3：CON 組
表2
各轉染組細胞中 c-Met 蛋白表達情況（
±s）
2.4 慢病毒轉染對轉染細胞凋亡率的影響
細胞凋亡檢測結果見圖 3 和表 3。從表 3 可見，KD 組 SW480 細胞凋亡率明顯高于 NC 組（P<0.001）和 CON 組（P<0.001）。
表3
各組細胞凋亡率情況（%，
±s）
圖3
流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況 a：CON 組；b：NC 組；c：KD 組
2.5 HGF 對慢病毒感染后 SW480 細胞侵襲能力的影響
Transwell 侵襲實驗結果見表 4。從表 4 可見，細胞轉移率在 KD 組、KD-20 組和 KD-40 組均分別明顯低于 NC 組（P<0.001）、NC-20 組（P=0.015）及 NC-40 組（P=0.017）；與 NC 組比較，NC-20 組和 NC-40 組的細胞轉移率明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.001、P<0.001），且 NC-40 組的細胞轉移率明顯高于 NC-20 組（P=0.005）；同樣，與 KD 組比較，KD-20 組和 KD-40 組的細胞轉移率明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.001、P<0.001），KD-40 組的細胞轉移率明顯高于 KD-20 組（P=0.014）。
3 討論
表4
各組細胞轉移率情況（%，
±s）
c-Met 在相當一部分人類腫瘤中呈高表達[14-18]，與腫瘤的發生、發展、轉移及患者的預后有密切關系[19-23]。有研究[24]表明，c-Met 及其配體 HGF 是調節腫瘤細胞浸潤和轉移的關鍵細胞因子，可誘導表達 c-Met 的靶細胞發揮多種作用，包括細胞增殖、分化、侵襲和遷移。HGF/c-Met 信號通路在很多生理過程中發揮重要作用，其異常可導致腫瘤的形成和轉移的發生[25]。
我們的前期研究[13]結果發現，c-Met 在結腸癌 SW480 細胞中呈高表達，HGF 可促進該細胞的增殖及增加其體外的侵襲能力；同時慢病毒載體的感染效率強，能夠提供高效的基因轉染及長期穩定的蛋白表達。
本研究中用 RNA 干擾 SW480 細胞中 c-Met 基因的表達，結果提示，RNA 干擾成功下調了 SW480 細胞中 c-Met 基因的表達，且其蛋白表達水平顯著降低，表明 RNA 干擾效率較高；進一步通過慢病毒載體的構建及轉染，發現低表達 c-Met 蛋白的 KD 組的細胞凋亡率明顯高于 c-Met 蛋白相對高表達的 NC 組和 CON 組，結果提示，c-Met 基因表達下調可能與細胞凋亡機制有一定的關系。
HGF 和 c-Met 在多種腫瘤中過度表達提供了其與腫瘤形成和轉移密切相關的證據。Stabile 等[26]的研究發現，盡管在高濃度 HGF 存在情況下，當抑制 c-Met 表達時，仍可使腫瘤細胞的抗腫瘤能力增強。Bradley 等[27]運用 RNA 干擾下調 c-Met 基因的表達，可顯著降低腫瘤細胞的遷移及侵襲能力；然而盡管在 HGF 誘導下，轉染后的腫瘤細胞的遷移及侵襲能力仍顯著下降。本研究采用 Transwell 侵襲實驗檢測 HGF 對干擾 c-Met 基因表達后 SW480 細胞侵襲能力的影響，結果發現，穩定轉染細胞 SW480 后，c-Met 基因表達下調，相對于 NC 組，KD 組的細胞轉移率明顯降低，說明 c-Met 的抑制可能逆轉了腫瘤細胞的惡性表型，使之侵襲能力下降；進一步施加外源性 HGF 對 SW480 細胞進行干預，NC 組和 KD 組分別加入不同濃度的 HGF 后，2 組的細胞轉移率均明顯升高即侵襲能力明顯提高，且有隨濃度上升其侵襲能力逐漸增加趨勢，結果提示，除了 c-Met 能促進侵襲能力外，HGF 還可直接促進 SW480 細胞的侵襲能力。
盡管 HGF 和 c-Met 均能夠促進結腸癌細胞 SW480 的增殖及侵襲能力，然而 HGF 究竟是借助c-Met 完成這一過程，還是各自獨立發揮作用，仍不十分清楚。從慢病毒干擾后的 Transwell 侵襲實驗可以看出，NC-20 與 KD-20 組的細胞轉移率的變化和 NC-40 與 KD-40 組的細胞轉移率的變化應該都是由 c-Met 敲減后所造成的，本應是相同的，然而本研究中這 2 組數據并不一致，結果提示，除了 c-Met 本身變化會對 SW480 細胞造成影響外，HGF 還可能通過其他途徑影響了腫瘤細胞的侵襲能力，如 Hass 等[28]在泌尿系腫瘤研究中就發現了 c-Met 調控存在 HGF 依賴和非依賴現象；Mungunsukh 等[29]發現，HGF 亞型 NK2 在胚胎形成及細胞增殖過程中活化 c-Met 的途徑并不相同；Zhang 等[30]亦認為 Met 基因除受 HGF 調控外，還受到其他如表皮生長因子受體和 G 蛋白偶聯受體的自動調節和活化。從上述研究可以看出，c-Met 在與其配體 HGF 結合后所發揮的功能并不是 HGF 完全作用導致的，而是 HGF 部分調節所引起的。盡管采用阻斷 HGF/c-Met 通路來抑制結直腸癌侵襲、轉移的報道并不少，但該方法并不能完全阻斷可能存在的 c-Met 的其他調節途徑，因而進一步聯合阻斷 HGF/c-Met 通路以及 c-Met 可能存在的其他調節途徑，尋找可能存在的 c-Met 其他調節途徑將是我們下一步的工作重點。
