引用本文： 樊強, 張龍龍, 顧越雷, 錢彬彬, 楊孫虎. 載藥納米膜預防膽囊切除術后腹腔粘連的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(12): 1468-1472. doi: 10.7507/1007-9424.201707004 復制
術后腹腔粘連指腹腔手術后大網膜、腹腔臟器和腹壁的病理性連接，為外科手術后常見并發癥，主要臨床表現為術后腸梗阻、慢性腹痛、女性不孕不育等，更為嚴重的是為二次手術帶來難度和風險，不利于患者的康復[1-3]。有研究[4-6]顯示，腹部手術后腹腔粘連的發生率高達 90%，目前應用的各種預防術后腹腔粘連的方法并不能取得十分滿意的成效[7-8]。納米纖維膜是目前的研究熱門，具有安全、無毒、組織相容性好、有一定的機械強度等優越性能，已經在骨科、整形科等用來修復組織及預防粘連[9-11]，但其在腹腔粘連防治中的研究報道較少。因此，本研究小組采用自行設計的載藥納米膜，觀察其在預防新西蘭大白兔膽囊切除術后腹腔粘連形成中的作用，為進一步的腹腔粘連的基礎研究及其在臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
清潔級健康雄性新西蘭大白兔 40 只，松江松聯動物飼養場提供，體質量 2 500～3 000 g，飼養 2 周適應環境。應用隨機數字表法將實驗動物隨機分為空白對照組、幾丁糖組、納米膜組及載藥納米膜組 4 組，每組 10 只大白兔，術前 12 h 禁食、禁水。
1.2 實驗試劑及相關材料
醫用幾丁糖（商品名：奇特杰），5 mL/支，上海其勝生物制劑有限公司；塞來昔布，由美國輝瑞制藥有限公司提供；頭孢拉定，0.5 g/支，山東魯抗醫藥股份有限公司；納米膜（由蘇州大學醫學部骨科研究所納米生物醫學崔文國教授提供）：配制聚己內酯的靜電紡絲液，構建厚度 0.1 mm 的納米膜。載藥納米膜：配制含藥量為 10% 塞來昔布的聚己內酯溶液，連續紡絲，厚度達到 0.1 mm。
1.3 實驗方法
空白對照組：3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）耳緣靜脈常規麻醉，仰臥位平放在已用 75% 乙醇消毒的金屬臺面上，四肢固定，剔除腹部的被毛，術區常規消毒。于上腹部正中逐層入腹，切口長約 3 cm，游離膽囊，1 號絲線結扎膽囊管，切除膽囊，術區止血，關腹。術前使用頭孢拉定 0.1 g/只預防感染，控制手術時間 30 min，待動物蘇醒后放回飼養籠。術后禁食 12 h，繼續標準喂養。
幾丁糖組處理同空白對照組，于關腹前將幾丁糖（1 mL/只）灑于膽囊窩創面。
納米膜組于關腹前根據膽囊窩創面大小將一1 cm×1 cm 大小的膜片貼于膽囊窩創面。
載藥納米膜組于關腹前將一 1 cm×1 cm 大小的載藥膜片貼于膽囊窩創面，見圖 1。
圖1
示放置載藥膜片示意圖
1.4 檢測指標及方法
分別于術后第 7、14、21 及 28 天在原切口進腹觀察各組的腹腔粘連及納米膜降解情況（納米膜降解情況針對納米膜組和載藥納米膜組）。
1.4.1 粘連程度分級評分 因為所有的實驗動物都要觀察到術后第 28 天，所以我們在實驗過程中不能破壞已形成粘連的組織，粘連評分主要以觀察實驗動物術區粘連的具體情況結合平時的臨床經驗為依據，因此我們選擇兩位經驗豐富的臨床醫師進行評分，若評分存在差異，則請教本研究中的通訊作者做最終的評分判斷。為了更加客觀準確地對各個時間點的實驗動物進行腹腔粘連情況的評分，我們參照相關文獻[12-13]中的粘連分類法并結合本實驗的特點進行分級評分（雙盲法）。粘連的嚴重程度評分：0 分，沒有粘連；1 分，輕度粘連，沒有張力和損傷就能把粘連組織分開；2 分，輕度粘連，需要一定的張力把粘連組織分開；3 分，中度粘連，需要剪刀分離，分離面可能存在漿膜受損；4 分，嚴重粘連，致密粘連，分離面漿膜嚴重受損。粘連的范圍大小評分：0 分，沒有粘連；1 分，1%～25% 膽囊窩創面粘連；2 分，26%～50% 膽囊窩創面粘連；3 分，51%～75% 膽囊窩創面粘連；4 分，76%～100% 膽囊窩創面粘連。將粘連的嚴重程度和范圍大小評分相加的總分作為本實驗粘連程度的最終評分[14]。
1.4.2 納米膜降解情況 分別于術后第 7、14、21 及 28 天觀察納米膜組和載藥納米膜組的納米膜降解情況。0 分：沒有降解；1 分：降解面積<25%；2 分：25%≤降解面積<50%；3 分：50%≤降解面積<75%；4 分：降解面積≥75%。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件對數據進行分析，結果以均數±標準差（
±s）表示，總體比較采用 F 檢驗，兩兩比較采用 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 術后一般情況
術后 3 d 內各組大白兔一般情況差，進食少，活動量小，3 d 后慢慢恢復正常。對照組有 1 只大白兔死于術后第 1 天，剖腹探查為腹腔內大量積血，術區創面血凝塊覆蓋。納米膜組有 1 只大白兔死于術后第 9 天，剖腹探查未見明顯異常，死因不明。其他大白兔均存活至實驗結束，無異常情況出現。
2.2 4 組大白兔的腹腔粘連情況
空白對照組大白兔術后膽囊窩的粘連嚴重，幾丁糖組、納米膜組和載藥納米膜組的粘連情況較輕，其中載藥納米膜組粘連情況最輕。術后各時間點，幾丁糖組、納米膜組及載藥納米膜組的腹腔粘連評分明顯低于空白對照組（P<0.05），載藥納米膜組的腹腔粘連評分均明顯低于幾丁糖組和納米膜組（P<0.05），而納米膜組與幾丁糖組的腹腔粘連評分比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
4 組大白兔的腹腔粘連評分比較（
）
2.3 納米膜組和載藥納米膜組的納米膜降解情況
手術后第 14 天時，納米膜組及載藥納米膜組的納米膜有降解，降解面積均較小；手術后第 21 天時，2 組的降解面積均增大；手術后第 28 天時，2 組的降解面積繼續增大并且基本降解完畢。各個時間點納米膜組及載藥納米膜組間的納米膜降解評分比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2。本研究采用降解率（降解率=降解評分/4×100%）來進一步直觀地評價納米膜的降解情況，結果見圖 2，從圖 2 可以看出，2 組納米膜隨著時間的延長均勻降解，降解速率無明顯差異。
表2
納米膜組和載藥納米膜組的納米膜降解評分結果比較（
）
圖2
示膜片隨時間降解示意圖
3 討論
腹腔粘連的過程十分復雜，涉及創傷、炎癥反應、缺氧等多個交叉作用環節及多種細胞因子和生長因子的參與[6, 15-17]。目前主要觀點認為，腹腔粘連是伴隨腹膜損傷修復的病理性過程，損傷、炎癥及缺氧引起炎癥細胞、炎癥介質、細胞因子和生長因子的異常釋放，改變腹腔微環境，破壞其原有平衡，從而促進纖維蛋白的滲出和沉積，抑制其降解，使細胞外基質產生堆積，毛細血管進一步生成，從而形成腹腔永久性粘連。
目前預防腹部手術后腹腔粘連的主要方法有：提高手術技巧，減少組織損傷；減少纖維沉積，減輕損傷后炎癥反應，降低血管通透性；促進纖維溶解，外源性纖維蛋白溶解激活劑可以激活纖溶酶原；各種生物屏障、藥物屏障（如透明質酸、幾丁糖等）、機械屏障（如可吸收生物膜）；以及一些隨著機制研究深入的靶點藥物治療和基因治療[6]。但是鑒于粘連發生機制的復雜多樣性，任何一種單一的治療都不能很好地預防腹腔粘連[18]。
幾丁糖是一種具有良好生物相容性、生物學活性、生物可降解性等特點的醫用高分子多糖類物質[19]。其作用機制主要有：選擇性促進上皮細胞和內皮細胞生長而抑制成纖維細胞生長；具有局部止血及抑制纖維蛋白束形成的作用以及潤滑及生物屏障作用，能有效地阻止粘連發生，是現階段廣為臨床醫生所接受的防粘連劑[20-22]。因此，本研究將幾丁糖作為陽性對照，結果提示，幾丁糖的確能起到良好的防粘連作用，與空白對照組相比，粘連明顯減輕。但是幾丁糖凝膠產品在腹腔內吸收及降解較快，局部應用后產品擴散范圍較大，局部應用防止腹腔內粘連的效果有限，若想達到較好的預防腹腔粘連的效果，常需局部多次用藥，但是腹腔內手術一旦關腹后術區同一部位給藥通常較為困難。
納米材料是醫工交叉研究的熱門，它作為一種預防粘連材料已經在防治肌腱粘連等領域被廣泛研究及應用[9-11]，但在防治腹腔粘連中的研究較少。因此，我們擬通過實驗研究，觀察將納米膜運用到預防腹腔粘連中，觀察其是否也有同樣的效果。從本實驗的初步研究結果看，納米膜也能起到預期的防粘連效果，與幾丁糖組相比，二者的粘連評分比較差異無統計學意義，即納米膜在預防腹腔粘連中能達到與幾丁糖同樣的效果。
由于術后腹腔粘連的形成是多種因素參與的復雜的機體修復過程，涉及眾多細胞因子和復雜分子網絡，所以單一的干預措施難以起到預期的防粘連效果。非甾體抗炎藥塞來昔布是選擇性環氧合酶-2 抑制劑，可通過抑制環氧合酶-2 阻止炎性前列腺素類物質的產生，減輕損傷后的早期炎癥反應，降低血管通透性，穩定溶酶體膜，減少相關炎癥介質釋放和纖維蛋白滲出，從而減少術后腹腔粘連的形成[11, 23]。因此，本研究自行設計了一種載藥納米膜，即在納米膜的基礎上加入非甾體抗炎藥塞來昔布，一方面可以作為一種機械屏障，將漿膜受損的創面隔離，另一方面其加載的藥物可以緩慢持續釋放 10 d，克服了術后藥物半衰期短而多次給藥的不足，以減輕局部的炎癥反應（粘連主要在術后 1 周內形成），且納米膜的降解主要在術后 2 周后開始，避開了粘連形成的時間。本研究結果提示，載藥納米膜可以進一步減輕術后膽囊窩的粘連，粘連評分比納米膜組還更低，并且其降解速率也沒有受到相關影響。載藥納米膜組通過緩慢釋放藥物，減輕了局部的炎癥反應，通過物理屏障及藥物治療兩方面在防止腹腔術后粘連方面起到了較滿意的防治效果。
本研究的初步研究結果提示，載藥納米膜對減少腹部手術后腹腔粘連的發生具有顯著的效果。載藥納米膜是從物理屏障和藥物治療兩方面聯合防治腹腔粘連。相信隨著將來對粘連作用機制的更深入的認識，有望通過載有特殊作用藥物的納米膜更加精準地防治術后腹腔粘連，為以后腹腔粘連的防治提供了新的思路和方向。
術后腹腔粘連指腹腔手術后大網膜、腹腔臟器和腹壁的病理性連接，為外科手術后常見并發癥，主要臨床表現為術后腸梗阻、慢性腹痛、女性不孕不育等，更為嚴重的是為二次手術帶來難度和風險，不利于患者的康復[1-3]。有研究[4-6]顯示，腹部手術后腹腔粘連的發生率高達 90%，目前應用的各種預防術后腹腔粘連的方法并不能取得十分滿意的成效[7-8]。納米纖維膜是目前的研究熱門，具有安全、無毒、組織相容性好、有一定的機械強度等優越性能，已經在骨科、整形科等用來修復組織及預防粘連[9-11]，但其在腹腔粘連防治中的研究報道較少。因此，本研究小組采用自行設計的載藥納米膜，觀察其在預防新西蘭大白兔膽囊切除術后腹腔粘連形成中的作用，為進一步的腹腔粘連的基礎研究及其在臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
清潔級健康雄性新西蘭大白兔 40 只，松江松聯動物飼養場提供，體質量 2 500～3 000 g，飼養 2 周適應環境。應用隨機數字表法將實驗動物隨機分為空白對照組、幾丁糖組、納米膜組及載藥納米膜組 4 組，每組 10 只大白兔，術前 12 h 禁食、禁水。
1.2 實驗試劑及相關材料
醫用幾丁糖（商品名：奇特杰），5 mL/支，上海其勝生物制劑有限公司；塞來昔布，由美國輝瑞制藥有限公司提供；頭孢拉定，0.5 g/支，山東魯抗醫藥股份有限公司；納米膜（由蘇州大學醫學部骨科研究所納米生物醫學崔文國教授提供）：配制聚己內酯的靜電紡絲液，構建厚度 0.1 mm 的納米膜。載藥納米膜：配制含藥量為 10% 塞來昔布的聚己內酯溶液，連續紡絲，厚度達到 0.1 mm。
1.3 實驗方法
空白對照組：3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）耳緣靜脈常規麻醉，仰臥位平放在已用 75% 乙醇消毒的金屬臺面上，四肢固定，剔除腹部的被毛，術區常規消毒。于上腹部正中逐層入腹，切口長約 3 cm，游離膽囊，1 號絲線結扎膽囊管，切除膽囊，術區止血，關腹。術前使用頭孢拉定 0.1 g/只預防感染，控制手術時間 30 min，待動物蘇醒后放回飼養籠。術后禁食 12 h，繼續標準喂養。
幾丁糖組處理同空白對照組，于關腹前將幾丁糖（1 mL/只）灑于膽囊窩創面。
納米膜組于關腹前根據膽囊窩創面大小將一1 cm×1 cm 大小的膜片貼于膽囊窩創面。
載藥納米膜組于關腹前將一 1 cm×1 cm 大小的載藥膜片貼于膽囊窩創面，見圖 1。
圖1
示放置載藥膜片示意圖
1.4 檢測指標及方法
分別于術后第 7、14、21 及 28 天在原切口進腹觀察各組的腹腔粘連及納米膜降解情況（納米膜降解情況針對納米膜組和載藥納米膜組）。
1.4.1 粘連程度分級評分 因為所有的實驗動物都要觀察到術后第 28 天，所以我們在實驗過程中不能破壞已形成粘連的組織，粘連評分主要以觀察實驗動物術區粘連的具體情況結合平時的臨床經驗為依據，因此我們選擇兩位經驗豐富的臨床醫師進行評分，若評分存在差異，則請教本研究中的通訊作者做最終的評分判斷。為了更加客觀準確地對各個時間點的實驗動物進行腹腔粘連情況的評分，我們參照相關文獻[12-13]中的粘連分類法并結合本實驗的特點進行分級評分（雙盲法）。粘連的嚴重程度評分：0 分，沒有粘連；1 分，輕度粘連，沒有張力和損傷就能把粘連組織分開；2 分，輕度粘連，需要一定的張力把粘連組織分開；3 分，中度粘連，需要剪刀分離，分離面可能存在漿膜受損；4 分，嚴重粘連，致密粘連，分離面漿膜嚴重受損。粘連的范圍大小評分：0 分，沒有粘連；1 分，1%～25% 膽囊窩創面粘連；2 分，26%～50% 膽囊窩創面粘連；3 分，51%～75% 膽囊窩創面粘連；4 分，76%～100% 膽囊窩創面粘連。將粘連的嚴重程度和范圍大小評分相加的總分作為本實驗粘連程度的最終評分[14]。
1.4.2 納米膜降解情況 分別于術后第 7、14、21 及 28 天觀察納米膜組和載藥納米膜組的納米膜降解情況。0 分：沒有降解；1 分：降解面積<25%；2 分：25%≤降解面積<50%；3 分：50%≤降解面積<75%；4 分：降解面積≥75%。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件對數據進行分析，結果以均數±標準差（
±s）表示，總體比較采用 F 檢驗，兩兩比較采用 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 術后一般情況
術后 3 d 內各組大白兔一般情況差，進食少，活動量小，3 d 后慢慢恢復正常。對照組有 1 只大白兔死于術后第 1 天，剖腹探查為腹腔內大量積血，術區創面血凝塊覆蓋。納米膜組有 1 只大白兔死于術后第 9 天，剖腹探查未見明顯異常，死因不明。其他大白兔均存活至實驗結束，無異常情況出現。
2.2 4 組大白兔的腹腔粘連情況
空白對照組大白兔術后膽囊窩的粘連嚴重，幾丁糖組、納米膜組和載藥納米膜組的粘連情況較輕，其中載藥納米膜組粘連情況最輕。術后各時間點，幾丁糖組、納米膜組及載藥納米膜組的腹腔粘連評分明顯低于空白對照組（P<0.05），載藥納米膜組的腹腔粘連評分均明顯低于幾丁糖組和納米膜組（P<0.05），而納米膜組與幾丁糖組的腹腔粘連評分比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
4 組大白兔的腹腔粘連評分比較（
）
2.3 納米膜組和載藥納米膜組的納米膜降解情況
手術后第 14 天時，納米膜組及載藥納米膜組的納米膜有降解，降解面積均較小；手術后第 21 天時，2 組的降解面積均增大；手術后第 28 天時，2 組的降解面積繼續增大并且基本降解完畢。各個時間點納米膜組及載藥納米膜組間的納米膜降解評分比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2。本研究采用降解率（降解率=降解評分/4×100%）來進一步直觀地評價納米膜的降解情況，結果見圖 2，從圖 2 可以看出，2 組納米膜隨著時間的延長均勻降解，降解速率無明顯差異。
表2
納米膜組和載藥納米膜組的納米膜降解評分結果比較（
）
圖2
示膜片隨時間降解示意圖
3 討論
腹腔粘連的過程十分復雜，涉及創傷、炎癥反應、缺氧等多個交叉作用環節及多種細胞因子和生長因子的參與[6, 15-17]。目前主要觀點認為，腹腔粘連是伴隨腹膜損傷修復的病理性過程，損傷、炎癥及缺氧引起炎癥細胞、炎癥介質、細胞因子和生長因子的異常釋放，改變腹腔微環境，破壞其原有平衡，從而促進纖維蛋白的滲出和沉積，抑制其降解，使細胞外基質產生堆積，毛細血管進一步生成，從而形成腹腔永久性粘連。
目前預防腹部手術后腹腔粘連的主要方法有：提高手術技巧，減少組織損傷；減少纖維沉積，減輕損傷后炎癥反應，降低血管通透性；促進纖維溶解，外源性纖維蛋白溶解激活劑可以激活纖溶酶原；各種生物屏障、藥物屏障（如透明質酸、幾丁糖等）、機械屏障（如可吸收生物膜）；以及一些隨著機制研究深入的靶點藥物治療和基因治療[6]。但是鑒于粘連發生機制的復雜多樣性，任何一種單一的治療都不能很好地預防腹腔粘連[18]。
幾丁糖是一種具有良好生物相容性、生物學活性、生物可降解性等特點的醫用高分子多糖類物質[19]。其作用機制主要有：選擇性促進上皮細胞和內皮細胞生長而抑制成纖維細胞生長；具有局部止血及抑制纖維蛋白束形成的作用以及潤滑及生物屏障作用，能有效地阻止粘連發生，是現階段廣為臨床醫生所接受的防粘連劑[20-22]。因此，本研究將幾丁糖作為陽性對照，結果提示，幾丁糖的確能起到良好的防粘連作用，與空白對照組相比，粘連明顯減輕。但是幾丁糖凝膠產品在腹腔內吸收及降解較快，局部應用后產品擴散范圍較大，局部應用防止腹腔內粘連的效果有限，若想達到較好的預防腹腔粘連的效果，常需局部多次用藥，但是腹腔內手術一旦關腹后術區同一部位給藥通常較為困難。
納米材料是醫工交叉研究的熱門，它作為一種預防粘連材料已經在防治肌腱粘連等領域被廣泛研究及應用[9-11]，但在防治腹腔粘連中的研究較少。因此，我們擬通過實驗研究，觀察將納米膜運用到預防腹腔粘連中，觀察其是否也有同樣的效果。從本實驗的初步研究結果看，納米膜也能起到預期的防粘連效果，與幾丁糖組相比，二者的粘連評分比較差異無統計學意義，即納米膜在預防腹腔粘連中能達到與幾丁糖同樣的效果。
由于術后腹腔粘連的形成是多種因素參與的復雜的機體修復過程，涉及眾多細胞因子和復雜分子網絡，所以單一的干預措施難以起到預期的防粘連效果。非甾體抗炎藥塞來昔布是選擇性環氧合酶-2 抑制劑，可通過抑制環氧合酶-2 阻止炎性前列腺素類物質的產生，減輕損傷后的早期炎癥反應，降低血管通透性，穩定溶酶體膜，減少相關炎癥介質釋放和纖維蛋白滲出，從而減少術后腹腔粘連的形成[11, 23]。因此，本研究自行設計了一種載藥納米膜，即在納米膜的基礎上加入非甾體抗炎藥塞來昔布，一方面可以作為一種機械屏障，將漿膜受損的創面隔離，另一方面其加載的藥物可以緩慢持續釋放 10 d，克服了術后藥物半衰期短而多次給藥的不足，以減輕局部的炎癥反應（粘連主要在術后 1 周內形成），且納米膜的降解主要在術后 2 周后開始，避開了粘連形成的時間。本研究結果提示，載藥納米膜可以進一步減輕術后膽囊窩的粘連，粘連評分比納米膜組還更低，并且其降解速率也沒有受到相關影響。載藥納米膜組通過緩慢釋放藥物，減輕了局部的炎癥反應，通過物理屏障及藥物治療兩方面在防止腹腔術后粘連方面起到了較滿意的防治效果。
本研究的初步研究結果提示，載藥納米膜對減少腹部手術后腹腔粘連的發生具有顯著的效果。載藥納米膜是從物理屏障和藥物治療兩方面聯合防治腹腔粘連。相信隨著將來對粘連作用機制的更深入的認識，有望通過載有特殊作用藥物的納米膜更加精準地防治術后腹腔粘連，為以后腹腔粘連的防治提供了新的思路和方向。
