引用本文： 黨運芝, 李健, 高靜, 李艷艷, 龔繼芳, 李潔, 李燕, 王晰程, 沈琳. KRAS 與 BRAF 基因在胃腸間質瘤中的突變情況及臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(2): 154-157. doi: 10.7507/1007-9424.201701004 復制
胃腸間質瘤（gastrointestinal stromal tumors，GISTs）是最常見的消化系統軟組織肉瘤[1]，約 85% 的 GISTs 合并 c-kit 基因突變，5%～7% 的 GIST 患者檢測到 PDGFRA 基因突變，這些受體酪氨酸激酶突變可導致下游信號通路的激活并引起 GIST 細胞增殖與細胞凋亡的降低[2]。未檢測到 c-kit 或 PDGFRA 基因突變的野生型 GIST，其發病機制尚未完全清楚，同時對伊馬替尼的療效欠佳[3]。近期有研究[4]報道，野生型 GIST 根據已知的可能耐藥機制被分為不同亞組，包括琥珀酸脫氫酶缺失 GIST、纖維瘤病樣 GIST 及 BRAF 基因突變 GIST。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路 RAS/RAF/MEK/ERK 作為 c-kit 基因下游傳導通路之一，被激活后可在 c-kit 基因抑制狀態下引起信號傳導[5]。有研究[6-10]報道了 GIST 中可存在低頻率的 KRAS 與 BRAF 基因突變，但結果并不一致，同時樣本量均較小。另一方面，尚無文獻報道在接受伊馬替尼治療后是否存在 KRAS 與 BRAF 基因突變狀態改變而導致繼發耐藥。本研究的目的是在包含 c-kit 或 PDGFRA 基因突變型與野生型的大樣本 GIST 病例中評估 KRAS 與 BRAF 的突變情況，同時在伊馬替尼治療耐藥前后的配對標本中檢測 KRAS 與 BRAF 突變狀態可否發生改變。
1 資料與方法
1.1 患者資料
在來自北京大學腫瘤醫院 2002–2012 年期間就診的 519 例胃腸間質瘤患者中，獲取了 538 例石蠟包埋的 GIST 腫瘤組織標本，包含 381 例 c-kit 或 PDGFRA 基因突變型 GIST，119 例 c-kit 或 PDGFRA 基因野生型 GIST，19 例具有伊馬替尼治療耐藥前后配對標本的 GIST。該研究獲得北京大學腫瘤醫院倫理委員會的批準。全部患者的臨床病理資料見表 1。
表1
519 例 GIST 患者臨床病理特征
1.2 KRAS 與 BRAF 基因突變檢測
1.2.1 腫瘤組織 DNA 準備 按照試劑盒（E.Z.N.A. FFPE DNA Kit，Lot.D3399-01，美國 Omega 公司）說明提取甲醛固定后石蠟包埋的組織中基因組 DNA，–20 ℃ 保存備用。
1.2.2 KRAS 與 BRAF 基因突變檢測 采用下述引物聚合酶鏈反應擴增 KRAS 基因外顯子 2 和 BRAF 基因外顯子 15。KRAS 上游引物為 5′-GGTACTG-GTGGAGTATTTGATAG-3′，下游引物為 5′-TGGTCCTGCACCAGTAATATG-3′，擴增產物片段長度為 248 bp；BRAF 上游引物為 5′-CTCTT-CATAATGCTTGCTCTGATAGG-3′，下游引物為 5′-GTGGAAAAATAGCCTCAATTCTTACC-3′，擴增產物片段長度 211 bp。反應條件為：初始變性 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，45 個循環；72 ℃ 延伸 10 min；4 ℃ 結束反應。PCR 產物經 3% 瓊脂糖凝膠電泳確定后，用 ABI 公司的 3730XL 測序儀進行序列分析。應用 Chromas 軟件在信/噪比>98% 的條件下判斷基因突變情況。
2 結果
2.1 KRAS 與 BRAF 基因突變情況
在 381 例 c-kit 或 PDGFRA 突變型 GIST 標本中，僅檢測到 43 例 KRAS 基因同義突變（密碼子 22，CAG→CAA）和 1 例 BRAF 基因同義突變（密碼子 558，CTC→CTT），未檢測到 KRAS 基因外顯子 2 與 BRAF 基因外顯子 15 的錯義突變。
在 119 例 c-kit 或 PDGFRA 野生型 GIST 標本中，檢測到 2 例 KRAS 基因外顯子 2 錯義突變，突變率 1.7%，均位于 12 號密碼子，突變類型分別為 G12D（GGT→GAT，圖 1）和 G12C（GGT→TGT，圖 2）；同時在另 2 例患者標本中檢測到 BRAFV600E 突變（圖 3、4），突變率為 1.7%。
在 19 對伊馬替尼治療耐藥前后的 GIST 標本中，均未檢測到 KRAS 與 BRAF 的錯義突變。
圖1
KRAS 外顯子 2 G12D（GGT→GAT）突變
圖2
KRAS 外顯子 2 G12C（GGT→TGT）突變
圖3
BRAF 外顯子 15 V600E 突變（GTG→GAG）
圖4
BRAF 外顯子 15 V600E 突變（GTG→GAG）
2.2 KRAS 與 BRAF 突變患者的臨床治療獲益情況
攜帶 KRAS G12C 突變的患者為一 48 歲男性患者，胃間質瘤合并腹膜多發轉移，c-kit 或 PDGFRA 野生型，接受伊馬替尼 400 mg/d 與后續加量至 600 mg/d 治療均顯示原發性耐藥，換用舒尼替尼 37.5 mg/d 二線治療獲得了 12 個月的無進展生存期，最終因腫瘤進展而死亡，總生存期 27 個月；攜帶 KRAS G12D 突變的患者為一 75 歲男性患者，小腸間質瘤合并多發肝轉移，c-kit 或 PDGFRA 野生型，接受伊馬替尼一線治療 8 個月后腫瘤進展，后失訪。
2 例攜帶 BRAF 突變的 c-kit 或 PDGFRA 野生型 GIST 患者，均接受了原發腫瘤的完整切除術，1 例為 31 歲女性患者，中度復發風險胃間質瘤，術后未接受伊馬替尼輔助治療，至末次隨訪無病生存時間已達 47 個月；1 例為 70 歲女性患者，高度復發風險的空腸間質瘤，腫瘤長徑 10 cm，細胞核分裂象 10/50 HPF，術后接受伊馬替尼輔助治療 2 年后停藥，至末次隨訪無病生存已達 7 年。
3 討論
野生型 GIST 的發病機制尚未完全清楚，作為 c-kit 基因的下游傳導通路，KRAS 和（或）BRAF 功能性突變可導致 RAS-RAF-MAPK 通路激活，從而引起腫瘤細胞增殖[11-12]。同時 KRAS 與 BRAF 基因突變已在多種腫瘤中被發現[13-16]。
有文獻[6-10]報道，可在 GIST 患者中檢測到 KRAS 與 BRAF 基因突變，但是結果并不一致。有 2 篇文獻[6-7]報道，在 c-kit 或 PDGFRA 野生型 GIST 患者中 BRAF 基因突變率為 7%，在突變型 GIST 患者中未能檢測到 BRAF 基因突變；但另一篇來自意大利的研究[8]發現，KRAS 與 BRAF 在伴發 c-kit 基因突變同時存在；而其余兩項研究[9-10]均未能檢測到 KRAS 與 BRAF 基因突變。在本研究中，低頻率的 KRAS（1.7%）與 BRAF（1.7%）突變也在野生型 GIST 中被檢測到。以上這些研究結果顯示，KRAS 與 BRAF 基因突變的確可存在于 GIST 中，但無論野生型還是突變型 GIST，KRAS 與 BRAF 基因突變發生率均較低。
來自意大利的體外研究[8]結果顯示，KRAS 與 BRAF 突變可降低伊馬替尼在 GIST 細胞系中的抗瘤作用，從而提出了其可能是伊馬替尼原發性耐藥的機制之一。在本研究中，有 2 例 KRAS 突變患者的確未能從伊馬替尼治療中獲得滿意的療效，似乎驗證了這一假說的可能性，其中有 1 例患者舒尼替尼二線治療后獲得了較長的腫瘤控制時間，其可能與舒尼替尼的抗血管生成作用相關[17]。本研究中，有 2 例野生型 GIST 標本中檢測到 BRAFV600E 突變，盡管這 2 例患者在伊馬替尼治療前接受腫瘤切除術而無法準確評估伊馬替尼的療效，但這 2 例患者均獲得了較長的無病生存時間，似乎提示 BRAF 突變的野生型 GIST 患者可能有較好的預后，這與前期 Agaram 等[6]報道的 BRAF 突變被發現于高復發風險的 GIST 患者中并不一致。
目前，BRAF 基因突變的 GIST 已經被定義為野生型 GIST 的一個亞組人群。有個案報道[18]顯示，在 BRAF 抑制劑 dabrafenib 治療 BRAF 基因突變的 GIST 患者中觀察到了腫瘤退縮，為該類患者的治療提供了可能的個體化選擇。在結直腸癌的研究[19]中顯示，KRAS 突變可能在治療過程中再次出現突變狀態的改變。然而在 GIST 的治療過程中，是否會發生由野生型向突變型狀態的改變從而引起伊馬替尼的繼發性耐藥呢？但是遺憾的是，在本研究的 19 對伊馬替尼耐藥前后的配對標本檢測中未能在耐藥后標本中檢測到 KRAS 或 BRAF 的繼發性突變。
綜上所述，本研究發現了 KRAS 與 BRAF 在 c-kit 或 PDGFRA 野生型 GIST 患者中可發生低頻率的突變，KRAS 突變患者顯示出對伊馬替尼原發性耐藥，尚未有證據顯示 KRAS 與 BRAF 突變參與伊馬替尼繼發性耐藥的過程。
胃腸間質瘤（gastrointestinal stromal tumors，GISTs）是最常見的消化系統軟組織肉瘤[1]，約 85% 的 GISTs 合并 c-kit 基因突變，5%～7% 的 GIST 患者檢測到 PDGFRA 基因突變，這些受體酪氨酸激酶突變可導致下游信號通路的激活并引起 GIST 細胞增殖與細胞凋亡的降低[2]。未檢測到 c-kit 或 PDGFRA 基因突變的野生型 GIST，其發病機制尚未完全清楚，同時對伊馬替尼的療效欠佳[3]。近期有研究[4]報道，野生型 GIST 根據已知的可能耐藥機制被分為不同亞組，包括琥珀酸脫氫酶缺失 GIST、纖維瘤病樣 GIST 及 BRAF 基因突變 GIST。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路 RAS/RAF/MEK/ERK 作為 c-kit 基因下游傳導通路之一，被激活后可在 c-kit 基因抑制狀態下引起信號傳導[5]。有研究[6-10]報道了 GIST 中可存在低頻率的 KRAS 與 BRAF 基因突變，但結果并不一致，同時樣本量均較小。另一方面，尚無文獻報道在接受伊馬替尼治療后是否存在 KRAS 與 BRAF 基因突變狀態改變而導致繼發耐藥。本研究的目的是在包含 c-kit 或 PDGFRA 基因突變型與野生型的大樣本 GIST 病例中評估 KRAS 與 BRAF 的突變情況，同時在伊馬替尼治療耐藥前后的配對標本中檢測 KRAS 與 BRAF 突變狀態可否發生改變。
1 資料與方法
1.1 患者資料
在來自北京大學腫瘤醫院 2002–2012 年期間就診的 519 例胃腸間質瘤患者中，獲取了 538 例石蠟包埋的 GIST 腫瘤組織標本，包含 381 例 c-kit 或 PDGFRA 基因突變型 GIST，119 例 c-kit 或 PDGFRA 基因野生型 GIST，19 例具有伊馬替尼治療耐藥前后配對標本的 GIST。該研究獲得北京大學腫瘤醫院倫理委員會的批準。全部患者的臨床病理資料見表 1。
表1
519 例 GIST 患者臨床病理特征
1.2 KRAS 與 BRAF 基因突變檢測
1.2.1 腫瘤組織 DNA 準備 按照試劑盒（E.Z.N.A. FFPE DNA Kit，Lot.D3399-01，美國 Omega 公司）說明提取甲醛固定后石蠟包埋的組織中基因組 DNA，–20 ℃ 保存備用。
1.2.2 KRAS 與 BRAF 基因突變檢測 采用下述引物聚合酶鏈反應擴增 KRAS 基因外顯子 2 和 BRAF 基因外顯子 15。KRAS 上游引物為 5′-GGTACTG-GTGGAGTATTTGATAG-3′，下游引物為 5′-TGGTCCTGCACCAGTAATATG-3′，擴增產物片段長度為 248 bp；BRAF 上游引物為 5′-CTCTT-CATAATGCTTGCTCTGATAGG-3′，下游引物為 5′-GTGGAAAAATAGCCTCAATTCTTACC-3′，擴增產物片段長度 211 bp。反應條件為：初始變性 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，45 個循環；72 ℃ 延伸 10 min；4 ℃ 結束反應。PCR 產物經 3% 瓊脂糖凝膠電泳確定后，用 ABI 公司的 3730XL 測序儀進行序列分析。應用 Chromas 軟件在信/噪比>98% 的條件下判斷基因突變情況。
2 結果
2.1 KRAS 與 BRAF 基因突變情況
在 381 例 c-kit 或 PDGFRA 突變型 GIST 標本中，僅檢測到 43 例 KRAS 基因同義突變（密碼子 22，CAG→CAA）和 1 例 BRAF 基因同義突變（密碼子 558，CTC→CTT），未檢測到 KRAS 基因外顯子 2 與 BRAF 基因外顯子 15 的錯義突變。
在 119 例 c-kit 或 PDGFRA 野生型 GIST 標本中，檢測到 2 例 KRAS 基因外顯子 2 錯義突變，突變率 1.7%，均位于 12 號密碼子，突變類型分別為 G12D（GGT→GAT，圖 1）和 G12C（GGT→TGT，圖 2）；同時在另 2 例患者標本中檢測到 BRAFV600E 突變（圖 3、4），突變率為 1.7%。
在 19 對伊馬替尼治療耐藥前后的 GIST 標本中，均未檢測到 KRAS 與 BRAF 的錯義突變。
圖1
KRAS 外顯子 2 G12D（GGT→GAT）突變
圖2
KRAS 外顯子 2 G12C（GGT→TGT）突變
圖3
BRAF 外顯子 15 V600E 突變（GTG→GAG）
圖4
BRAF 外顯子 15 V600E 突變（GTG→GAG）
2.2 KRAS 與 BRAF 突變患者的臨床治療獲益情況
攜帶 KRAS G12C 突變的患者為一 48 歲男性患者，胃間質瘤合并腹膜多發轉移，c-kit 或 PDGFRA 野生型，接受伊馬替尼 400 mg/d 與后續加量至 600 mg/d 治療均顯示原發性耐藥，換用舒尼替尼 37.5 mg/d 二線治療獲得了 12 個月的無進展生存期，最終因腫瘤進展而死亡，總生存期 27 個月；攜帶 KRAS G12D 突變的患者為一 75 歲男性患者，小腸間質瘤合并多發肝轉移，c-kit 或 PDGFRA 野生型，接受伊馬替尼一線治療 8 個月后腫瘤進展，后失訪。
2 例攜帶 BRAF 突變的 c-kit 或 PDGFRA 野生型 GIST 患者，均接受了原發腫瘤的完整切除術，1 例為 31 歲女性患者，中度復發風險胃間質瘤，術后未接受伊馬替尼輔助治療，至末次隨訪無病生存時間已達 47 個月；1 例為 70 歲女性患者，高度復發風險的空腸間質瘤，腫瘤長徑 10 cm，細胞核分裂象 10/50 HPF，術后接受伊馬替尼輔助治療 2 年后停藥，至末次隨訪無病生存已達 7 年。
3 討論
野生型 GIST 的發病機制尚未完全清楚，作為 c-kit 基因的下游傳導通路，KRAS 和（或）BRAF 功能性突變可導致 RAS-RAF-MAPK 通路激活，從而引起腫瘤細胞增殖[11-12]。同時 KRAS 與 BRAF 基因突變已在多種腫瘤中被發現[13-16]。
有文獻[6-10]報道，可在 GIST 患者中檢測到 KRAS 與 BRAF 基因突變，但是結果并不一致。有 2 篇文獻[6-7]報道，在 c-kit 或 PDGFRA 野生型 GIST 患者中 BRAF 基因突變率為 7%，在突變型 GIST 患者中未能檢測到 BRAF 基因突變；但另一篇來自意大利的研究[8]發現，KRAS 與 BRAF 在伴發 c-kit 基因突變同時存在；而其余兩項研究[9-10]均未能檢測到 KRAS 與 BRAF 基因突變。在本研究中，低頻率的 KRAS（1.7%）與 BRAF（1.7%）突變也在野生型 GIST 中被檢測到。以上這些研究結果顯示，KRAS 與 BRAF 基因突變的確可存在于 GIST 中，但無論野生型還是突變型 GIST，KRAS 與 BRAF 基因突變發生率均較低。
來自意大利的體外研究[8]結果顯示，KRAS 與 BRAF 突變可降低伊馬替尼在 GIST 細胞系中的抗瘤作用，從而提出了其可能是伊馬替尼原發性耐藥的機制之一。在本研究中，有 2 例 KRAS 突變患者的確未能從伊馬替尼治療中獲得滿意的療效，似乎驗證了這一假說的可能性，其中有 1 例患者舒尼替尼二線治療后獲得了較長的腫瘤控制時間，其可能與舒尼替尼的抗血管生成作用相關[17]。本研究中，有 2 例野生型 GIST 標本中檢測到 BRAFV600E 突變，盡管這 2 例患者在伊馬替尼治療前接受腫瘤切除術而無法準確評估伊馬替尼的療效，但這 2 例患者均獲得了較長的無病生存時間，似乎提示 BRAF 突變的野生型 GIST 患者可能有較好的預后，這與前期 Agaram 等[6]報道的 BRAF 突變被發現于高復發風險的 GIST 患者中并不一致。
目前，BRAF 基因突變的 GIST 已經被定義為野生型 GIST 的一個亞組人群。有個案報道[18]顯示，在 BRAF 抑制劑 dabrafenib 治療 BRAF 基因突變的 GIST 患者中觀察到了腫瘤退縮，為該類患者的治療提供了可能的個體化選擇。在結直腸癌的研究[19]中顯示，KRAS 突變可能在治療過程中再次出現突變狀態的改變。然而在 GIST 的治療過程中，是否會發生由野生型向突變型狀態的改變從而引起伊馬替尼的繼發性耐藥呢？但是遺憾的是，在本研究的 19 對伊馬替尼耐藥前后的配對標本檢測中未能在耐藥后標本中檢測到 KRAS 或 BRAF 的繼發性突變。
綜上所述，本研究發現了 KRAS 與 BRAF 在 c-kit 或 PDGFRA 野生型 GIST 患者中可發生低頻率的突變，KRAS 突變患者顯示出對伊馬替尼原發性耐藥，尚未有證據顯示 KRAS 與 BRAF 突變參與伊馬替尼繼發性耐藥的過程。
