引用本文： 李川, 王川, 張曉赟, 文天夫. 肝動脈結扎對梗阻性黃疸大鼠殘肝肝細胞凋亡及再生的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(1): 24-31. doi: 10.7507/1007-9424.201609056 復制
膽管癌是第二常見的肝臟原發性惡性腫瘤，大約占消化系統腫瘤的3%[1]。近年來，膽管癌的發病率有增高的趨勢。據報道[2]，美國每年新增約3 000例膽管癌患者，50%～60%為肝門膽管癌。肝門膽管癌的早期診斷較困難。由于肝門部解剖結構較復雜，肝門膽管癌診斷時常有門靜脈和（或）肝動脈侵犯，其根治性切除率較低。盡管有研究[3-4]認為，肝門膽管癌伴門靜脈或肝動脈侵犯時，同時行門靜脈或肝動脈切除重建能夠提高患者生存率，但有時肝門部血管重建較困難，尤其是肝動脈。既往筆者的臨床研究[5]中發現，對伴有肝動脈侵犯的肝門膽管癌患者，同時行左半肝聯合肝固有動脈切除可以提高切除率，且并不增加患者圍手術期風險。但肝固有動脈切除后對剩余肝臟肝細胞的凋亡及再生的影響目前尚不明確。本研究擬通過大鼠梗阻性黃疸模型，研究肝切除聯合肝動脈結扎對剩余肝臟肝細胞凋亡及再生的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與分組
1.1.1 實驗動物 8 周齡Wistar雄性大鼠80只，由四川大學華西醫院科技園實驗動物中心提供，體質量240～260 g。大鼠進入動物飼養房，分籠后常規喂養 1 周，以適應動物房環境；實驗前動物稱重，體質量為（282±24）g。
1.1.2 實驗動物分組 實驗動物分為 4 組，每組大鼠20只。即：建立梗阻性黃疸模型后 3 d施行70%肝切除+肝固有動脈結扎+膽腸內引流組（A組）；建立梗阻性黃疸模型后 3 d施行70%肝切除+膽腸內引流（B組）；假手術后 3 d施行70%肝切除+肝固有動脈結扎（C組）和假手術后 3 d施行70%肝切除（D組）。
1.2 主要儀器、試劑
① 日立7170A型自動生化檢測儀（Hitach，Japan）；② TUNEL羅氏免疫熒光原位凋亡檢測試劑盒（Roche，Swiss）；③ Brdu（Sigma，USA）
1.3 大鼠梗阻性黃疸模型建立方法
術前大鼠均禁食12 h、不禁飲，術后均立即給予自配10%葡萄糖水及常規飼料喂養。梗阻性黃疸模型建立方法：乙醚吸入麻醉后，大鼠仰臥位固定于手術臺，腹部手術范圍剃毛備皮后，用70%醫用乙醇消毒 3 遍，鋪無菌洞巾，自大鼠劍突向下作約1.5 cm長腹部正中切口；濕棉簽輔助輕柔暴露肝十二指腸韌帶，游離膽總管，距肝門處肝臟面1.2～1.5 cm處使用 1 號絲線近遠端分別雙重結扎膽總管，然后離斷以防止再通，關腹、保溫復蘇。
各組大鼠于第 1 步手術后 3 d進行第 2 次手術。① 70%肝切除：采用Higgins等[6]的經典肝蒂結扎法切除大鼠左外葉（約30%）和中葉（約40%）。② 肝固有動脈結扎法：使用濕棉簽將肝十二指腸韌帶向左側撥開后找到腹主動脈，在膈角處腹主動脈腹側發出腹腔干，沿著腹腔干走行識別出肝總動脈，順著肝總動脈走行識別出胃十二指腸動脈和肝固有動脈，游離出肝固有動脈，用 1 號絲線近遠端分別雙重結扎并離斷。③ 膽腸內引流法：使用外徑0.96 mm、長 2 cm外表給予磨砂和兩端刻線處理（有利于絲線固定導管和組織）的硬膜外導管作為再通擴張的膽總管與十二指腸的通道，一端置入擴張的膽總管內，帶線結扎固定，另一端置入幽門下方約 2 cm的十二指腸內，導管周圍使用 1 號絲線荷包縫合固定，拉攏導管兩端已固定的絲線再次打結固定，使擴張的膽總管與十二指腸緊密貼合防止漏膽。最后，檢查腹腔無明顯出血、漏膽后關腹，入籠保溫復蘇。術前、術中及術后 6 h內死亡的大鼠視為手術不當引起的死亡，不計入實驗范疇的手術后死亡。對于每組大鼠術后的數量不足，給予同中心、同品系及同齡的大鼠補充，保證每組 4 個時間點上各有 5 只大鼠可取標本。
1.4 檢測指標及方法
1.4.1 取材時間 4 組大鼠均在第 2 次70%切肝手術后的 1 d、2 d、3 d和 6 d 4 個時間點上通過心臟采血各處死 5 只，采集血液標本并切取肝臟標本備檢。各組大鼠均在處死前 1 h，腹腔注射濃度為30 μg/L的Brdu溶液 1 mL。① 大鼠每次術前稱重及術后每個時間點取標本前稱重。② 記錄每組大鼠的術后死亡數并分析死亡原因。③ 各組大鼠取血后 1 h內，室溫下，3 000 r/min離心10 min（r=3 cm），取上層血清，–80 ℃保存備用。④ 各組大鼠心臟采血處死后，殘肝取右外葉置入10%中性甲醛液中固定，24～48 h后石蠟包埋；另取三角葉立即放入液氮中保存，24 h后轉入–80 ℃深低溫冰箱保存備檢。
1.4.2 檢測指標 ① 血清標本采用日立7170A型自動生化檢測儀測定血清膽紅素（TB）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）和白蛋白（ALB）水平。② 肝臟標本在10%中性甲醛液中固定24～48 h后，常規石蠟包埋，連續 4 μm厚切片，所有標本均行HE染色。③ 所有石蠟切片均行TUNEL法檢測肝細胞凋亡情況。④ 所有石蠟切片均行Brdu細胞增殖標記的免疫組化染色，按ABC法進行檢測，蘇木精或伊紅襯染。
1.4.3 結果判定標準 TUNEL陽性計數在熒光顯微鏡×400倍視野下計數發綠色熒光的陽性細胞數，以陽性細胞數除以細胞總數計算出肝臟組織細胞的凋亡指數（AI），每個標本計數 5 個視野，取其平均值，以百分數表示。Brdu定量細胞增殖結果判定：Brdu標記的細胞質及細胞核呈棕色則為Brdu標記陽性細胞。在顯微鏡下隨機計數10個×400倍視野中的細胞總數及Brdu標記陽性細胞數，計算標記指數（RI，Brdu標記陽性細胞數/細胞總數），該指數即為肝細胞增殖指數。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件。計量數據以均數±標準差（ ）表示，進行單因素方差分析或t 檢驗；計數資料用率表示，行χ2 檢驗或Fisher’s精確檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 術中情況及實驗大鼠術后死亡情況及分析
梗阻性黃疸模型術后第 3 天，術中見大鼠腹腔中度可分離的粘連，腹腔臟器黃染；大鼠膽總管擴張明顯，直徑1.5～2 mm，膽管壁變薄呈透明狀；肝臟腫脹明顯，棕黃色，表面呈顆粒狀表現。
實驗共用114只 8 周齡Wistar雄性大鼠，4 組實驗因第 1 次手術麻醉過深或手術不當共死亡 5 只。A組第 2 次手術因麻醉過深或失血過多死亡 4 只，本實驗術后6～24 h內死亡 9 只，手術成功率為87.9%（29/33），術后成活率為69.0%（20/29）。B組第 2 次手術因麻醉過深或失血過多死亡 3 只，本實驗術后6～24 h內死亡 8 只，手術成功率為90.3%（28/31），術后成活率為71.4%（20/28）。C 組第 2 次手術因麻醉過深或失血過多死亡 2 只，手術成功率為90.9%（20/22），術后成活率為100%（20/20）。D 組第 2 次手術因麻醉過深或失血過多死亡 3 只，手術成功率為87.0%（20/23），術后成活率為100%（20/20）。其中 A、B 2 組大鼠術后成活率的差異無統計學意義（P=0.932），C、D 2 組大鼠術后成活率的差異也無統計學意義（P=1.000），但 A、B 2 組大鼠術后成活率均明顯低于 C、D 2 組（P＜0.05）。所有第 2 次術后6～24 h內死亡的動物均行尸檢證實為非失血或漏膽引起的死亡，其死亡可能為肝功能衰竭所致。死亡大鼠即時用同中心、同品系的同齡大鼠予以補充。
2.2 各組大鼠肝功能指標檢測結果
4 組大鼠術后不同時相血清TB、ALT、AST和ALB檢測結果見表 1。從表 1 可以看出，A組和B組大鼠術后各時相肝功能的大多數指標的差異均無統計學意義（P＞0.05），但術后早期的ALB水平，A組低于B組（術后 3 d，P＜0.05）；C組和D組術后各時相肝功能指標的差異也無統計學意義（P＞0.05），但術后早期C組的ALB水平低于D組（術后 1 d和 3 d 均P＜0.05）。
表1
4 組大鼠70%肝切除術后各時相血清肝功能各指標檢測結果（
）
術后早期（術后 3 d 內）A、B 2 組大鼠的肝功能指標總體上要差于C、D 組（P＜0.05）；但在術后晚期（術后 6 d時）A、B 2 組大鼠的肝功能指標明顯恢復，尤其是ALT和AST，與 C、D 組比較差異已無統計學意義（均P＞0.05）；而血清TB水平，A、B 組仍明顯高于C、D組（均P＜0.05）。在肝臟淤膽狀態下完成的A、B 2 組大鼠70%肝切除術后各時相的血清TB水平均明顯高于肝臟正常狀態下行70%肝切除的C、D 2 組（均P＜0.05）。A、B 2 組大鼠術后其血清TB水平下降明顯（術后 1 d比術后 6 d，P＜0.05），提示膽腸內引流對梗阻性黃疸的引流效果明顯。C、D 2 組大鼠肝切除術后 2 d和 3 d血清TB水平有所升高并達到高峰，這可能是肝臟切除和結扎肝動脈引起的肝臟損害造成的，之后則好轉恢復。
2.3 肝臟組織的病理學改變
光鏡下見：A組肝臟的肝索較清楚連貫，匯管區出現大量淋巴細胞浸潤，肝細胞腫脹明顯，細胞質廣泛空泡化；B組肝臟的肝索清楚，匯管區同A組、有大量淋巴細胞浸潤，肝細胞腫脹，空泡化較多；C組和D組的肝臟其表現大體相似，肝索、匯管區清晰，無炎癥細胞浸潤，肝細胞形態較正常，無明顯腫脹。具體見圖 1。
圖1
示各組大鼠70%肝切除術后 1 d殘肝的的病理學改變（HE ×100） a：A組；b：B組；c：C組；d：D組
2.4 肝細胞凋亡指數檢測結果
結果見圖 2 及圖 3。由圖 2 和圖 3 可見，TUNEL染色的藍色背景下發綠色熒光的細胞為陽性凋亡肝細胞。A、B、C 3 個組術后 1 d殘肝細胞凋亡指數達到最大，而后逐漸下降；與其他 3 組比較，D組殘肝細胞凋亡指數在術后各時相均為最低；如圖 4 所示，術后 1 d和 2 d 4 組大鼠的殘肝肝細胞凋亡指數比較差異均有統計學意義（P＜0.05），各組凋亡指數為 A 組＞B 組＞C 組＞D組；術后 3 d及 6 d，除C組與D組之間殘肝肝細胞凋亡指數差異無統計學意義外（P＞0.05），其他各組兩兩比較其差異均有統計學意義（P＜0.05）。
圖2
示TUNEL法檢測各組大鼠70%肝切除術后 1 d的殘肝細胞凋亡熒光圖（TUNEL ×400） 細胞質及細胞核發綠色熒光者為陽性凋亡細胞；a：A組；b：B組；c：C組；d：D組
圖3
示各組大鼠70%肝切除術后各時相殘肝肝細胞凋亡指數檢測結果 *為術后 1 d和 2 d，4 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；△為術后 3 d和 6 d，A組與同時相C組及D組比較其差異有統計學意義（P＜0.05）；#為術后 3 d和 6 d，B組與同時相C組及D組比較其差異有統計學意義（P＜0.05）
圖4
示Brdu標記的各組大鼠70%肝切除術后 1 d的殘肝細胞增殖情況（Brdu ×400） 細胞質及細胞核呈棕染的細胞為陽性增殖肝細胞；a：A組；b：B組；c：C組；d：D組
2.5 肝細胞增殖指數檢測結果
結果見圖 4 和圖 5。由圖 4 和圖 5 可見，Brdu增殖標記染色的細胞質或細胞核棕染的肝細胞為增殖肝細胞。在術后 1 d，C、D 2 組大鼠的肝細胞增殖達峰值，增殖指數大小為D組＞C組＞B組＞A組，各組之間的差異均有統計學意義（P＜0.05）。在術后 2 d，A、B 2 組的肝細胞增殖才達峰值，但 2 組間肝細胞增殖指數差異無統計學意義（P＞0.05）；C、D 2 組的肝細胞增殖指數仍明顯高于A、B組，C組又明顯高于其他 3 組，即A組比C組、A組比D組、B組比C組、B 組比D組和C組比D組，之間的差異均有統計學意義（P＜0.05）。術后 3 d，除了C、D 2 組間肝細胞增殖指數比較差異無統計學意義外（P＞0.05），其他組兩兩間比較差異仍有統計學意義（P＜0.05）。術后 6 d，A、B 2 組的肝細胞增殖指數無明顯升高，C、D 2 組的肝細胞增殖指數明顯降低，4 組的肝細胞增殖指數均處于較低的水平。
圖5
示各組大鼠70%肝切除術后不同時相殘肝肝細胞增殖指數檢測結果 *為術后 1 d，4 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；△為術后 2 d，C 組與同時相A組及B組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；#為術后 3 d，D 組與同時相A組及B組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；§為術后 3 d，D組與C組比較差異有統計學意義（P＜0.05）
3 討論
目前，根治性切除是肝門膽管癌患者獲得長期生存的最主要的方法之一。但由于肝門部解剖結構復雜，且肝門膽管癌極易侵犯肝門部動脈和門靜脈，使得肝門膽管癌根治性切除較困難。盡管血管切除重建并非手術禁止，但肝門膽管癌手術時有時血管重建仍較困難，尤其是肝動脈重建[4,7-8]。若對于這部分患者，行肝動脈切除后不予以重建勢必可以增加患者根治性切除的機會。但對于肝門膽管癌患者肝動脈切除后不重建仍然存在較大的爭議。Neuhaus等[9]分析了80例行肝切除的肝門膽管癌患者資料后指出，行門靜脈切除者 5 年生存率可高達65%，明顯高于未行門靜脈切除的28%。但de Jong等[10]的一項多中心研究指出，雖然聯合肝切除與門靜脈切除可提高肝門膽管癌患者的長期生存率，但其早期死亡風險明顯高于未行門靜脈切除者。
肝臟由門靜脈和肝動脈雙重供血。常規情況下，肝總動脈自腹腔干發出后，主要分出肝固有動脈和胃十二指腸動脈，肝固有動脈又依次分出胃右動脈、肝左/右動脈和膽囊動脈。肝左右動脈分支入肝后，在肝門區或肝內延著Glisson鞘多次分支并伴隨門靜脈和肝管分支一起走行于Glisson鞘內，形成非常豐富的動脈側支吻合。肝臟除了常規的肝動脈供應動脈血外，在肝周韌帶內還存在多條側支循環。當肝動脈被慢性侵犯或壓閉阻塞時，肝臟側支循環就會增粗變大，供血量明顯增加。Michels等[11-13]早在20世紀50、60年代就多次研究報告了肝臟的側支循環。基礎研究與臨床研究[14-16]亦證實，術前若腫瘤侵犯導致肝臟動脈血供完全阻斷，并不會對肝臟功能產生巨大影響。筆者此前的研究[5]亦認為，對于術中擬切除肝動脈不予重建的患者，不要游離剩余肝臟的肝周韌帶，以便保存側支循環。本研究亦證實，肝動脈結扎后將增加肝細胞凋亡，減弱肝細胞再生能力。
細胞凋亡是由特定基因控制，在酶促反應下，按照一定的程序發生的細胞主動死亡過程，是機體維持自我平衡的一種生理機制[17]。在肝細胞凋亡方面，本研究結果顯示，對于正常肝臟，行70%大部肝切除后大鼠或結扎肝動脈聯合肝切除的大鼠來說，70%肝切除未明顯促進殘肝肝細胞凋亡，但是肝動脈的結扎明顯促進了術后早期（2 d內）的肝細胞凋亡；而到了晚期（3 d后），2 組大鼠殘肝肝細胞的凋亡情況差異已無統計學意義（P＞0.05）。肝臟再生是殘肝肝細胞通過有絲分裂形成新的細胞，恢復原來肝細胞數量和肝體積的生理機制。有研究[18]報道，大鼠大部肝切除術后，殘肝肝細胞的DNA合成在24 h內達到高峰，7～10 d殘肝即再生恢復到原來的肝臟體積。研究[18]發現，肝再生主要是肝細胞生長因子（HGF）刺激內皮細胞形成新生血管并刺激肝細胞增殖完成的。本研究結果顯示，在肝再生方面，正常肝臟狀態下，70%肝切除或結扎肝動脈聯合70%肝切除的大鼠都會在術后 2 d內達到增殖高峰；結扎肝動脈在切除術后早期（2 d內）減弱了大部肝切除大鼠的肝臟再生能力，但同時也延長了殘肝肝細胞增殖的時間；在術后 6 d時，2 組的肝臟再生已接近完成。
多數學者[19-21]認為，梗阻性黃疸狀態下，肝細胞凋亡是梗阻性黃疸引起肝細胞死亡并導致肝臟損害的主要原因，所以，肝臟功能的衰竭主要是由肝細胞的凋亡引起的。肝細胞凋亡在梗阻性黃疸的肝臟病理過程中有極其重要的作用。梗阻性黃疸過程中，高濃度的膽汁酸鹽直接損害肝細胞、引起肝細胞凋亡，再加上淤膽狀態下機體的脂質過氧化反應和大量細胞因子的產生，加劇了肝細胞的凋亡[22-24]。本研究的結果顯示，梗阻性黃疸模型大鼠實施70%肝切除聯合肝動脈結扎組較70%肝切除組肝細胞凋亡增加，再生能力減弱。但 2 組的術后死亡率差異無統計學意義。值得注意的是，本研究同時還發現，最影響肝細胞凋亡與肝臟再生的因素是梗阻性黃疸。
綜上，本研究結果證實，結扎肝動脈將增加殘肝肝細胞凋亡，減弱肝細胞再生。但結扎肝動脈并未增加梗阻性黃疸大鼠術后死亡風險。
膽管癌是第二常見的肝臟原發性惡性腫瘤，大約占消化系統腫瘤的3%[1]。近年來，膽管癌的發病率有增高的趨勢。據報道[2]，美國每年新增約3 000例膽管癌患者，50%～60%為肝門膽管癌。肝門膽管癌的早期診斷較困難。由于肝門部解剖結構較復雜，肝門膽管癌診斷時常有門靜脈和（或）肝動脈侵犯，其根治性切除率較低。盡管有研究[3-4]認為，肝門膽管癌伴門靜脈或肝動脈侵犯時，同時行門靜脈或肝動脈切除重建能夠提高患者生存率，但有時肝門部血管重建較困難，尤其是肝動脈。既往筆者的臨床研究[5]中發現，對伴有肝動脈侵犯的肝門膽管癌患者，同時行左半肝聯合肝固有動脈切除可以提高切除率，且并不增加患者圍手術期風險。但肝固有動脈切除后對剩余肝臟肝細胞的凋亡及再生的影響目前尚不明確。本研究擬通過大鼠梗阻性黃疸模型，研究肝切除聯合肝動脈結扎對剩余肝臟肝細胞凋亡及再生的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與分組
1.1.1 實驗動物 8 周齡Wistar雄性大鼠80只，由四川大學華西醫院科技園實驗動物中心提供，體質量240～260 g。大鼠進入動物飼養房，分籠后常規喂養 1 周，以適應動物房環境；實驗前動物稱重，體質量為（282±24）g。
1.1.2 實驗動物分組 實驗動物分為 4 組，每組大鼠20只。即：建立梗阻性黃疸模型后 3 d施行70%肝切除+肝固有動脈結扎+膽腸內引流組（A組）；建立梗阻性黃疸模型后 3 d施行70%肝切除+膽腸內引流（B組）；假手術后 3 d施行70%肝切除+肝固有動脈結扎（C組）和假手術后 3 d施行70%肝切除（D組）。
1.2 主要儀器、試劑
① 日立7170A型自動生化檢測儀（Hitach，Japan）；② TUNEL羅氏免疫熒光原位凋亡檢測試劑盒（Roche，Swiss）；③ Brdu（Sigma，USA）
1.3 大鼠梗阻性黃疸模型建立方法
術前大鼠均禁食12 h、不禁飲，術后均立即給予自配10%葡萄糖水及常規飼料喂養。梗阻性黃疸模型建立方法：乙醚吸入麻醉后，大鼠仰臥位固定于手術臺，腹部手術范圍剃毛備皮后，用70%醫用乙醇消毒 3 遍，鋪無菌洞巾，自大鼠劍突向下作約1.5 cm長腹部正中切口；濕棉簽輔助輕柔暴露肝十二指腸韌帶，游離膽總管，距肝門處肝臟面1.2～1.5 cm處使用 1 號絲線近遠端分別雙重結扎膽總管，然后離斷以防止再通，關腹、保溫復蘇。
各組大鼠于第 1 步手術后 3 d進行第 2 次手術。① 70%肝切除：采用Higgins等[6]的經典肝蒂結扎法切除大鼠左外葉（約30%）和中葉（約40%）。② 肝固有動脈結扎法：使用濕棉簽將肝十二指腸韌帶向左側撥開后找到腹主動脈，在膈角處腹主動脈腹側發出腹腔干，沿著腹腔干走行識別出肝總動脈，順著肝總動脈走行識別出胃十二指腸動脈和肝固有動脈，游離出肝固有動脈，用 1 號絲線近遠端分別雙重結扎并離斷。③ 膽腸內引流法：使用外徑0.96 mm、長 2 cm外表給予磨砂和兩端刻線處理（有利于絲線固定導管和組織）的硬膜外導管作為再通擴張的膽總管與十二指腸的通道，一端置入擴張的膽總管內，帶線結扎固定，另一端置入幽門下方約 2 cm的十二指腸內，導管周圍使用 1 號絲線荷包縫合固定，拉攏導管兩端已固定的絲線再次打結固定，使擴張的膽總管與十二指腸緊密貼合防止漏膽。最后，檢查腹腔無明顯出血、漏膽后關腹，入籠保溫復蘇。術前、術中及術后 6 h內死亡的大鼠視為手術不當引起的死亡，不計入實驗范疇的手術后死亡。對于每組大鼠術后的數量不足，給予同中心、同品系及同齡的大鼠補充，保證每組 4 個時間點上各有 5 只大鼠可取標本。
1.4 檢測指標及方法
1.4.1 取材時間 4 組大鼠均在第 2 次70%切肝手術后的 1 d、2 d、3 d和 6 d 4 個時間點上通過心臟采血各處死 5 只，采集血液標本并切取肝臟標本備檢。各組大鼠均在處死前 1 h，腹腔注射濃度為30 μg/L的Brdu溶液 1 mL。① 大鼠每次術前稱重及術后每個時間點取標本前稱重。② 記錄每組大鼠的術后死亡數并分析死亡原因。③ 各組大鼠取血后 1 h內，室溫下，3 000 r/min離心10 min（r=3 cm），取上層血清，–80 ℃保存備用。④ 各組大鼠心臟采血處死后，殘肝取右外葉置入10%中性甲醛液中固定，24～48 h后石蠟包埋；另取三角葉立即放入液氮中保存，24 h后轉入–80 ℃深低溫冰箱保存備檢。
1.4.2 檢測指標 ① 血清標本采用日立7170A型自動生化檢測儀測定血清膽紅素（TB）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）和白蛋白（ALB）水平。② 肝臟標本在10%中性甲醛液中固定24～48 h后，常規石蠟包埋，連續 4 μm厚切片，所有標本均行HE染色。③ 所有石蠟切片均行TUNEL法檢測肝細胞凋亡情況。④ 所有石蠟切片均行Brdu細胞增殖標記的免疫組化染色，按ABC法進行檢測，蘇木精或伊紅襯染。
1.4.3 結果判定標準 TUNEL陽性計數在熒光顯微鏡×400倍視野下計數發綠色熒光的陽性細胞數，以陽性細胞數除以細胞總數計算出肝臟組織細胞的凋亡指數（AI），每個標本計數 5 個視野，取其平均值，以百分數表示。Brdu定量細胞增殖結果判定：Brdu標記的細胞質及細胞核呈棕色則為Brdu標記陽性細胞。在顯微鏡下隨機計數10個×400倍視野中的細胞總數及Brdu標記陽性細胞數，計算標記指數（RI，Brdu標記陽性細胞數/細胞總數），該指數即為肝細胞增殖指數。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件。計量數據以均數±標準差（ ）表示，進行單因素方差分析或t 檢驗；計數資料用率表示，行χ2 檢驗或Fisher’s精確檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 術中情況及實驗大鼠術后死亡情況及分析
梗阻性黃疸模型術后第 3 天，術中見大鼠腹腔中度可分離的粘連，腹腔臟器黃染；大鼠膽總管擴張明顯，直徑1.5～2 mm，膽管壁變薄呈透明狀；肝臟腫脹明顯，棕黃色，表面呈顆粒狀表現。
實驗共用114只 8 周齡Wistar雄性大鼠，4 組實驗因第 1 次手術麻醉過深或手術不當共死亡 5 只。A組第 2 次手術因麻醉過深或失血過多死亡 4 只，本實驗術后6～24 h內死亡 9 只，手術成功率為87.9%（29/33），術后成活率為69.0%（20/29）。B組第 2 次手術因麻醉過深或失血過多死亡 3 只，本實驗術后6～24 h內死亡 8 只，手術成功率為90.3%（28/31），術后成活率為71.4%（20/28）。C 組第 2 次手術因麻醉過深或失血過多死亡 2 只，手術成功率為90.9%（20/22），術后成活率為100%（20/20）。D 組第 2 次手術因麻醉過深或失血過多死亡 3 只，手術成功率為87.0%（20/23），術后成活率為100%（20/20）。其中 A、B 2 組大鼠術后成活率的差異無統計學意義（P=0.932），C、D 2 組大鼠術后成活率的差異也無統計學意義（P=1.000），但 A、B 2 組大鼠術后成活率均明顯低于 C、D 2 組（P＜0.05）。所有第 2 次術后6～24 h內死亡的動物均行尸檢證實為非失血或漏膽引起的死亡，其死亡可能為肝功能衰竭所致。死亡大鼠即時用同中心、同品系的同齡大鼠予以補充。
2.2 各組大鼠肝功能指標檢測結果
4 組大鼠術后不同時相血清TB、ALT、AST和ALB檢測結果見表 1。從表 1 可以看出，A組和B組大鼠術后各時相肝功能的大多數指標的差異均無統計學意義（P＞0.05），但術后早期的ALB水平，A組低于B組（術后 3 d，P＜0.05）；C組和D組術后各時相肝功能指標的差異也無統計學意義（P＞0.05），但術后早期C組的ALB水平低于D組（術后 1 d和 3 d 均P＜0.05）。
表1
4 組大鼠70%肝切除術后各時相血清肝功能各指標檢測結果（
）
術后早期（術后 3 d 內）A、B 2 組大鼠的肝功能指標總體上要差于C、D 組（P＜0.05）；但在術后晚期（術后 6 d時）A、B 2 組大鼠的肝功能指標明顯恢復，尤其是ALT和AST，與 C、D 組比較差異已無統計學意義（均P＞0.05）；而血清TB水平，A、B 組仍明顯高于C、D組（均P＜0.05）。在肝臟淤膽狀態下完成的A、B 2 組大鼠70%肝切除術后各時相的血清TB水平均明顯高于肝臟正常狀態下行70%肝切除的C、D 2 組（均P＜0.05）。A、B 2 組大鼠術后其血清TB水平下降明顯（術后 1 d比術后 6 d，P＜0.05），提示膽腸內引流對梗阻性黃疸的引流效果明顯。C、D 2 組大鼠肝切除術后 2 d和 3 d血清TB水平有所升高并達到高峰，這可能是肝臟切除和結扎肝動脈引起的肝臟損害造成的，之后則好轉恢復。
2.3 肝臟組織的病理學改變
光鏡下見：A組肝臟的肝索較清楚連貫，匯管區出現大量淋巴細胞浸潤，肝細胞腫脹明顯，細胞質廣泛空泡化；B組肝臟的肝索清楚，匯管區同A組、有大量淋巴細胞浸潤，肝細胞腫脹，空泡化較多；C組和D組的肝臟其表現大體相似，肝索、匯管區清晰，無炎癥細胞浸潤，肝細胞形態較正常，無明顯腫脹。具體見圖 1。
圖1
示各組大鼠70%肝切除術后 1 d殘肝的的病理學改變（HE ×100） a：A組；b：B組；c：C組；d：D組
2.4 肝細胞凋亡指數檢測結果
結果見圖 2 及圖 3。由圖 2 和圖 3 可見，TUNEL染色的藍色背景下發綠色熒光的細胞為陽性凋亡肝細胞。A、B、C 3 個組術后 1 d殘肝細胞凋亡指數達到最大，而后逐漸下降；與其他 3 組比較，D組殘肝細胞凋亡指數在術后各時相均為最低；如圖 4 所示，術后 1 d和 2 d 4 組大鼠的殘肝肝細胞凋亡指數比較差異均有統計學意義（P＜0.05），各組凋亡指數為 A 組＞B 組＞C 組＞D組；術后 3 d及 6 d，除C組與D組之間殘肝肝細胞凋亡指數差異無統計學意義外（P＞0.05），其他各組兩兩比較其差異均有統計學意義（P＜0.05）。
圖2
示TUNEL法檢測各組大鼠70%肝切除術后 1 d的殘肝細胞凋亡熒光圖（TUNEL ×400） 細胞質及細胞核發綠色熒光者為陽性凋亡細胞；a：A組；b：B組；c：C組；d：D組
圖3
示各組大鼠70%肝切除術后各時相殘肝肝細胞凋亡指數檢測結果 *為術后 1 d和 2 d，4 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；△為術后 3 d和 6 d，A組與同時相C組及D組比較其差異有統計學意義（P＜0.05）；#為術后 3 d和 6 d，B組與同時相C組及D組比較其差異有統計學意義（P＜0.05）
圖4
示Brdu標記的各組大鼠70%肝切除術后 1 d的殘肝細胞增殖情況（Brdu ×400） 細胞質及細胞核呈棕染的細胞為陽性增殖肝細胞；a：A組；b：B組；c：C組；d：D組
2.5 肝細胞增殖指數檢測結果
結果見圖 4 和圖 5。由圖 4 和圖 5 可見，Brdu增殖標記染色的細胞質或細胞核棕染的肝細胞為增殖肝細胞。在術后 1 d，C、D 2 組大鼠的肝細胞增殖達峰值，增殖指數大小為D組＞C組＞B組＞A組，各組之間的差異均有統計學意義（P＜0.05）。在術后 2 d，A、B 2 組的肝細胞增殖才達峰值，但 2 組間肝細胞增殖指數差異無統計學意義（P＞0.05）；C、D 2 組的肝細胞增殖指數仍明顯高于A、B組，C組又明顯高于其他 3 組，即A組比C組、A組比D組、B組比C組、B 組比D組和C組比D組，之間的差異均有統計學意義（P＜0.05）。術后 3 d，除了C、D 2 組間肝細胞增殖指數比較差異無統計學意義外（P＞0.05），其他組兩兩間比較差異仍有統計學意義（P＜0.05）。術后 6 d，A、B 2 組的肝細胞增殖指數無明顯升高，C、D 2 組的肝細胞增殖指數明顯降低，4 組的肝細胞增殖指數均處于較低的水平。
圖5
示各組大鼠70%肝切除術后不同時相殘肝肝細胞增殖指數檢測結果 *為術后 1 d，4 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；△為術后 2 d，C 組與同時相A組及B組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；#為術后 3 d，D 組與同時相A組及B組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；§為術后 3 d，D組與C組比較差異有統計學意義（P＜0.05）
3 討論
目前，根治性切除是肝門膽管癌患者獲得長期生存的最主要的方法之一。但由于肝門部解剖結構復雜，且肝門膽管癌極易侵犯肝門部動脈和門靜脈，使得肝門膽管癌根治性切除較困難。盡管血管切除重建并非手術禁止，但肝門膽管癌手術時有時血管重建仍較困難，尤其是肝動脈重建[4,7-8]。若對于這部分患者，行肝動脈切除后不予以重建勢必可以增加患者根治性切除的機會。但對于肝門膽管癌患者肝動脈切除后不重建仍然存在較大的爭議。Neuhaus等[9]分析了80例行肝切除的肝門膽管癌患者資料后指出，行門靜脈切除者 5 年生存率可高達65%，明顯高于未行門靜脈切除的28%。但de Jong等[10]的一項多中心研究指出，雖然聯合肝切除與門靜脈切除可提高肝門膽管癌患者的長期生存率，但其早期死亡風險明顯高于未行門靜脈切除者。
肝臟由門靜脈和肝動脈雙重供血。常規情況下，肝總動脈自腹腔干發出后，主要分出肝固有動脈和胃十二指腸動脈，肝固有動脈又依次分出胃右動脈、肝左/右動脈和膽囊動脈。肝左右動脈分支入肝后，在肝門區或肝內延著Glisson鞘多次分支并伴隨門靜脈和肝管分支一起走行于Glisson鞘內，形成非常豐富的動脈側支吻合。肝臟除了常規的肝動脈供應動脈血外，在肝周韌帶內還存在多條側支循環。當肝動脈被慢性侵犯或壓閉阻塞時，肝臟側支循環就會增粗變大，供血量明顯增加。Michels等[11-13]早在20世紀50、60年代就多次研究報告了肝臟的側支循環。基礎研究與臨床研究[14-16]亦證實，術前若腫瘤侵犯導致肝臟動脈血供完全阻斷，并不會對肝臟功能產生巨大影響。筆者此前的研究[5]亦認為，對于術中擬切除肝動脈不予重建的患者，不要游離剩余肝臟的肝周韌帶，以便保存側支循環。本研究亦證實，肝動脈結扎后將增加肝細胞凋亡，減弱肝細胞再生能力。
細胞凋亡是由特定基因控制，在酶促反應下，按照一定的程序發生的細胞主動死亡過程，是機體維持自我平衡的一種生理機制[17]。在肝細胞凋亡方面，本研究結果顯示，對于正常肝臟，行70%大部肝切除后大鼠或結扎肝動脈聯合肝切除的大鼠來說，70%肝切除未明顯促進殘肝肝細胞凋亡，但是肝動脈的結扎明顯促進了術后早期（2 d內）的肝細胞凋亡；而到了晚期（3 d后），2 組大鼠殘肝肝細胞的凋亡情況差異已無統計學意義（P＞0.05）。肝臟再生是殘肝肝細胞通過有絲分裂形成新的細胞，恢復原來肝細胞數量和肝體積的生理機制。有研究[18]報道，大鼠大部肝切除術后，殘肝肝細胞的DNA合成在24 h內達到高峰，7～10 d殘肝即再生恢復到原來的肝臟體積。研究[18]發現，肝再生主要是肝細胞生長因子（HGF）刺激內皮細胞形成新生血管并刺激肝細胞增殖完成的。本研究結果顯示，在肝再生方面，正常肝臟狀態下，70%肝切除或結扎肝動脈聯合70%肝切除的大鼠都會在術后 2 d內達到增殖高峰；結扎肝動脈在切除術后早期（2 d內）減弱了大部肝切除大鼠的肝臟再生能力，但同時也延長了殘肝肝細胞增殖的時間；在術后 6 d時，2 組的肝臟再生已接近完成。
多數學者[19-21]認為，梗阻性黃疸狀態下，肝細胞凋亡是梗阻性黃疸引起肝細胞死亡并導致肝臟損害的主要原因，所以，肝臟功能的衰竭主要是由肝細胞的凋亡引起的。肝細胞凋亡在梗阻性黃疸的肝臟病理過程中有極其重要的作用。梗阻性黃疸過程中，高濃度的膽汁酸鹽直接損害肝細胞、引起肝細胞凋亡，再加上淤膽狀態下機體的脂質過氧化反應和大量細胞因子的產生，加劇了肝細胞的凋亡[22-24]。本研究的結果顯示，梗阻性黃疸模型大鼠實施70%肝切除聯合肝動脈結扎組較70%肝切除組肝細胞凋亡增加，再生能力減弱。但 2 組的術后死亡率差異無統計學意義。值得注意的是，本研究同時還發現，最影響肝細胞凋亡與肝臟再生的因素是梗阻性黃疸。
綜上，本研究結果證實，結扎肝動脈將增加殘肝肝細胞凋亡，減弱肝細胞再生。但結扎肝動脈并未增加梗阻性黃疸大鼠術后死亡風險。
