引用本文： 楊曉佳, 石喬, 余佳, 陳辰, 何斌, 趙亮, 王鵬, 胡鵬, 李晨, 郭聞一, 王衛星. TNF-α介導重癥急性胰腺炎腎上腺細胞的凋亡. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(10): 1198-1203. doi: 10.7507/1007-9424.20160307 復制
重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種嚴重危害人類健康、常見且多發的外科急腹癥，病情兇險，容易引起全身炎癥反應綜合征（syste-mic inflammatory response syndrome，SIRS），導致多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syn-drome，MODS）等嚴重并發癥，病死率高達20%～40% [1]。目前，對SAP引起的肺、腎損傷研究較多[2-4]，而對SAP相關腎上腺損傷的研究還不多見。SAP早期就可出現腎上腺損傷和腎上腺功能不全。有研究[5]顯示，約有16%的SAP患者合并有腎上腺損傷和腎上腺功能不全，而合并有MODS的SAP患者約有27%會發生腎上腺損傷和腎上腺功能不全，提示腎上腺的損傷有可能加重病情，促使MODS的發生。本研究旨在觀察腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在胰腺炎相關性腎上腺細胞凋亡中的作用。
1 材料與方法
1.1 主要材料及試劑
牛磺膽酸鈉溶液（STC，美國Sigma公司），兔抗大鼠TNF-α抗體及Caspase-3抗體（美國Abcam公司），TUNEL凋亡試劑盒（Roche公司）。
1.2 實驗動物分組和模型制備
1.2.1 實驗動物分組
40只SPF級雄性Wistar大鼠（湖北省疾病預防控制中心提供），鼠齡7～8周、體質量200～250 g。采用隨機數字表法隨機分為假手術組（SO組，n=8）和SAP組（n=32）；SAP組再按3、6、12及24 h觀察時間點分為4個亞組，每組各8只。
1.2.2 SAP大鼠模型制備
實驗大鼠術前禁食12 h，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）進行麻醉，取上腹正中切口進腹，翻動十二指腸找到十二指腸乳頭開口，用鈍性細針頭沿十二指腸乳頭逆行插入膽胰管，用無損傷血管夾分別肝門處的膽總管及針頭插入處的膽胰管，恒速注入（0.1 mL/100 g）5%牛磺膽酸鈉溶液（0.1 mL/100 g），并保持膽胰管夾閉5 min，5 min后若觀察發現胰腺出現出血、水腫等情況則表明造模成功，關腹。SO組大鼠開腹后僅翻動十二指腸和胰腺即關腹。造模成功后2組大鼠均皮下補液（2 mL/100 g）。
1.3 標本采集
SAP組大鼠分別于造模術后3、6、12及24 h以及SO組大鼠在術后3 h腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，心臟采血10 mL，采集血液于2 000 r/min（r=20 cm）下離心15 min，分離血清保存于于-20 ℃備用。肉眼觀察胰腺組織及腎上腺組織的大體病理改變，取胰頭組織及左側腎上腺組織，以4%多聚甲醛固定，行HE染色，光鏡下觀察。
1.4 檢測指標及方法
1.4.1 血清淀粉酶（AMY）和脂肪酶（LIP）測定
采用全自動生化分析儀（日本奧林巴斯2700，武漢大學人民醫院檢驗科）測定血清AMY及LIP水平。
1.4.2 組織病理學改變觀察
取胰頭和左側腎上腺用4%多聚甲醛固定、切片、HE染色，光鏡下觀察組織病理改變。觀察胰腺水腫、腺泡壞死、出血和脂肪壞死、炎癥、血管周圍炎性浸潤等情況，根據Schmidt等[6]的方法，進行病理學評分。選取腎上腺病理切片，在高倍鏡下觀察并拍照，請兩位資深病理學專家盲法閱片，根據本實驗室前期研究[7]所提出的評分標準，并根據血竇擴張、細胞變性、細胞壞死及炎性細胞浸潤情況進行評分，計算平均分，即為標本病理損傷的評分。其具體的評分標準[7]為：①血竇擴張。無血竇擴張、0分；1～10個血竇擴張、0.5分；11～20個血竇擴張、1分；21～30個血竇擴張、1.5分；≥31個血竇擴張、2分。②細胞變性面積。無細胞變性、0分；0～5%細胞發生變性、0.5分；5%～10%細胞發生變性、1分；10%～15%細胞發生變性、1.5分；15%～20%細胞發生變性、2分；20%～25%細胞發生變性、2.5分；25%～30%細胞發生變性、3分；30%～35細胞發生變性、3.5分；35%以上細胞發生變性、4分。③細胞壞死。未見細胞壞死、0分；1處出現1～5個細胞壞死、1分；2處及以上出現1～5個細胞壞死、2分；“2分”標準+1處出現5個以上細胞壞死、3分； > 2處出現5個以上細胞壞死、4分。④炎性細胞浸潤。未見炎性細胞浸潤、0分；1～5個炎性細胞浸潤、1分；5個以上炎性細胞浸潤、2分。
1.4.3 原位細胞凋亡檢測
采用原位末端標記（TUNEL）法、按照試劑盒說明書進行。每張腎上腺組織TUNEL染色切片隨機選取5個高倍視野，計算每100個細胞中的凋亡細胞數，以百分數表示。腎上腺細胞凋亡指數（AI）=凋亡細胞數/總細胞數×100%。
1.4.4 TNF-α及Caspase-3蛋白表達檢測
采用蛋白質印跡法（Western blot）檢測腎上腺組織中TNF-α及Caspase-3蛋白的表達。提取各組大鼠腎上腺組織的總蛋白，取10 μL蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳、電轉、封閉，加一抗、二抗后，用Odyssey雙色紅外激光成像系統（LI-COR Odyssey，武漢大學人民醫院中心實驗室）掃描，并分析圖像。
1.5 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件分析。所有計量數據均以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 血清AMY及LIP水平檢測結果
造模術后各時間點SAP組大鼠血清AMY及LIP水平均較SO組高（AMY：t3 h=4.05、P < 0.05，t6 h=12.49、P < 0.05，t12 h=16.37、P < 0.05，t24 h=17.74、P < 0.05；LIP：t3 h=3.20、P < 0.05，t6 h=20.96、P < 0.05，t12 h=25.84、P < 0.05，t24 h=39.73、P < 0.05），差異具有統計學意義；SAP組造模術后血清AMY及LIP水平逐漸升高，后一時相與前一時相比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠血清AMY及LIP水平檢測結果
2.2 胰腺組織病理學改變
SO組胰腺組織未見出血、水腫、壞死等改變，SAP組胰腺出現明顯出血、壞死等改變，并伴有皂化斑出現，以24 h組最為嚴重。光鏡下觀察，SO組胰腺組織正常，未見水腫、出血及炎性細胞浸潤（圖 1A）；SAP組胰腺組織病理損害隨著造模術后時間的延長進行性加重，可見腺體破壞，腺泡水腫、壞死，間質出血，炎性細胞浸潤（圖 1B～1E）。SAP組造模術后各時間點Schmidt病理評分進行性升高，且均高于SO組（t3 h=7.40，P < 0.05；t6 h=12.65，P < 0.05；t12 h=24.16，P < 0.05；t24 h=31.26，P < 0.05），差異具有統計學意義（圖 1F）。
圖1
示各組大鼠胰腺組織病理學改變（HE ×200）及其病理學評分。1A：SO組；1B：SAP 3 h組；1C：SAP 6 h組；1D：SAP 12 h組；1E：SAP 24 h組；1F：胰腺組織病理學評分，與SO組比較，*P < 0.05；SAP組內與前一時間點比較，△ P < 0.05 ?圖 2??示各組大鼠腎上腺組織病理學改變（HE ×200）及其病理學評分。2A：SO組；2B：SAP 3 h組；2C：SAP 6 h組；2D：SAP 12 h組；2E：SAP 24 h組；2F：腎上腺組織病理學評分，與SO組比較，*P < 0.05；SAP組內與前一時間點比較，△ P < 0.05
2.3 腎上腺組織的病理學改變
2.3.1 腎上腺大體觀察結果
SO組腎上腺包膜紅潤、光滑，未見水腫、皂化斑等改變；SAP組腎上腺包膜緊張，水腫，周圍可見皂化斑出現，以24 h組最為嚴重。
2.3.2 腎上腺組織病理學改變
SO組腎上腺皮質腺體結構完整，未見腫脹、出血等改變，未見炎性細胞浸潤（圖 2A）。造模術后3 h見腎上腺稍水腫，未見明顯出血和炎性細胞浸潤，腺體結構基本完整，隨著造模術后時間的延長，水腫情況進行性加重，間質出血，炎性細胞增多，腺體結構遭到破壞，至造模術后24 h時，可觀察到皮質細胞破壞，可見片狀出血，炎性細胞浸潤明顯，出現片狀壞死，腎上腺腺體結構遭到明顯破壞（圖 2B～2E）。SAP組隨病程發展，腎上腺組織的病理學評分進行性升高，且各時間點腎上腺組織病理學評分均較SO組高（t3 h=11.19，P < 0.05；t6 h=16.78，P < 0.05；t12 h=21.23，P < 0.05；t24 h=25.80，P < 0.05），差異具有統計學意義（圖 2F)。
2.4 腎上腺細胞凋亡檢測結果
SO組腎上腺凋亡細胞數較少（圖 3A），SAP組腎上腺凋亡細胞則明顯增多（圖 3B），且隨病程延長，AI進行性升高，SAP各時相組均高于SO組（t3 h=10.84, P < 0.05；t6 h=14.44，P < 0.05；t12 h=19.24，P < 0.05；t24 h=24.55，P < 0.05），差異具有統計學意義（圖 3C）。
圖3
示各組大鼠腎上腺組織TUNEL染色結果（TUNEL ×200）及AI檢測結果。3A：SO組；3B：SAP 12 h組；3C：腎上腺細胞AI，與SO組比較，*P < 0.05；SAP組內與前一時間點比較，△ P < 0.05
2.5 腎上腺組織中TNF-α及Caspase-3蛋白表達檢測結果
應用Western blot法對SAP造模后不同時相的腎上腺組織TNF-α及Caspase-3蛋白表達進行半定量分析，結果顯示，SO組大鼠腎上腺組織中TNF-α蛋白表達水平較低，而在SAP造模后3、6、12及24 h其表達水平均高于SO組，且隨病程延長逐漸升高，至24 h略有下降，但仍高于SO組（t3 h=5.08, P < 0.05；t6 h=3.39，P < 0.05；t12 h=8.29，P < 0.05；t24 h=17.46，P < 0.05），差異有統計學意義。Caspase-3蛋白在造模后隨病程延長逐漸升高，24 h時略有下降，但均高于SO組（t3 h=9.59, P < 0.05；t6 h=3.72，P < 0.05；t12 h=3.82，P < 0.05；t24 h=8.53，P < 0.05），差異有統計學意義。見圖 4。
圖4
示腎上腺組織中TNF-α及Caspase-3蛋白表達檢測結果。4A：Western blot電泳圖，1為SO組，2為SAP 3 h組，3為SAP 6 h組，4為SAP 12 h組，5為SAP 24 h組；4B：TNF-α蛋白相對表達水平；4C：Caspase3蛋白相對表達水平。與SO組比較，*P < 0.05；SAP組內與前一時間點比較，△ P < 0.05
3 討論
目前研究表明，臨床上約20%～30%的急性胰腺炎患者會發展為SAP，甚至可能發展為多臟器功能障礙（MODS），病情危重，主要表現為胰腺壞死和胰外器官的損傷[8]，其中30%～70%的危重患者可能伴發腎上腺功能不全[9]。有研究[10]表明，在繼發性腎上腺損傷中可出現細胞凋亡現象，細胞凋亡是為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，而目前關于SAP腎上腺功能不全中腎上腺細胞凋亡的相關研究報道較少。
SAP早期時存在炎癥細胞過度激活，大量炎癥介質入血，引發瀑布樣級聯反應，導致多器官功能紊亂、衰竭及組織損傷。有研究[5, 11]表明，急性胰腺炎合并MODS時，腎上腺功能已經部分或完全喪失，主要表現為影像學腎上腺血流灌注的改變或組織學腎上腺組織形態破壞。本實驗結果發現，腎上腺損傷后的病理學改變有血竇擴張，血管充血，細胞變性、壞死，炎癥細胞浸潤等，且SAP組腎上腺病理學評分逐漸升高，提示腎上腺損傷情況與SAP病情發展一致。
正常成年大鼠腎上腺皮質細胞不斷在外層增殖，并向內層遷移形成各細胞層，以維持其穩定的形態和功能，正常大鼠腎上腺皮質細胞在最內側的網狀帶凋亡[12]。有研究[13]顯示，正常大鼠腎上腺有53個凋亡相關基因，其中39個具有促凋亡活性，14個有抗凋亡活性。另外有研究[14]也表明，在急慢性疾病中發生的繼發性腎上腺損傷中可出現腎上腺細胞凋亡現象，SAP早期就可出現腎上腺損傷和腎上腺功能不全。
TNF-α是一種多效的促炎癥反應細胞因子，主要由活化的巨噬細胞產生，還有少部分由其他細胞產生。TNF-α通過與TNF-R1和TNF-R2結合，從而發揮多種效應，但其誘導凋亡效應主要由TNF-R1介導[15]。TNF-α與TNF-R1結合后形成的蛋白復合物可以通過線粒體途徑放大活性，從而調控線粒體通透性的轉變（MPT），誘導細胞色素C的釋放，最終活化Caspase-3。同時，釋放出來的第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活蛋白（Smac/Diablo）與X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）結合，使其對Caspase-3的抑制作用減弱，進而導致Caspase-3的充分激活[16-18]。Caspase-3是直接誘導細胞凋亡最重要的效應蛋白酶之一，是凋亡機理的核心成分[19-20]。在誘導細胞凋亡因素的作用下，Caspase-3被激活，活化后的Caspase-3具有在天冬氨酸殘基后切斷肽鍵的能力，使細胞產生核皺縮、DNA斷裂等凋亡現象[21]。本實驗結果顯示，SAP造模術后各時間點腎上腺組織中TNF-α及Caspase-3蛋白表達均隨著病程的進展逐漸升高，到12 h時表達最高，24 h略有下降，提示在腎上腺損傷過程中，可能由于TNF-α蛋白表達的增加，促進了Caspase-3蛋白的表達，從而導致腎上腺細胞凋亡增加，引起腎上腺的損傷。TNF-α及Caspase-3蛋白的表達與腎上腺損傷一致，說明在SAP大鼠，由于TNF-α表達的增高，在它的作用下，Caspase-3從線粒體釋放并激活，導致腎上腺細胞內重要蛋白質降解失活及DNA斷裂，最終使細胞發生凋亡。
本研究結果表明，SAP時可出現腎上腺損傷及腎上腺功能不全，隨著腎上腺凋亡細胞的增多，腎上腺病理損傷進行性惡化，而TNF-α和Caspase-3蛋白表達在SAP組進行性升高，12 h達到頂峰，至24 h組略有下降。有文獻[22-23]報道，在肝細胞損傷過程中細胞凋亡的發生早于細胞壞死。因此我們推測，腎上腺損傷首先由TNF-α介導的細胞凋亡引起，且凋亡程度與病情發展一致，而到24 h時，腎上腺損傷已十分嚴重，此時的損傷不再以凋亡為主，而是以細胞壞死為主，因此TNF-α和Caspase-3蛋白的表達則略有下降。本研究結果提示，TNF-α和Caspase-3可能參與了腎上腺細胞凋亡的調控。通過抑制TNF-α和Caspase-3的表達，可能可以減少細胞凋亡的發生，對SAP時腎上腺細胞的損傷可起到一定的保護作用。但在胰腺炎病程中，腎上腺損傷的機理復雜，仍需深入研究。
重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種嚴重危害人類健康、常見且多發的外科急腹癥，病情兇險，容易引起全身炎癥反應綜合征（syste-mic inflammatory response syndrome，SIRS），導致多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syn-drome，MODS）等嚴重并發癥，病死率高達20%～40% [1]。目前，對SAP引起的肺、腎損傷研究較多[2-4]，而對SAP相關腎上腺損傷的研究還不多見。SAP早期就可出現腎上腺損傷和腎上腺功能不全。有研究[5]顯示，約有16%的SAP患者合并有腎上腺損傷和腎上腺功能不全，而合并有MODS的SAP患者約有27%會發生腎上腺損傷和腎上腺功能不全，提示腎上腺的損傷有可能加重病情，促使MODS的發生。本研究旨在觀察腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在胰腺炎相關性腎上腺細胞凋亡中的作用。
1 材料與方法
1.1 主要材料及試劑
牛磺膽酸鈉溶液（STC，美國Sigma公司），兔抗大鼠TNF-α抗體及Caspase-3抗體（美國Abcam公司），TUNEL凋亡試劑盒（Roche公司）。
1.2 實驗動物分組和模型制備
1.2.1 實驗動物分組
40只SPF級雄性Wistar大鼠（湖北省疾病預防控制中心提供），鼠齡7～8周、體質量200～250 g。采用隨機數字表法隨機分為假手術組（SO組，n=8）和SAP組（n=32）；SAP組再按3、6、12及24 h觀察時間點分為4個亞組，每組各8只。
1.2.2 SAP大鼠模型制備
實驗大鼠術前禁食12 h，自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）進行麻醉，取上腹正中切口進腹，翻動十二指腸找到十二指腸乳頭開口，用鈍性細針頭沿十二指腸乳頭逆行插入膽胰管，用無損傷血管夾分別肝門處的膽總管及針頭插入處的膽胰管，恒速注入（0.1 mL/100 g）5%牛磺膽酸鈉溶液（0.1 mL/100 g），并保持膽胰管夾閉5 min，5 min后若觀察發現胰腺出現出血、水腫等情況則表明造模成功，關腹。SO組大鼠開腹后僅翻動十二指腸和胰腺即關腹。造模成功后2組大鼠均皮下補液（2 mL/100 g）。
1.3 標本采集
SAP組大鼠分別于造模術后3、6、12及24 h以及SO組大鼠在術后3 h腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，心臟采血10 mL，采集血液于2 000 r/min（r=20 cm）下離心15 min，分離血清保存于于-20 ℃備用。肉眼觀察胰腺組織及腎上腺組織的大體病理改變，取胰頭組織及左側腎上腺組織，以4%多聚甲醛固定，行HE染色，光鏡下觀察。
1.4 檢測指標及方法
1.4.1 血清淀粉酶（AMY）和脂肪酶（LIP）測定
采用全自動生化分析儀（日本奧林巴斯2700，武漢大學人民醫院檢驗科）測定血清AMY及LIP水平。
1.4.2 組織病理學改變觀察
取胰頭和左側腎上腺用4%多聚甲醛固定、切片、HE染色，光鏡下觀察組織病理改變。觀察胰腺水腫、腺泡壞死、出血和脂肪壞死、炎癥、血管周圍炎性浸潤等情況，根據Schmidt等[6]的方法，進行病理學評分。選取腎上腺病理切片，在高倍鏡下觀察并拍照，請兩位資深病理學專家盲法閱片，根據本實驗室前期研究[7]所提出的評分標準，并根據血竇擴張、細胞變性、細胞壞死及炎性細胞浸潤情況進行評分，計算平均分，即為標本病理損傷的評分。其具體的評分標準[7]為：①血竇擴張。無血竇擴張、0分；1～10個血竇擴張、0.5分；11～20個血竇擴張、1分；21～30個血竇擴張、1.5分；≥31個血竇擴張、2分。②細胞變性面積。無細胞變性、0分；0～5%細胞發生變性、0.5分；5%～10%細胞發生變性、1分；10%～15%細胞發生變性、1.5分；15%～20%細胞發生變性、2分；20%～25%細胞發生變性、2.5分；25%～30%細胞發生變性、3分；30%～35細胞發生變性、3.5分；35%以上細胞發生變性、4分。③細胞壞死。未見細胞壞死、0分；1處出現1～5個細胞壞死、1分；2處及以上出現1～5個細胞壞死、2分；“2分”標準+1處出現5個以上細胞壞死、3分； > 2處出現5個以上細胞壞死、4分。④炎性細胞浸潤。未見炎性細胞浸潤、0分；1～5個炎性細胞浸潤、1分；5個以上炎性細胞浸潤、2分。
1.4.3 原位細胞凋亡檢測
采用原位末端標記（TUNEL）法、按照試劑盒說明書進行。每張腎上腺組織TUNEL染色切片隨機選取5個高倍視野，計算每100個細胞中的凋亡細胞數，以百分數表示。腎上腺細胞凋亡指數（AI）=凋亡細胞數/總細胞數×100%。
1.4.4 TNF-α及Caspase-3蛋白表達檢測
采用蛋白質印跡法（Western blot）檢測腎上腺組織中TNF-α及Caspase-3蛋白的表達。提取各組大鼠腎上腺組織的總蛋白，取10 μL蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳、電轉、封閉，加一抗、二抗后，用Odyssey雙色紅外激光成像系統（LI-COR Odyssey，武漢大學人民醫院中心實驗室）掃描，并分析圖像。
1.5 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件分析。所有計量數據均以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 血清AMY及LIP水平檢測結果
造模術后各時間點SAP組大鼠血清AMY及LIP水平均較SO組高（AMY：t3 h=4.05、P < 0.05，t6 h=12.49、P < 0.05，t12 h=16.37、P < 0.05，t24 h=17.74、P < 0.05；LIP：t3 h=3.20、P < 0.05，t6 h=20.96、P < 0.05，t12 h=25.84、P < 0.05，t24 h=39.73、P < 0.05），差異具有統計學意義；SAP組造模術后血清AMY及LIP水平逐漸升高，后一時相與前一時相比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠血清AMY及LIP水平檢測結果
2.2 胰腺組織病理學改變
SO組胰腺組織未見出血、水腫、壞死等改變，SAP組胰腺出現明顯出血、壞死等改變，并伴有皂化斑出現，以24 h組最為嚴重。光鏡下觀察，SO組胰腺組織正常，未見水腫、出血及炎性細胞浸潤（圖 1A）；SAP組胰腺組織病理損害隨著造模術后時間的延長進行性加重，可見腺體破壞，腺泡水腫、壞死，間質出血，炎性細胞浸潤（圖 1B～1E）。SAP組造模術后各時間點Schmidt病理評分進行性升高，且均高于SO組（t3 h=7.40，P < 0.05；t6 h=12.65，P < 0.05；t12 h=24.16，P < 0.05；t24 h=31.26，P < 0.05），差異具有統計學意義（圖 1F）。
圖1
示各組大鼠胰腺組織病理學改變（HE ×200）及其病理學評分。1A：SO組；1B：SAP 3 h組；1C：SAP 6 h組；1D：SAP 12 h組；1E：SAP 24 h組；1F：胰腺組織病理學評分，與SO組比較，*P < 0.05；SAP組內與前一時間點比較，△ P < 0.05 ?圖 2??示各組大鼠腎上腺組織病理學改變（HE ×200）及其病理學評分。2A：SO組；2B：SAP 3 h組；2C：SAP 6 h組；2D：SAP 12 h組；2E：SAP 24 h組；2F：腎上腺組織病理學評分，與SO組比較，*P < 0.05；SAP組內與前一時間點比較，△ P < 0.05
2.3 腎上腺組織的病理學改變
2.3.1 腎上腺大體觀察結果
SO組腎上腺包膜紅潤、光滑，未見水腫、皂化斑等改變；SAP組腎上腺包膜緊張，水腫，周圍可見皂化斑出現，以24 h組最為嚴重。
2.3.2 腎上腺組織病理學改變
SO組腎上腺皮質腺體結構完整，未見腫脹、出血等改變，未見炎性細胞浸潤（圖 2A）。造模術后3 h見腎上腺稍水腫，未見明顯出血和炎性細胞浸潤，腺體結構基本完整，隨著造模術后時間的延長，水腫情況進行性加重，間質出血，炎性細胞增多，腺體結構遭到破壞，至造模術后24 h時，可觀察到皮質細胞破壞，可見片狀出血，炎性細胞浸潤明顯，出現片狀壞死，腎上腺腺體結構遭到明顯破壞（圖 2B～2E）。SAP組隨病程發展，腎上腺組織的病理學評分進行性升高，且各時間點腎上腺組織病理學評分均較SO組高（t3 h=11.19，P < 0.05；t6 h=16.78，P < 0.05；t12 h=21.23，P < 0.05；t24 h=25.80，P < 0.05），差異具有統計學意義（圖 2F)。
2.4 腎上腺細胞凋亡檢測結果
SO組腎上腺凋亡細胞數較少（圖 3A），SAP組腎上腺凋亡細胞則明顯增多（圖 3B），且隨病程延長，AI進行性升高，SAP各時相組均高于SO組（t3 h=10.84, P < 0.05；t6 h=14.44，P < 0.05；t12 h=19.24，P < 0.05；t24 h=24.55，P < 0.05），差異具有統計學意義（圖 3C）。
圖3
示各組大鼠腎上腺組織TUNEL染色結果（TUNEL ×200）及AI檢測結果。3A：SO組；3B：SAP 12 h組；3C：腎上腺細胞AI，與SO組比較，*P < 0.05；SAP組內與前一時間點比較，△ P < 0.05
2.5 腎上腺組織中TNF-α及Caspase-3蛋白表達檢測結果
應用Western blot法對SAP造模后不同時相的腎上腺組織TNF-α及Caspase-3蛋白表達進行半定量分析，結果顯示，SO組大鼠腎上腺組織中TNF-α蛋白表達水平較低，而在SAP造模后3、6、12及24 h其表達水平均高于SO組，且隨病程延長逐漸升高，至24 h略有下降，但仍高于SO組（t3 h=5.08, P < 0.05；t6 h=3.39，P < 0.05；t12 h=8.29，P < 0.05；t24 h=17.46，P < 0.05），差異有統計學意義。Caspase-3蛋白在造模后隨病程延長逐漸升高，24 h時略有下降，但均高于SO組（t3 h=9.59, P < 0.05；t6 h=3.72，P < 0.05；t12 h=3.82，P < 0.05；t24 h=8.53，P < 0.05），差異有統計學意義。見圖 4。
圖4
示腎上腺組織中TNF-α及Caspase-3蛋白表達檢測結果。4A：Western blot電泳圖，1為SO組，2為SAP 3 h組，3為SAP 6 h組，4為SAP 12 h組，5為SAP 24 h組；4B：TNF-α蛋白相對表達水平；4C：Caspase3蛋白相對表達水平。與SO組比較，*P < 0.05；SAP組內與前一時間點比較，△ P < 0.05
3 討論
目前研究表明，臨床上約20%～30%的急性胰腺炎患者會發展為SAP，甚至可能發展為多臟器功能障礙（MODS），病情危重，主要表現為胰腺壞死和胰外器官的損傷[8]，其中30%～70%的危重患者可能伴發腎上腺功能不全[9]。有研究[10]表明，在繼發性腎上腺損傷中可出現細胞凋亡現象，細胞凋亡是為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，而目前關于SAP腎上腺功能不全中腎上腺細胞凋亡的相關研究報道較少。
SAP早期時存在炎癥細胞過度激活，大量炎癥介質入血，引發瀑布樣級聯反應，導致多器官功能紊亂、衰竭及組織損傷。有研究[5, 11]表明，急性胰腺炎合并MODS時，腎上腺功能已經部分或完全喪失，主要表現為影像學腎上腺血流灌注的改變或組織學腎上腺組織形態破壞。本實驗結果發現，腎上腺損傷后的病理學改變有血竇擴張，血管充血，細胞變性、壞死，炎癥細胞浸潤等，且SAP組腎上腺病理學評分逐漸升高，提示腎上腺損傷情況與SAP病情發展一致。
正常成年大鼠腎上腺皮質細胞不斷在外層增殖，并向內層遷移形成各細胞層，以維持其穩定的形態和功能，正常大鼠腎上腺皮質細胞在最內側的網狀帶凋亡[12]。有研究[13]顯示，正常大鼠腎上腺有53個凋亡相關基因，其中39個具有促凋亡活性，14個有抗凋亡活性。另外有研究[14]也表明，在急慢性疾病中發生的繼發性腎上腺損傷中可出現腎上腺細胞凋亡現象，SAP早期就可出現腎上腺損傷和腎上腺功能不全。
TNF-α是一種多效的促炎癥反應細胞因子，主要由活化的巨噬細胞產生，還有少部分由其他細胞產生。TNF-α通過與TNF-R1和TNF-R2結合，從而發揮多種效應，但其誘導凋亡效應主要由TNF-R1介導[15]。TNF-α與TNF-R1結合后形成的蛋白復合物可以通過線粒體途徑放大活性，從而調控線粒體通透性的轉變（MPT），誘導細胞色素C的釋放，最終活化Caspase-3。同時，釋放出來的第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活蛋白（Smac/Diablo）與X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）結合，使其對Caspase-3的抑制作用減弱，進而導致Caspase-3的充分激活[16-18]。Caspase-3是直接誘導細胞凋亡最重要的效應蛋白酶之一，是凋亡機理的核心成分[19-20]。在誘導細胞凋亡因素的作用下，Caspase-3被激活，活化后的Caspase-3具有在天冬氨酸殘基后切斷肽鍵的能力，使細胞產生核皺縮、DNA斷裂等凋亡現象[21]。本實驗結果顯示，SAP造模術后各時間點腎上腺組織中TNF-α及Caspase-3蛋白表達均隨著病程的進展逐漸升高，到12 h時表達最高，24 h略有下降，提示在腎上腺損傷過程中，可能由于TNF-α蛋白表達的增加，促進了Caspase-3蛋白的表達，從而導致腎上腺細胞凋亡增加，引起腎上腺的損傷。TNF-α及Caspase-3蛋白的表達與腎上腺損傷一致，說明在SAP大鼠，由于TNF-α表達的增高，在它的作用下，Caspase-3從線粒體釋放并激活，導致腎上腺細胞內重要蛋白質降解失活及DNA斷裂，最終使細胞發生凋亡。
本研究結果表明，SAP時可出現腎上腺損傷及腎上腺功能不全，隨著腎上腺凋亡細胞的增多，腎上腺病理損傷進行性惡化，而TNF-α和Caspase-3蛋白表達在SAP組進行性升高，12 h達到頂峰，至24 h組略有下降。有文獻[22-23]報道，在肝細胞損傷過程中細胞凋亡的發生早于細胞壞死。因此我們推測，腎上腺損傷首先由TNF-α介導的細胞凋亡引起，且凋亡程度與病情發展一致，而到24 h時，腎上腺損傷已十分嚴重，此時的損傷不再以凋亡為主，而是以細胞壞死為主，因此TNF-α和Caspase-3蛋白的表達則略有下降。本研究結果提示，TNF-α和Caspase-3可能參與了腎上腺細胞凋亡的調控。通過抑制TNF-α和Caspase-3的表達，可能可以減少細胞凋亡的發生，對SAP時腎上腺細胞的損傷可起到一定的保護作用。但在胰腺炎病程中，腎上腺損傷的機理復雜，仍需深入研究。
