引用本文： 吳鐸, 徐大方, 趙群, 姚純, 張秀梅. 結直腸癌組織CDK8及TGF-β1 mRNA和蛋白表達及與其臨床病理因素相關性分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(7): 813-817. doi: 10.7507/1007-9424.20160213 復制
結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，據最新癌癥統計數據[1]顯示, 結直腸癌在全球發病率男性排名第3位，女性排名第2位，死亡率較高。在我國，隨著生活水平的提高，飲食結構的改變，人口老齡化等因素，每年新增病例約33.13萬人，死亡人數約15.93萬人[2]。目前治療主要是手術為主、放化療為輔的綜合治療。腫瘤的轉移復發是導致患者死亡的主要原因，那么對于腫瘤浸潤轉移的機理研究，尋找相應的癌基因，對研究結直腸癌發生發展的機理至關重要。腫瘤的生長發展均與腫瘤細胞周期及信號轉導有關，作為細胞周期依賴性激酶家族和轉化生長因子家族中的成員，細胞周期素依賴性激酶8（CDK8）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）分別與宮頸癌[3]、套細胞淋巴瘤[4]、胃癌[5]、膽囊癌[6]、乳腺癌[7-8]、肺癌[9]等腫瘤關系密切。本研究通過檢測結直腸癌組織中CDK8和TGF-β1的表達情況，旨在探討CDK8和TGF-β1與結直腸癌發生發展的關系，為結直腸癌發生發展機理的研究提供一定的信息。
1 資料和方法
1.1 標本來源
選取2014年9月至2015年5月期間于江蘇省興化市人民醫院收治的結直腸癌患者作為研究對象，采集其手術后的結直腸癌原發灶及距腫瘤5 cm以遠的癌旁組織有效標本40對，腫瘤標本和配對的癌旁組織標本均經組織學檢查明確診斷。手術切除的標本離體后即刻采集約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大組織塊放入液氮罐中，后轉移到-80℃冰箱中冷凍保存備檢，另外剩余部分標本置4%中性甲醛液固定備檢。同時收集患者的相關臨床資料。
1.2 主要儀器與試劑
熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；RT試劑盒及定量PCR試劑盒（Takara），CDK8及TGF-β1兔抗人單克隆抗體（美國Bioword公司），免疫組化試劑盒（武漢博士德公司）。
1.3 實時熒光定量PCR
1.3.1 引物設計與合成
根據GenBank提供的CDK8及TGF-β1 mRNA序列，利用Primer Premier 5.0設計引物，TGF-β1上游引物5'-GGCCAGATCCTGTCCA-AGC-3'，下游引物5'-GTGGGTTTCCACCATTAGC-AC-3'；CDK8上游引物5'-GGGATCTCTATGTCGG-CATGTAG-3'，下游引物5'-AAATGACGTTTGGAT-GCTAAGC-3'；GADPH上游引物5'-CCGGCCAAG-GAAAAACGAG-3'，下游引物5'-GAGGCCATTCTT-GTCGCTGA-3'；均由寶生物（大連）公司合成。
1.3.2 RNA抽提及逆轉錄反應
取上述低溫保存的組織標本，利用TRIZOL法進行總RNA提取，嚴格按照試劑盒說明書進行結直腸癌組織及癌旁組織的總RNA提取，紫外分光光度計定量并檢測其純度, 依據逆轉錄試劑盒說明合成cDNA。反應條件為：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃保存。
1.3.3 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR
依據SYBR Green試劑盒操作說明在ABI 7500定量PCR儀上進行熒光定量PCR。PCR反應條件：95℃、15 s；95℃、15 s；60℃、34 s，40個循環，4℃保存，每份標本進行3次熒光定量PCR檢測，取平均值。
1.3.4 CDK8及TGF-β1 mRNA表達的相對定量分析
按照文獻[10]的方法，采用相對定量法分析結直腸癌組織及其癌旁組織中mRNA表達水平。以GAPDH為內參照，利用Ct值即每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數，相對定量公式：2-ΔCt×100%，其中ΔCt=Ct（CDK8/TGF-β1）-Ct（GAPDH）。
1.4 免疫組織化學染色
采用免疫組織化學SV兩步法檢測結直腸癌組織及其癌旁組織中CDK8及TGF-β1蛋白的表達情況（參照試劑盒操作說明書）。實驗中一抗的濃度均為1:100。每次染色均設空白對照（采用PBS代替一抗），結直腸癌陽性片為陽性對照。
其結果判定標準：兩種蛋白的表達水平均采用統一的染色積分評價標準，每張切片在顯微鏡下隨機選取10個視野計數1 000個細胞中的陽性細胞所占百分比。細胞核或細胞漿內出現棕黃色顆粒者即為陽性。細胞內無染色或染色不清或呈均勻一致淡黃色，與背景一致計0分；有少量淡黃色顆粒，明顯高于背景染色計1分；可見較多深棕色顆粒計2分；如有大量深棕色或褐色顆粒計3分。陽性細胞百分率≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；> 50%為3分。根據染色強度和陽性細胞百分率綜合分析：0～1分為（-）；2～3分為（+）；4～5分為（++）；5～6分為（+++）。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17. 0統計軟件進行分析。計量數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 CDK8及TGF-β1 mRNA在癌組織及其癌旁組織中的表達檢測結果
結直腸癌組織中，CDK8 mRNA表達的相對含量明顯高于相對應的癌旁組織, 差異有統計學意義（P < 0.05）；結直腸癌組織中TGF-β1 mRNA相對含量也明顯高于相對應的癌旁組織，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。經Pearson相關分析實時熒光定量PCR結果，結直腸癌組織及相對應癌旁組織中CDK8 mRNA及TGF-β1 mRNA表達呈正相關關系（r=0.387，P=0.048）。
表1
結直腸癌組織及其癌旁組織中CDK8和TGF-β1 mRNA表達水平檢測結果
2.2 結直腸癌組織中CDK8及TGF-β1的mRNA表
達水平與其臨床病理參數的關系結果見表 2。由表 2可見，CDK8 mRNA表達水平與腫瘤有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度和腫瘤分期有關（P < 0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小和腫瘤分化程度無相關性(P > 0.05)。TGF-β1 mRNA表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移、腫瘤分期和浸潤程度有關（P < 0.05），而與患者年齡、性別和腫瘤分化程度則無相關性(P > 0.05)。
表2
結直腸癌組織中CDK8和TGF-β1 mRNA的表達水平與其臨床病理因素之間的關系
2.3 CDK8及TGF-β1蛋白在癌組織及其癌旁組織中的表達檢測結果
CDK8及TGF-β1蛋白在結直腸癌和癌旁組織中的表達見圖 1～圖 4。CDK8蛋白在結直腸癌和癌旁組織中的表達陽性率分別為72.5%（29/40）和32.5%（13/40），CDK8蛋白在癌組織中的表達陽性率明顯高于癌旁組織（P < 0.05）。TGF-β1蛋白在結直腸癌和癌旁組織的表達陽性率分別為77.5%（31/40）和22.5%（9/40），TGF-β1蛋白在癌組織的表達陽性率明顯高于癌旁組織（P < 0.05）。
圖1
示CDK8蛋白在結直腸癌組織中的表達（免疫組織化學SV×200）圖 2示TGF-β1蛋白在結直腸癌組織中的表達（免疫組織化學SV×200）圖 3示CDK8蛋白在癌旁組織中的表達（免疫組織化學SV×200）圖 4示TGF-β1蛋白在癌旁組織中的表達（免疫組織化學SV×200）
3 討論
CD K 8是細胞周期蛋白依賴性激酶復合物家族中的成員，定位于13q12.13，編碼含464個氨基酸殘基，與RNA聚合酶Ⅱ結合調節基因轉錄水平，被認為是結直腸癌的致癌基因[11-12]。Wnt/β-catenin信號通路的激活發生在絕大多數的結直腸癌中，被認為是結直腸癌發生的經典通路[13-15]；越來越多的證據證明CDK 8是該通路下游的關鍵分子，通過調節β-catenin轉錄活性，導致致癌基因的表達[16]。近年來國外有研究[17]發現，其在結直腸癌組織中表達明顯高于癌旁組織與正常組織，并且其高表達預示預后較差，與β-catenin關系密切，并被認為是致癌基因；Cai等[18]通過體內外實驗研究發現，下調CDK8的表達可抑制腫瘤細胞的侵襲和減少結直腸癌肝轉移的概率，而該過程是通過調節Wnt/β-catenin通路的下游基因表達。雖然許多腫瘤研究中認為CDK8是致癌基因，但也有學者[19]在子宮內膜癌中發現其為抑癌基因，這也表示其可能屬于環境依賴性基因。
本研究采用熒光定量PCR技術和免疫組化方法檢測結直腸癌及其癌旁組織中CDK8 mRNA及蛋白的表達情況，其結果顯示，在結直腸癌組織中CDK8 mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P < 0.05），這與國外學者[17]的研究是一致的；本研究結果還顯示，CDK8 mRNA表達量在進展期結直腸癌、腫瘤浸潤到漿膜外以及伴淋巴結轉移者明顯升高（P < 0.05）, 而與患者的年齡、性別和腫瘤分化程度無相關性。同時，CDK8蛋白在癌組織中的表達陽性率明顯高于癌旁組織(P < 0.05)。以上結果提示，CDK8不僅在結直腸癌組織中表達, 而且與結直腸癌的進展有關，CDK8在腫瘤的侵襲、浸潤和淋巴結轉移過程中可能起著重要的作用。
TGF-β1是轉化因子超家族中的一員，基因定位于染色體19q13, 由2條112個氨基酸的相同多肽鏈經二硫鍵相連的二聚體組成，其功能較為復雜，主要作用有炎癥細胞趨化，刺激細胞增殖、分化和遷移，影響血管形成, 控制細胞外基質合成與降解等[20]。近年來有研究[21-22]表明，TGF-β1水平的異常變化與腫瘤的發展和轉移密切相關。在結直腸癌細胞及組織中呈現高表達，并與預后相關[23-24]。Wang等[25]通過回顧性分析發現，TGF-β1基因啟動子-509C等位基因的改變是結直腸癌發生的一個可能的因素。有學者[26]發現，5-氨基水楊酸可抑制結直腸癌細胞中的TGF-β1的表達，并認為其可能成為結直腸癌治療的一個方向。
本研究通過PCR技術和免疫組化方法檢測結直腸癌及其癌旁組織中TGF-β1 mRNA及蛋白的表達，其結果顯示，在結直腸癌組織中TGF-β1 mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P < 0.05）；本研究結果還顯示，TGF-β1 mRNA表達量在進展期結直腸癌、腫瘤浸潤到漿膜外、伴淋巴結轉移、Ⅲ+Ⅳ期及腫瘤直徑> 5 cm的患者明顯升高（P < 0.05）, 而與患者的年齡、性別及中腫瘤分化程度無相關性；同時，TGF-β1蛋白在癌組織中的表達陽性率明顯高于癌旁組織(P < 0.05)。以上結果提示，TGF-β1與腫瘤的演進有關。
為了證實CDK8及TGF-β1在結直腸癌發展中的相互作用，通過相關性分析，發現CDK8及TGF-β1 mRNA在結直腸癌中的表達呈正相關關系（r=0.387，P=0.048），提示二者在結直腸癌的發生發展中具有協同作用。
綜上所述，CDK8及TGF-β1在結直腸癌組織中呈高表達，CDK8及TGF-β1 mRNA的表達水平升高，提示腫瘤侵襲力強，容易發生浸潤和轉移。聯合檢測結直腸癌組織中CDK8及TGF-β1的表達情況，有助于正確評估結直腸癌的惡性程度、發展和預后。
結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，據最新癌癥統計數據[1]顯示, 結直腸癌在全球發病率男性排名第3位，女性排名第2位，死亡率較高。在我國，隨著生活水平的提高，飲食結構的改變，人口老齡化等因素，每年新增病例約33.13萬人，死亡人數約15.93萬人[2]。目前治療主要是手術為主、放化療為輔的綜合治療。腫瘤的轉移復發是導致患者死亡的主要原因，那么對于腫瘤浸潤轉移的機理研究，尋找相應的癌基因，對研究結直腸癌發生發展的機理至關重要。腫瘤的生長發展均與腫瘤細胞周期及信號轉導有關，作為細胞周期依賴性激酶家族和轉化生長因子家族中的成員，細胞周期素依賴性激酶8（CDK8）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）分別與宮頸癌[3]、套細胞淋巴瘤[4]、胃癌[5]、膽囊癌[6]、乳腺癌[7-8]、肺癌[9]等腫瘤關系密切。本研究通過檢測結直腸癌組織中CDK8和TGF-β1的表達情況，旨在探討CDK8和TGF-β1與結直腸癌發生發展的關系，為結直腸癌發生發展機理的研究提供一定的信息。
1 資料和方法
1.1 標本來源
選取2014年9月至2015年5月期間于江蘇省興化市人民醫院收治的結直腸癌患者作為研究對象，采集其手術后的結直腸癌原發灶及距腫瘤5 cm以遠的癌旁組織有效標本40對，腫瘤標本和配對的癌旁組織標本均經組織學檢查明確診斷。手術切除的標本離體后即刻采集約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大組織塊放入液氮罐中，后轉移到-80℃冰箱中冷凍保存備檢，另外剩余部分標本置4%中性甲醛液固定備檢。同時收集患者的相關臨床資料。
1.2 主要儀器與試劑
熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；RT試劑盒及定量PCR試劑盒（Takara），CDK8及TGF-β1兔抗人單克隆抗體（美國Bioword公司），免疫組化試劑盒（武漢博士德公司）。
1.3 實時熒光定量PCR
1.3.1 引物設計與合成
根據GenBank提供的CDK8及TGF-β1 mRNA序列，利用Primer Premier 5.0設計引物，TGF-β1上游引物5'-GGCCAGATCCTGTCCA-AGC-3'，下游引物5'-GTGGGTTTCCACCATTAGC-AC-3'；CDK8上游引物5'-GGGATCTCTATGTCGG-CATGTAG-3'，下游引物5'-AAATGACGTTTGGAT-GCTAAGC-3'；GADPH上游引物5'-CCGGCCAAG-GAAAAACGAG-3'，下游引物5'-GAGGCCATTCTT-GTCGCTGA-3'；均由寶生物（大連）公司合成。
1.3.2 RNA抽提及逆轉錄反應
取上述低溫保存的組織標本，利用TRIZOL法進行總RNA提取，嚴格按照試劑盒說明書進行結直腸癌組織及癌旁組織的總RNA提取，紫外分光光度計定量并檢測其純度, 依據逆轉錄試劑盒說明合成cDNA。反應條件為：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃保存。
1.3.3 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR
依據SYBR Green試劑盒操作說明在ABI 7500定量PCR儀上進行熒光定量PCR。PCR反應條件：95℃、15 s；95℃、15 s；60℃、34 s，40個循環，4℃保存，每份標本進行3次熒光定量PCR檢測，取平均值。
1.3.4 CDK8及TGF-β1 mRNA表達的相對定量分析
按照文獻[10]的方法，采用相對定量法分析結直腸癌組織及其癌旁組織中mRNA表達水平。以GAPDH為內參照，利用Ct值即每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數，相對定量公式：2-ΔCt×100%，其中ΔCt=Ct（CDK8/TGF-β1）-Ct（GAPDH）。
1.4 免疫組織化學染色
采用免疫組織化學SV兩步法檢測結直腸癌組織及其癌旁組織中CDK8及TGF-β1蛋白的表達情況（參照試劑盒操作說明書）。實驗中一抗的濃度均為1:100。每次染色均設空白對照（采用PBS代替一抗），結直腸癌陽性片為陽性對照。
其結果判定標準：兩種蛋白的表達水平均采用統一的染色積分評價標準，每張切片在顯微鏡下隨機選取10個視野計數1 000個細胞中的陽性細胞所占百分比。細胞核或細胞漿內出現棕黃色顆粒者即為陽性。細胞內無染色或染色不清或呈均勻一致淡黃色，與背景一致計0分；有少量淡黃色顆粒，明顯高于背景染色計1分；可見較多深棕色顆粒計2分；如有大量深棕色或褐色顆粒計3分。陽性細胞百分率≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；> 50%為3分。根據染色強度和陽性細胞百分率綜合分析：0～1分為（-）；2～3分為（+）；4～5分為（++）；5～6分為（+++）。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17. 0統計軟件進行分析。計量數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 CDK8及TGF-β1 mRNA在癌組織及其癌旁組織中的表達檢測結果
結直腸癌組織中，CDK8 mRNA表達的相對含量明顯高于相對應的癌旁組織, 差異有統計學意義（P < 0.05）；結直腸癌組織中TGF-β1 mRNA相對含量也明顯高于相對應的癌旁組織，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。經Pearson相關分析實時熒光定量PCR結果，結直腸癌組織及相對應癌旁組織中CDK8 mRNA及TGF-β1 mRNA表達呈正相關關系（r=0.387，P=0.048）。
表1
結直腸癌組織及其癌旁組織中CDK8和TGF-β1 mRNA表達水平檢測結果
2.2 結直腸癌組織中CDK8及TGF-β1的mRNA表
達水平與其臨床病理參數的關系結果見表 2。由表 2可見，CDK8 mRNA表達水平與腫瘤有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度和腫瘤分期有關（P < 0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小和腫瘤分化程度無相關性(P > 0.05)。TGF-β1 mRNA表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移、腫瘤分期和浸潤程度有關（P < 0.05），而與患者年齡、性別和腫瘤分化程度則無相關性(P > 0.05)。
表2
結直腸癌組織中CDK8和TGF-β1 mRNA的表達水平與其臨床病理因素之間的關系
2.3 CDK8及TGF-β1蛋白在癌組織及其癌旁組織中的表達檢測結果
CDK8及TGF-β1蛋白在結直腸癌和癌旁組織中的表達見圖 1～圖 4。CDK8蛋白在結直腸癌和癌旁組織中的表達陽性率分別為72.5%（29/40）和32.5%（13/40），CDK8蛋白在癌組織中的表達陽性率明顯高于癌旁組織（P < 0.05）。TGF-β1蛋白在結直腸癌和癌旁組織的表達陽性率分別為77.5%（31/40）和22.5%（9/40），TGF-β1蛋白在癌組織的表達陽性率明顯高于癌旁組織（P < 0.05）。
圖1
示CDK8蛋白在結直腸癌組織中的表達（免疫組織化學SV×200）圖 2示TGF-β1蛋白在結直腸癌組織中的表達（免疫組織化學SV×200）圖 3示CDK8蛋白在癌旁組織中的表達（免疫組織化學SV×200）圖 4示TGF-β1蛋白在癌旁組織中的表達（免疫組織化學SV×200）
3 討論
CD K 8是細胞周期蛋白依賴性激酶復合物家族中的成員，定位于13q12.13，編碼含464個氨基酸殘基，與RNA聚合酶Ⅱ結合調節基因轉錄水平，被認為是結直腸癌的致癌基因[11-12]。Wnt/β-catenin信號通路的激活發生在絕大多數的結直腸癌中，被認為是結直腸癌發生的經典通路[13-15]；越來越多的證據證明CDK 8是該通路下游的關鍵分子，通過調節β-catenin轉錄活性，導致致癌基因的表達[16]。近年來國外有研究[17]發現，其在結直腸癌組織中表達明顯高于癌旁組織與正常組織，并且其高表達預示預后較差，與β-catenin關系密切，并被認為是致癌基因；Cai等[18]通過體內外實驗研究發現，下調CDK8的表達可抑制腫瘤細胞的侵襲和減少結直腸癌肝轉移的概率，而該過程是通過調節Wnt/β-catenin通路的下游基因表達。雖然許多腫瘤研究中認為CDK8是致癌基因，但也有學者[19]在子宮內膜癌中發現其為抑癌基因，這也表示其可能屬于環境依賴性基因。
本研究采用熒光定量PCR技術和免疫組化方法檢測結直腸癌及其癌旁組織中CDK8 mRNA及蛋白的表達情況，其結果顯示，在結直腸癌組織中CDK8 mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P < 0.05），這與國外學者[17]的研究是一致的；本研究結果還顯示，CDK8 mRNA表達量在進展期結直腸癌、腫瘤浸潤到漿膜外以及伴淋巴結轉移者明顯升高（P < 0.05）, 而與患者的年齡、性別和腫瘤分化程度無相關性。同時，CDK8蛋白在癌組織中的表達陽性率明顯高于癌旁組織(P < 0.05)。以上結果提示，CDK8不僅在結直腸癌組織中表達, 而且與結直腸癌的進展有關，CDK8在腫瘤的侵襲、浸潤和淋巴結轉移過程中可能起著重要的作用。
TGF-β1是轉化因子超家族中的一員，基因定位于染色體19q13, 由2條112個氨基酸的相同多肽鏈經二硫鍵相連的二聚體組成，其功能較為復雜，主要作用有炎癥細胞趨化，刺激細胞增殖、分化和遷移，影響血管形成, 控制細胞外基質合成與降解等[20]。近年來有研究[21-22]表明，TGF-β1水平的異常變化與腫瘤的發展和轉移密切相關。在結直腸癌細胞及組織中呈現高表達，并與預后相關[23-24]。Wang等[25]通過回顧性分析發現，TGF-β1基因啟動子-509C等位基因的改變是結直腸癌發生的一個可能的因素。有學者[26]發現，5-氨基水楊酸可抑制結直腸癌細胞中的TGF-β1的表達，并認為其可能成為結直腸癌治療的一個方向。
本研究通過PCR技術和免疫組化方法檢測結直腸癌及其癌旁組織中TGF-β1 mRNA及蛋白的表達，其結果顯示，在結直腸癌組織中TGF-β1 mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P < 0.05）；本研究結果還顯示，TGF-β1 mRNA表達量在進展期結直腸癌、腫瘤浸潤到漿膜外、伴淋巴結轉移、Ⅲ+Ⅳ期及腫瘤直徑> 5 cm的患者明顯升高（P < 0.05）, 而與患者的年齡、性別及中腫瘤分化程度無相關性；同時，TGF-β1蛋白在癌組織中的表達陽性率明顯高于癌旁組織(P < 0.05)。以上結果提示，TGF-β1與腫瘤的演進有關。
為了證實CDK8及TGF-β1在結直腸癌發展中的相互作用，通過相關性分析，發現CDK8及TGF-β1 mRNA在結直腸癌中的表達呈正相關關系（r=0.387，P=0.048），提示二者在結直腸癌的發生發展中具有協同作用。
綜上所述，CDK8及TGF-β1在結直腸癌組織中呈高表達，CDK8及TGF-β1 mRNA的表達水平升高，提示腫瘤侵襲力強，容易發生浸潤和轉移。聯合檢測結直腸癌組織中CDK8及TGF-β1的表達情況，有助于正確評估結直腸癌的惡性程度、發展和預后。
