引用本文： 梁小芹, 蘇勤軍. CCR7 和VEGF-D 蛋白在乳腺癌發生發展過程中的表達及意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(6): 715-721. doi: 10.7507/1007-9424.20160190 復制
趨化因子受體是一類能夠特異性結合趨化因子的G蛋白偶聯受體，其中趨化因子受體7（CCR chemokine receptor-7，CCR7）蛋白在多種腫瘤發生過程中有重要作用，并可促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移 [1-7] 。血管內皮生長因子D（vascular endo thelial growth factor-D，VEGF-D）蛋白是目前已確認的淋巴管生長因子，在許多腫瘤細胞中VEGF-D蛋白呈高表達，其可誘導腫瘤內或腫瘤周邊淋巴管生成和擴張，與腫瘤的淋巴管轉移密切相關 [8-10] 。本研究旨在探討乳腺正常組織、乳腺導管非典型增生組織及乳腺癌組織中CCR7和VEGF-D蛋白的表達情況，進一步明確這兩種蛋白在乳腺癌發生發展過程中的意義。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集蘭州軍區蘭州總醫院2005年2月至2013年10月期間經病理學檢查證實的乳腺浸潤性導管癌標本73例（乳腺癌組）、乳腺導管非典型增生及導管原位癌標本40例（乳腺輕中度導管非典型增生組20例，乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組20例，乳腺重度導管非典型增生與導管原位癌的界限較難界定，兩種病變的肌上皮都是完整的，故將兩者歸為一類），以距乳腺癌組織切緣5 cm以遠的正常乳腺組織20例作為對照（正常乳腺組織組，病例來源于乳腺癌組）。患者均為女性，術前均未接受化療和放療，且所有病例均經病理學檢查確診，并根據2012年 《WHO乳腺腫瘤分類標準》 [11] 進行分類。乳腺癌組患者均為浸潤性導管癌，年齡22～82歲，中位年齡為52歲，其中>45歲者47例，≤45歲者26例；腫瘤直徑≤3 cm者36例，>3 cm者37例；臨床分期采用1988年國際抗癌聯盟（UICC） 提出的TNM分期法 [12] ：Ⅰ期8例，Ⅱ期22例，Ⅲ期31例，Ⅳ期12例；組織學分級：Ⅰ級20例，Ⅱ級30例，Ⅲ級23例；淋巴結轉移43例，無淋巴結轉移30例；雌激素受體（ER）陽性46例，陰性27例；孕激素受體（PR）陽性43例，陰性30例；人類表皮生長因子受體2（HER-2）陽性33例，陰性40例。40例乳腺導管非典型增生及導管原位癌患者年齡為35～58歲，中位年齡為45歲。
1.2 主要試劑與設備
CCR7和VEGF-D鼠抗人抗體均為武漢博士德生物公司產品，D2-40購自福建邁新生物技術有限公司，二抗由Roche公司提供。羅氏全自動多功能病理組織檢測系統為羅氏公司產品（瑞士），主要設備為BX51正置顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.3 免疫組化染色
將石蠟包埋的組織制成4 μm厚的切片，使用瑞士羅氏全自動多功能病理組織檢測系統進行免疫組化染色，具體步驟如下。①75 ℃烤片4 min，采用專用EZprep將石蠟切片脫蠟。加入修復液CC1 100 μL （堿性），再將獨立溫控的切片加熱板升溫到100 ℃以進行高溫修復30 min；加入IU INHIBITOR 100 μL，37 ℃孵育4 min；以加樣器加入100 μL一抗，切片加熱升溫到設定的溫度（95 ℃），孵育16 min；以加樣器加入100 μL HRP UNIVMULT，37 ℃孵育8 min；以加樣器同時加入100 μL UV DAB及100 μL UV DABH 2 O 2 ，37 ℃孵育8 min；以加樣器加入100 μL UV COPPER，37 ℃孵育4 min；以加樣器加入100 μL 蘇木精HEMATOXYLIN Ⅱ進行復染，孵育4 min；以加樣器加入100 μL反藍BLUING REAGENT試劑，孵育4 min。②取出切片，用含溫和清潔劑的清水涮洗切片。③梯度乙醇脫水。④應用二甲苯對切片透明、封片。以PBS液代替一抗作為陰性對照，以人結腸癌組織標本作為陽性對照。
1.4 免疫組化結果判斷
①CCR7蛋白主要定位于細胞質和（或） 細胞核中，以細胞質和（或）細胞核內出現淺黃色至棕褐色顆粒者判斷為陽性 [13] ；VEGF-D蛋白主要分布于細胞質中，以細胞質內出現淺黃色至棕褐色顆粒者判斷為陽性 [14] 。參考Shimizu等 [15] 的方法采用雙評分半定量法進行評分，高倍鏡下（400倍）根據染色強度和陽性細胞所占百分比判定免疫組化結果。染色強度評分標準：不著色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。陽性細胞所占比例評定標準：無腫瘤細胞著色，0分；<1/3的腫瘤細胞著色，1分； 1/3～2/3的腫瘤細胞著色，2分；>2/3的腫瘤細胞著色，3分。兩種評分之和為最終評分，0～2分為陰性，其余為陽性（3分為弱陽性，4分為中度陽性，5～6分為強陽性）。②微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）的判定參考Weidner [16] 的方法：根據D2-40染色結果，以陽性著色的單個內皮細胞或內皮細胞簇計為1個陽性微淋巴管。先在低倍鏡下（40倍）確定5個著色密集的區域（即“hot spot”），再在200倍放大倍數下分別計數5個視野的陽性微淋巴管數，取其均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料的統計分析方法采用Student’s t檢驗和單因素方差分析（兩兩比較采用LSD法），計數資料的統計分析方法采用χ 2 檢驗和趨勢χ 2 檢驗（分析率隨分層變化的趨勢），相關性分析采用非參數Spearman秩相關和χ 2 檢驗（計算Pearson列聯系數）。檢驗水準α=0.050。
2 結果
2.1 CCR7蛋白及VEGF-D蛋白的免疫組化染色結果
①免疫組化染色結果顯示：CCR7蛋白的陽性顆粒呈棕黃色，以細胞質和（或）細胞核內著色為主。CCR7蛋白在正常乳腺組織中的表達較低或無表達（表 1、圖 1A）；乳腺輕中度導管非典型增生組中有 1例呈弱陽性表達（圖 1B）；乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組中有6例呈陽性表達，其中4例呈弱陽性，1例呈中度陽性，1例呈強陽性（圖 1C）；乳腺癌組中有35例呈陽性表達，其中7例呈弱陽性，12例呈中度陽性，16例呈強陽性（圖 1D）。②免疫組 化染色結果顯示：VEGF-D蛋白的陽性顆粒呈棕黃色，著色顆粒位于細胞質內。正常乳腺組織組中1例 VEGF-D蛋白呈弱陽性表達（圖 2A）；乳腺輕中度導管非典型增生組中有4例呈陽性表達，其中3例呈弱陽性，1例呈中度陽性（圖 2B）；乳腺重度導管非典型增生及導管原位癌組中有8例呈陽性表達，其中5例呈弱陽性，1例呈中度陽性，2例呈強陽性（圖 2C）；乳腺癌組有42例呈陽性表達，其中10例呈弱陽性，14例呈中度陽性，18例呈強陽性（圖 2D）。CCR7蛋白和VEGF-D蛋白在正常乳腺組織、乳腺輕中度導管非典型增生組織、乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組織及乳腺癌組織中的表達逐漸增強。正常乳腺組織組、乳腺輕中度導管非典型增生組、乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組及乳腺癌組中CCR7蛋白（χ 趨勢2 =23.905，P<0.050）和VEGF-D蛋白（χ 趨勢2 =22.349，P<0.050）的表達陽性率逐漸增高（表 1）。
圖1
圖1 示CCR7蛋白在4種乳腺組織中的表達。1A：在正常乳腺組織中無表達（SP ×400）；1B：在乳腺輕中度導管非典型增生組織中呈弱陽性表達（SP ×200）；1C：在乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組織中呈強陽性表達（SP ×200）；1D：在乳腺浸潤性導管癌組織中呈強陽性表達（SP ×400） 圖2 示CCR7蛋白在4種乳腺組織中的表達。2A：在正常乳腺組織中呈弱陽性表達（SP ×400）； 2B：在乳腺輕中度導管非典型增生組織中呈中度陽性表達（SP ×200）；2C：在乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組織中呈強陽性表達（SP ×400）；2D：在乳腺浸潤性導管癌組織中呈強陽性表達（SP ×400） 圖3 示4種乳腺組織中D2-40染色的免疫組化結果（SP ×200）。 3A：正常乳腺組織；3B：乳腺輕中度導管非典型增生組織；3C：乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組織；3D：乳腺癌組織；3E：乳腺癌組織中，淋巴管內可見癌栓
表1
4組乳腺組織中 CCR7 蛋白及 VEGF-D蛋白的表達〔 例（%）〕
2.2 D2-40的表達及LMVD結果
免疫組化染色結果顯示：D2-40陽性表達為淋巴管內皮細胞胞膜和細胞漿呈棕黃色。正常乳腺組織、輕中度導管非典型增生和重度導管非典型增生+導管原位癌組織中，D2-40染色的淋巴管多位于乳腺小葉周邊（圖 3A～3C），淋巴管形態不規則，管壁薄，管壁無平滑肌，管腔內偶見淋巴細胞，部分管腔擴張，部分呈條索狀，部分為幾個內皮細胞構成的細胞簇，甚至單個內皮細胞；乳腺癌組織中D2-40染色的淋巴管多位于癌周組織，部分管腔呈擴張狀態（圖 3D），部分淋巴管腔內可見癌栓（圖 3E）。正常乳腺組織組、乳腺輕中度導管非典型增生組、乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組及乳腺癌組的LMVD值分別為2.00±1.02、6.70±3.48、9.01±2.13及16.32±4.07，LMVD值逐漸增高，4組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.050）。此外，在乳腺癌患者中，淋巴結轉移組的LMVD值為21.37±3.95，高于無淋巴結轉移組的11.96±2.31 （P<0.050）。
2.3 乳腺癌組織中CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表達與其臨床病理學特征的關系
在乳腺癌患者中，CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表達均與臨床分期、組織學分級、淋巴結轉移及HER-2表達有關（P<0.050），而均與患者的年齡、腫瘤直徑、ER表達和PR表達狀況無關（P>0.050）。組織學分級越高、臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期（與Ⅰ+Ⅱ期者相比）、淋巴結轉移（與未發生淋巴結轉移者相比）及HER-2表達陽性（與HER-2表達陰性者相比）者CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表達陽性率較高（P<0.050），見表 2。
表2
乳腺癌組織中CCR7 蛋白和VEGF-D 蛋白表達與臨床病理特征的關系〔例（%）〕
2.4 乳腺癌組織中CCR7蛋白和VEGF蛋白表達與LMVD值間的關系
淋巴管與乳腺癌的淋巴轉移密切相關。在乳腺癌組織中，淋巴管增多者轉移的概率增高，其與預后有關；而在其余3類組織中，淋巴管密度增加無重要臨床意義，故筆者只探討了該兩種蛋白與LMVD值在乳腺癌組織中的關系。結果顯示，在乳腺癌患者中，CCR7陰性組的LMVD值為10.31±1.74，CCR7陽性組為12.81±3.98，2組比較差異無統計學意義（P> 0.050）；VEGF-D陰性組的LMVD值為13.32±2.14，VEGF-D陽性組為20.13±4.89，VEGF-D陽性組的LMVD值較高，2組比較差異有統計學意義（P<0.010）。 相關性分析結果顯示，LMVD值和VEGF-D蛋白表達強度之間呈正相關性（r=0.623，P<0.010），而LMVD值與CCR7蛋白表達強度之間的相關性無統計學意義（r=-0.303，P>0.050）。
2.5 乳腺癌組織中CCR7蛋白表達與VEGF-D蛋白表達的相關性
由于正常乳腺組織組、乳腺輕中度導管非典型增生組及乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組中CCR7蛋白與VEGF-D蛋白表達陽性例數太少，故僅分析了乳腺癌組織中兩種蛋白表達的相關性。列聯表相關分析結果顯示：在乳腺癌組織中，CCR7蛋白表達與VEGF-D蛋白表達間呈弱相關性（r=0.112，P<0.050），見表 3。
表3
乳腺癌組織中CCR7 蛋白表達與VEGF-D 蛋白表達的相關性
3 討論
趨化因子受體通常表達于免疫細胞和內皮細胞的細胞膜上，與相應的趨化因子結合而發揮作用，其與細胞骨架重排、內皮細胞黏附和細胞定向游動均有關。研究 [17-18] 表明，趨化因子及其受體在腫瘤細胞生長、轉移及宿主對腫瘤細胞的免疫方面均發揮極其重要的作用。CCR7蛋白是CCR亞家族中的一個亞類，現已證實它與多種腫瘤的發生有關，且與腫瘤的侵襲及轉移均相關 [13, 19-21] 。Müller等 [7] 對12例乳腺癌患者進行了CCR7 mRNA水平檢測，并與正常乳腺組織進行比較后發現，乳腺癌組織中其表達量明顯增高。朱旬等 [22] 研究發現，乳腺癌組織中CCR7 蛋白的陽性表達率明顯高于乳腺纖維腺瘤組織，且其陽性表達與淋巴結轉移和臨床分期均有關。本組資料結果顯示，正常乳腺組織組、乳腺輕中度導管非典型增生組、乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組、乳腺癌組中CCR7蛋白的表達陽性率逐漸增高。這提示CCR7蛋白可能在乳腺腫瘤的早期惡性轉化方面發揮一定的作用。另外筆者分析了CCR7蛋白表達與乳腺癌不同臨床病理特征的關系，結果發現，CCR7蛋白的表達與組織學分級、臨床分期、淋巴結轉移及HER-2表達均相關。
VEGF-D蛋白是目前已確定的VEGF家族中的淋巴內皮細胞生長因子。研究 [23-24] 表明，VEGF-D蛋白與腫瘤的發生及轉移均有關。Thelen等 [25] 在其建立的鼠肝癌模型的研究中發現，VEGF-D蛋白在肝癌組織中的陽性表達率明顯高于正常肝組織，且其表達與淋巴結轉移有關。Onogawa等 [26] 的研究結果也表明，在結腸癌組織中VEGF-D蛋白的陽性表達率較正常結腸組織升高，并且其表達與淋巴結轉移和患者的預后均密切相關。Stacker等 [27] 研究發現，VEGF-D蛋白不但可誘導腫瘤組織內的淋巴管生成，還可加快腫瘤細胞向區域淋巴結擴散。本組資料結果表明，正常乳腺組織組、 乳腺輕中度導管非典型增生組、 乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組及乳腺癌組中VEGF-D蛋白的表達陽性率逐漸增高，其在正常乳腺組織組中的表達陽性率為5.0%，在乳腺輕中度導管非典型增生組的表達陽性率為20.0%，在乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組的表達陽性率為40.0%，而在乳腺癌組中的表達陽性率高達57.5%；此外，淋巴結轉移組中VEGF-D蛋白的表達陽性率高于無淋巴結轉移組（表 2）。提示隨著乳腺病變的演進，VEGF-D蛋白的表達有升高的趨勢，進一步表明VEGF-D蛋白在乳腺癌的發生、發展及轉移過程中可能起著相當重要的作用。
乳腺癌的轉移主要以淋巴管轉移為主，關于淋巴管生成的研究 [28] 表明，VEGF-D蛋白可與淋巴管內皮細胞上的血管內皮生長因子受體3（VEGFR-3）結合，使VEGFR-3迅速活化，并引起下游分子She和Grb2磷酸化，通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路促使淋巴管內皮細胞增生、遷移和存活，從而形成新生的毛細淋巴管。Veikkola等 [29] 證明，VEGF-D蛋白在體內通過旁分泌途徑（VEGFR-3信號轉導通路）選擇性誘導淋巴管生成。本組資料結果顯示，VEGF-D蛋白在乳腺癌組織中呈高表達，而且VEGF-D蛋白的表達與LMVD值呈正相關，提示VEGF-D蛋白參與了乳腺癌淋巴管的生成及淋巴結轉移。
為進一步探討兩種蛋白表達與乳腺惡性潛能的關系，筆者分析了兩種蛋白表達與乳腺癌臨床病理學特征的關系，結果發現，這兩種蛋白的表達均與臨床分期、組織學分級及淋巴結轉移相關，且組織學分級越高、臨床分期越晚（Ⅲ+Ⅳ期）、有淋巴結轉移者CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表達陽性率均較高。此外，CCR7蛋白與VEGF-D蛋白的表達呈弱正相關，提示CCR7蛋白與VEGF-D蛋白在乳腺癌的癌變過程中可能有協同作用。CCR7蛋白也可能間接地參與腫瘤淋巴管的生長，其可能的機理是，腫瘤細胞中CCR7蛋白與相應的趨化因子即基質細胞衍生因子（CCL21）結合激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）通路，繼而激活蛋白激酶B（AKT）通路，使得腫瘤細胞內VEGF-D蛋白表達上調，VEGF-D蛋白與血管內皮生長因子受體（VEGFR）結合，促進新的內皮細胞分化、增生，形成新的腫瘤淋巴管，加速脈管轉移；另外腫瘤細胞內VEGF-D蛋白的高表達增加了腫瘤內部及腫瘤邊緣淋巴管的表面積，在乳腺癌細胞分泌的CCR7蛋白的作用下，促使乳腺癌細胞發生游走及定向轉移。因此VEGF-D蛋白和CCR7蛋白的過表達，在乳腺癌的發生發展及淋巴結轉移中發揮協同促進作用。
綜上所述，從正常乳腺組織、乳腺導管非典型增生組織到乳腺癌的發展過程中，CCR7蛋白與VEGF-D蛋白的表達均升高，兩者表達在乳腺癌組織中呈正相關，并且其陽性表達多見于組織學分級差、臨床分期晚和淋巴結轉移的乳腺癌患者。由此筆者認為，在乳腺癌的發生發展及轉移過程中，CCR7蛋白與VEGF-D蛋白起著非常重要的作用，其可作為判斷乳腺癌惡性生物學行為的重要指標，將其作為切入點來設計藥物將為乳腺癌的治療提供新的靶點。
趨化因子受體是一類能夠特異性結合趨化因子的G蛋白偶聯受體，其中趨化因子受體7（CCR chemokine receptor-7，CCR7）蛋白在多種腫瘤發生過程中有重要作用，并可促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移 [1-7] 。血管內皮生長因子D（vascular endo thelial growth factor-D，VEGF-D）蛋白是目前已確認的淋巴管生長因子，在許多腫瘤細胞中VEGF-D蛋白呈高表達，其可誘導腫瘤內或腫瘤周邊淋巴管生成和擴張，與腫瘤的淋巴管轉移密切相關 [8-10] 。本研究旨在探討乳腺正常組織、乳腺導管非典型增生組織及乳腺癌組織中CCR7和VEGF-D蛋白的表達情況，進一步明確這兩種蛋白在乳腺癌發生發展過程中的意義。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集蘭州軍區蘭州總醫院2005年2月至2013年10月期間經病理學檢查證實的乳腺浸潤性導管癌標本73例（乳腺癌組）、乳腺導管非典型增生及導管原位癌標本40例（乳腺輕中度導管非典型增生組20例，乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組20例，乳腺重度導管非典型增生與導管原位癌的界限較難界定，兩種病變的肌上皮都是完整的，故將兩者歸為一類），以距乳腺癌組織切緣5 cm以遠的正常乳腺組織20例作為對照（正常乳腺組織組，病例來源于乳腺癌組）。患者均為女性，術前均未接受化療和放療，且所有病例均經病理學檢查確診，并根據2012年 《WHO乳腺腫瘤分類標準》 [11] 進行分類。乳腺癌組患者均為浸潤性導管癌，年齡22～82歲，中位年齡為52歲，其中>45歲者47例，≤45歲者26例；腫瘤直徑≤3 cm者36例，>3 cm者37例；臨床分期采用1988年國際抗癌聯盟（UICC） 提出的TNM分期法 [12] ：Ⅰ期8例，Ⅱ期22例，Ⅲ期31例，Ⅳ期12例；組織學分級：Ⅰ級20例，Ⅱ級30例，Ⅲ級23例；淋巴結轉移43例，無淋巴結轉移30例；雌激素受體（ER）陽性46例，陰性27例；孕激素受體（PR）陽性43例，陰性30例；人類表皮生長因子受體2（HER-2）陽性33例，陰性40例。40例乳腺導管非典型增生及導管原位癌患者年齡為35～58歲，中位年齡為45歲。
1.2 主要試劑與設備
CCR7和VEGF-D鼠抗人抗體均為武漢博士德生物公司產品，D2-40購自福建邁新生物技術有限公司，二抗由Roche公司提供。羅氏全自動多功能病理組織檢測系統為羅氏公司產品（瑞士），主要設備為BX51正置顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.3 免疫組化染色
將石蠟包埋的組織制成4 μm厚的切片，使用瑞士羅氏全自動多功能病理組織檢測系統進行免疫組化染色，具體步驟如下。①75 ℃烤片4 min，采用專用EZprep將石蠟切片脫蠟。加入修復液CC1 100 μL （堿性），再將獨立溫控的切片加熱板升溫到100 ℃以進行高溫修復30 min；加入IU INHIBITOR 100 μL，37 ℃孵育4 min；以加樣器加入100 μL一抗，切片加熱升溫到設定的溫度（95 ℃），孵育16 min；以加樣器加入100 μL HRP UNIVMULT，37 ℃孵育8 min；以加樣器同時加入100 μL UV DAB及100 μL UV DABH 2 O 2 ，37 ℃孵育8 min；以加樣器加入100 μL UV COPPER，37 ℃孵育4 min；以加樣器加入100 μL 蘇木精HEMATOXYLIN Ⅱ進行復染，孵育4 min；以加樣器加入100 μL反藍BLUING REAGENT試劑，孵育4 min。②取出切片，用含溫和清潔劑的清水涮洗切片。③梯度乙醇脫水。④應用二甲苯對切片透明、封片。以PBS液代替一抗作為陰性對照，以人結腸癌組織標本作為陽性對照。
1.4 免疫組化結果判斷
①CCR7蛋白主要定位于細胞質和（或） 細胞核中，以細胞質和（或）細胞核內出現淺黃色至棕褐色顆粒者判斷為陽性 [13] ；VEGF-D蛋白主要分布于細胞質中，以細胞質內出現淺黃色至棕褐色顆粒者判斷為陽性 [14] 。參考Shimizu等 [15] 的方法采用雙評分半定量法進行評分，高倍鏡下（400倍）根據染色強度和陽性細胞所占百分比判定免疫組化結果。染色強度評分標準：不著色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。陽性細胞所占比例評定標準：無腫瘤細胞著色，0分；<1/3的腫瘤細胞著色，1分； 1/3～2/3的腫瘤細胞著色，2分；>2/3的腫瘤細胞著色，3分。兩種評分之和為最終評分，0～2分為陰性，其余為陽性（3分為弱陽性，4分為中度陽性，5～6分為強陽性）。②微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）的判定參考Weidner [16] 的方法：根據D2-40染色結果，以陽性著色的單個內皮細胞或內皮細胞簇計為1個陽性微淋巴管。先在低倍鏡下（40倍）確定5個著色密集的區域（即“hot spot”），再在200倍放大倍數下分別計數5個視野的陽性微淋巴管數，取其均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料的統計分析方法采用Student’s t檢驗和單因素方差分析（兩兩比較采用LSD法），計數資料的統計分析方法采用χ 2 檢驗和趨勢χ 2 檢驗（分析率隨分層變化的趨勢），相關性分析采用非參數Spearman秩相關和χ 2 檢驗（計算Pearson列聯系數）。檢驗水準α=0.050。
2 結果
2.1 CCR7蛋白及VEGF-D蛋白的免疫組化染色結果
①免疫組化染色結果顯示：CCR7蛋白的陽性顆粒呈棕黃色，以細胞質和（或）細胞核內著色為主。CCR7蛋白在正常乳腺組織中的表達較低或無表達（表 1、圖 1A）；乳腺輕中度導管非典型增生組中有 1例呈弱陽性表達（圖 1B）；乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組中有6例呈陽性表達，其中4例呈弱陽性，1例呈中度陽性，1例呈強陽性（圖 1C）；乳腺癌組中有35例呈陽性表達，其中7例呈弱陽性，12例呈中度陽性，16例呈強陽性（圖 1D）。②免疫組 化染色結果顯示：VEGF-D蛋白的陽性顆粒呈棕黃色，著色顆粒位于細胞質內。正常乳腺組織組中1例 VEGF-D蛋白呈弱陽性表達（圖 2A）；乳腺輕中度導管非典型增生組中有4例呈陽性表達，其中3例呈弱陽性，1例呈中度陽性（圖 2B）；乳腺重度導管非典型增生及導管原位癌組中有8例呈陽性表達，其中5例呈弱陽性，1例呈中度陽性，2例呈強陽性（圖 2C）；乳腺癌組有42例呈陽性表達，其中10例呈弱陽性，14例呈中度陽性，18例呈強陽性（圖 2D）。CCR7蛋白和VEGF-D蛋白在正常乳腺組織、乳腺輕中度導管非典型增生組織、乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組織及乳腺癌組織中的表達逐漸增強。正常乳腺組織組、乳腺輕中度導管非典型增生組、乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組及乳腺癌組中CCR7蛋白（χ 趨勢2 =23.905，P<0.050）和VEGF-D蛋白（χ 趨勢2 =22.349，P<0.050）的表達陽性率逐漸增高（表 1）。
圖1
圖1 示CCR7蛋白在4種乳腺組織中的表達。1A：在正常乳腺組織中無表達（SP ×400）；1B：在乳腺輕中度導管非典型增生組織中呈弱陽性表達（SP ×200）；1C：在乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組織中呈強陽性表達（SP ×200）；1D：在乳腺浸潤性導管癌組織中呈強陽性表達（SP ×400） 圖2 示CCR7蛋白在4種乳腺組織中的表達。2A：在正常乳腺組織中呈弱陽性表達（SP ×400）； 2B：在乳腺輕中度導管非典型增生組織中呈中度陽性表達（SP ×200）；2C：在乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組織中呈強陽性表達（SP ×400）；2D：在乳腺浸潤性導管癌組織中呈強陽性表達（SP ×400） 圖3 示4種乳腺組織中D2-40染色的免疫組化結果（SP ×200）。 3A：正常乳腺組織；3B：乳腺輕中度導管非典型增生組織；3C：乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組織；3D：乳腺癌組織；3E：乳腺癌組織中，淋巴管內可見癌栓
表1
4組乳腺組織中 CCR7 蛋白及 VEGF-D蛋白的表達〔 例（%）〕
2.2 D2-40的表達及LMVD結果
免疫組化染色結果顯示：D2-40陽性表達為淋巴管內皮細胞胞膜和細胞漿呈棕黃色。正常乳腺組織、輕中度導管非典型增生和重度導管非典型增生+導管原位癌組織中，D2-40染色的淋巴管多位于乳腺小葉周邊（圖 3A～3C），淋巴管形態不規則，管壁薄，管壁無平滑肌，管腔內偶見淋巴細胞，部分管腔擴張，部分呈條索狀，部分為幾個內皮細胞構成的細胞簇，甚至單個內皮細胞；乳腺癌組織中D2-40染色的淋巴管多位于癌周組織，部分管腔呈擴張狀態（圖 3D），部分淋巴管腔內可見癌栓（圖 3E）。正常乳腺組織組、乳腺輕中度導管非典型增生組、乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組及乳腺癌組的LMVD值分別為2.00±1.02、6.70±3.48、9.01±2.13及16.32±4.07，LMVD值逐漸增高，4組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.050）。此外，在乳腺癌患者中，淋巴結轉移組的LMVD值為21.37±3.95，高于無淋巴結轉移組的11.96±2.31 （P<0.050）。
2.3 乳腺癌組織中CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表達與其臨床病理學特征的關系
在乳腺癌患者中，CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表達均與臨床分期、組織學分級、淋巴結轉移及HER-2表達有關（P<0.050），而均與患者的年齡、腫瘤直徑、ER表達和PR表達狀況無關（P>0.050）。組織學分級越高、臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期（與Ⅰ+Ⅱ期者相比）、淋巴結轉移（與未發生淋巴結轉移者相比）及HER-2表達陽性（與HER-2表達陰性者相比）者CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表達陽性率較高（P<0.050），見表 2。
表2
乳腺癌組織中CCR7 蛋白和VEGF-D 蛋白表達與臨床病理特征的關系〔例（%）〕
2.4 乳腺癌組織中CCR7蛋白和VEGF蛋白表達與LMVD值間的關系
淋巴管與乳腺癌的淋巴轉移密切相關。在乳腺癌組織中，淋巴管增多者轉移的概率增高，其與預后有關；而在其余3類組織中，淋巴管密度增加無重要臨床意義，故筆者只探討了該兩種蛋白與LMVD值在乳腺癌組織中的關系。結果顯示，在乳腺癌患者中，CCR7陰性組的LMVD值為10.31±1.74，CCR7陽性組為12.81±3.98，2組比較差異無統計學意義（P> 0.050）；VEGF-D陰性組的LMVD值為13.32±2.14，VEGF-D陽性組為20.13±4.89，VEGF-D陽性組的LMVD值較高，2組比較差異有統計學意義（P<0.010）。 相關性分析結果顯示，LMVD值和VEGF-D蛋白表達強度之間呈正相關性（r=0.623，P<0.010），而LMVD值與CCR7蛋白表達強度之間的相關性無統計學意義（r=-0.303，P>0.050）。
2.5 乳腺癌組織中CCR7蛋白表達與VEGF-D蛋白表達的相關性
由于正常乳腺組織組、乳腺輕中度導管非典型增生組及乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組中CCR7蛋白與VEGF-D蛋白表達陽性例數太少，故僅分析了乳腺癌組織中兩種蛋白表達的相關性。列聯表相關分析結果顯示：在乳腺癌組織中，CCR7蛋白表達與VEGF-D蛋白表達間呈弱相關性（r=0.112，P<0.050），見表 3。
表3
乳腺癌組織中CCR7 蛋白表達與VEGF-D 蛋白表達的相關性
3 討論
趨化因子受體通常表達于免疫細胞和內皮細胞的細胞膜上，與相應的趨化因子結合而發揮作用，其與細胞骨架重排、內皮細胞黏附和細胞定向游動均有關。研究 [17-18] 表明，趨化因子及其受體在腫瘤細胞生長、轉移及宿主對腫瘤細胞的免疫方面均發揮極其重要的作用。CCR7蛋白是CCR亞家族中的一個亞類，現已證實它與多種腫瘤的發生有關，且與腫瘤的侵襲及轉移均相關 [13, 19-21] 。Müller等 [7] 對12例乳腺癌患者進行了CCR7 mRNA水平檢測，并與正常乳腺組織進行比較后發現，乳腺癌組織中其表達量明顯增高。朱旬等 [22] 研究發現，乳腺癌組織中CCR7 蛋白的陽性表達率明顯高于乳腺纖維腺瘤組織，且其陽性表達與淋巴結轉移和臨床分期均有關。本組資料結果顯示，正常乳腺組織組、乳腺輕中度導管非典型增生組、乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組、乳腺癌組中CCR7蛋白的表達陽性率逐漸增高。這提示CCR7蛋白可能在乳腺腫瘤的早期惡性轉化方面發揮一定的作用。另外筆者分析了CCR7蛋白表達與乳腺癌不同臨床病理特征的關系，結果發現，CCR7蛋白的表達與組織學分級、臨床分期、淋巴結轉移及HER-2表達均相關。
VEGF-D蛋白是目前已確定的VEGF家族中的淋巴內皮細胞生長因子。研究 [23-24] 表明，VEGF-D蛋白與腫瘤的發生及轉移均有關。Thelen等 [25] 在其建立的鼠肝癌模型的研究中發現，VEGF-D蛋白在肝癌組織中的陽性表達率明顯高于正常肝組織，且其表達與淋巴結轉移有關。Onogawa等 [26] 的研究結果也表明，在結腸癌組織中VEGF-D蛋白的陽性表達率較正常結腸組織升高，并且其表達與淋巴結轉移和患者的預后均密切相關。Stacker等 [27] 研究發現，VEGF-D蛋白不但可誘導腫瘤組織內的淋巴管生成，還可加快腫瘤細胞向區域淋巴結擴散。本組資料結果表明，正常乳腺組織組、 乳腺輕中度導管非典型增生組、 乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組及乳腺癌組中VEGF-D蛋白的表達陽性率逐漸增高，其在正常乳腺組織組中的表達陽性率為5.0%，在乳腺輕中度導管非典型增生組的表達陽性率為20.0%，在乳腺重度導管非典型增生+導管原位癌組的表達陽性率為40.0%，而在乳腺癌組中的表達陽性率高達57.5%；此外，淋巴結轉移組中VEGF-D蛋白的表達陽性率高于無淋巴結轉移組（表 2）。提示隨著乳腺病變的演進，VEGF-D蛋白的表達有升高的趨勢，進一步表明VEGF-D蛋白在乳腺癌的發生、發展及轉移過程中可能起著相當重要的作用。
乳腺癌的轉移主要以淋巴管轉移為主，關于淋巴管生成的研究 [28] 表明，VEGF-D蛋白可與淋巴管內皮細胞上的血管內皮生長因子受體3（VEGFR-3）結合，使VEGFR-3迅速活化，并引起下游分子She和Grb2磷酸化，通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路促使淋巴管內皮細胞增生、遷移和存活，從而形成新生的毛細淋巴管。Veikkola等 [29] 證明，VEGF-D蛋白在體內通過旁分泌途徑（VEGFR-3信號轉導通路）選擇性誘導淋巴管生成。本組資料結果顯示，VEGF-D蛋白在乳腺癌組織中呈高表達，而且VEGF-D蛋白的表達與LMVD值呈正相關，提示VEGF-D蛋白參與了乳腺癌淋巴管的生成及淋巴結轉移。
為進一步探討兩種蛋白表達與乳腺惡性潛能的關系，筆者分析了兩種蛋白表達與乳腺癌臨床病理學特征的關系，結果發現，這兩種蛋白的表達均與臨床分期、組織學分級及淋巴結轉移相關，且組織學分級越高、臨床分期越晚（Ⅲ+Ⅳ期）、有淋巴結轉移者CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表達陽性率均較高。此外，CCR7蛋白與VEGF-D蛋白的表達呈弱正相關，提示CCR7蛋白與VEGF-D蛋白在乳腺癌的癌變過程中可能有協同作用。CCR7蛋白也可能間接地參與腫瘤淋巴管的生長，其可能的機理是，腫瘤細胞中CCR7蛋白與相應的趨化因子即基質細胞衍生因子（CCL21）結合激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）通路，繼而激活蛋白激酶B（AKT）通路，使得腫瘤細胞內VEGF-D蛋白表達上調，VEGF-D蛋白與血管內皮生長因子受體（VEGFR）結合，促進新的內皮細胞分化、增生，形成新的腫瘤淋巴管，加速脈管轉移；另外腫瘤細胞內VEGF-D蛋白的高表達增加了腫瘤內部及腫瘤邊緣淋巴管的表面積，在乳腺癌細胞分泌的CCR7蛋白的作用下，促使乳腺癌細胞發生游走及定向轉移。因此VEGF-D蛋白和CCR7蛋白的過表達，在乳腺癌的發生發展及淋巴結轉移中發揮協同促進作用。
綜上所述，從正常乳腺組織、乳腺導管非典型增生組織到乳腺癌的發展過程中，CCR7蛋白與VEGF-D蛋白的表達均升高，兩者表達在乳腺癌組織中呈正相關，并且其陽性表達多見于組織學分級差、臨床分期晚和淋巴結轉移的乳腺癌患者。由此筆者認為，在乳腺癌的發生發展及轉移過程中，CCR7蛋白與VEGF-D蛋白起著非常重要的作用，其可作為判斷乳腺癌惡性生物學行為的重要指標，將其作為切入點來設計藥物將為乳腺癌的治療提供新的靶點。
