引用本文： 張龍龍, 王根旺, 錢彬彬, 顧越雷, 楊孫虎. 賁門失弛緩癥動物模型制備的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(5): 638-638. doi: 10.7507/1007-9424.20160171 復制
賁門失弛緩癥是一種食管動力障礙性疾病，指吞咽后食管缺乏蠕動，食管下端括約肌高壓及對吞咽動作的松弛反應減弱，人群發病率約為1：100 000 [1-2]，其主要臨床癥狀有吞咽困難、返流嘔吐、胸部疼痛不適、體重下降及貧血[3]。賁門失弛緩癥的發病機制不明，主要有肌源性學說、神經源性學說和先天性學說[3-4]，相應的賁門失弛緩癥動物模型主要經歷了梗阻模型、去神經模型和基因模型。研究者們通過模仿人類賁門失弛緩癥的臨床癥狀以及一些相關的輔助檢查，評估動物模型的可行性和可信性，現我們對其造模方法及可能機制做如下綜述。
1 梗阻模型的造模方法
肌源性學說[5]認為，賁門失弛緩癥患者的食管下端括約肌壓力會升高，是由于食管下端括約肌自身病變引起，肌肉肥大病變使其失去了正常的運動功能而繼發引起相應的癥狀。基于此學說，研究者們建立了相應的食管梗阻動物模型。
早在1986年，Little等[6]就建立了梗阻模型，以研究不完全梗阻對貓食管功能的影響以及與臨床的相關性，鋇餐檢查結果顯示，貓食管擴張，在影像學上得到了證實。之后的1991年，Tung等[7]也建立了此梗阻模型，證實了梗阻負鼠的食管組織中的肥厚平滑肌超微結構的變化，符合病變食管肌肉的組織細胞學改變，促進了人們對賁門失弛緩癥的進一步認識。到了1999年，Schneider等[8]在研究失弛緩性的食管異常活動是可逆時制備了經典的梗阻模型，將20只成年貓隨機分成實驗組和對照組，對照組，有4只貓，單純接受剖腹手術；實驗組，有16只貓，接受剖腹手術并放置一個塑料環于食管下端，塑料環的周長為靜息下胃食管交界處周長的110%。在隨后的1、2、4、6周，隨機選取4只貓，撤去其塑料環，用食管測壓法測量塑料環放置之前、塑料環放置后和期間間隔移除塑料環之后貓的食管壓力，分別在上述的每個時間點測量食管下端括約肌靜息下的壓力和百分比、收縮時的傳播波形、振幅和持續時間，并與對照組進行比較。結果顯示，實驗組貓的食管下端括約肌失去順從性，從而出現的梗阻、食管收縮振幅的急劇減少及蠕動的典型波形與賁門失弛緩癥患者相似。可見食管梗阻模型對動物的作用時間快，效果顯著，出現的癥狀也與人賁門失弛緩癥及其相似，在一定程度上有其獨特優點。
盡管以上這些模擬遠端食管梗阻的模型可以證明食管蠕動停止繼發于梗阻，并且也可表現出與人賁門失弛緩癥相似的癥狀，但是梗阻模型只是讓食管被動不能舒張，靠機械性產生的阻力在梗阻解除后可以完全消失[8]，這顯然與臨床不符，并且這些模型不足以解釋整個失弛緩性的動態過程。可見單一的肌肉因素并不是主導病因，肌源性學說并不能完全說明賁門失弛緩癥的發病機制。另外，由于采用剖腹放置塑料環和去除塑料環對實驗動物都是一種極大的傷害，這種傷害不可避免地會影響實驗結果，所以梗阻模型因其局限性并沒有被研究者廣泛應用。
2 去神經模型的造模方法
食管運動和食管下端括約肌的舒縮功能受迷走神經、交感神經和食管壁內的肌間神經叢共同調節。神經源性學說從神經機制出發[9-10]，認為賁門失弛緩癥不是食管下端括約肌本身的病變，而是支配松弛食管下端括約肌的神經減少或缺乏引起的病變，其中有兩種重要神經元支配食管下端括約肌的運動，一種為膽堿能神經元，釋放乙酰膽堿引起肌肉收縮，另一種是抑制性性質的非腎上腺素能非膽堿能神經元，釋放一氧化氮和血管活性腸肽[11]，引起肌肉舒張。賁門失弛緩癥由于非腎上腺素能非膽堿能神經元病變，導致抑制性神經遞質一氧化氮和血管活性腸肽減少，使調節食管下端括約肌興奮性和抑制性的神經失衡，引起食管下端括約肌壓力增高，松弛功能減弱，從而出現一系列的臨床癥狀[5]。基于此，研究者們探索了多種去神經模型的造模方法。
2.1 苯酚造模方法
Deloyers等[12]采用苯酚建立一種去神經的動物模型，以便研究賁門失弛緩癥的發病機制，將19只成年貓作為實驗組，進行麻醉，腹部切口，暴露賁門，用注射器量取2 mL亞甲藍染色的濃度為5%的苯酚溶液(苯酚是一種獸醫治療藥物，在人類也用于化學性動脈周圍交感神經切除術)，準確定位于食管內環肌和外縱肌之間，在賁門上1 cm處注入食管壁。在相同條件下的另外4只貓，以同樣方法注射2 mL高濃度的氨水(神經細胞的另外一種損傷劑)作為對照組。結果顯示，對照組的4只貓均死于嚴重的食管壞死和急性腹膜炎，實驗組有11只貓于當天或第2 d晚上死亡，這些死亡的貓食欲急劇下降，體質量減輕。實驗組的其他8只貓也在建模后0.5～5.5個月死亡，其中7只貓出現了相應的臨床癥狀、影像學改變、組織學上巨食管的改變。可見，苯酚模型是從微觀角度出發制備的去神經模型，不是單純從癥狀和結構上模仿，而是從神經細胞的受損去考慮賁門失弛緩癥的病因，基于此而建立的模型，為后來的研究指明了進一步的方向。之前，許多研究者對此病的可能病因傾向于腸肌叢神經節的破壞[12]，但苯酚對神經的破壞并沒有選擇性，它可以損傷附近的所有神經，包括交感和副交感神經，所以它并不能完全解釋賁門失弛緩癥的神經源性學說。不僅如此，這種模型存在更嚴重的不足，苯酚毒性太強，致使實驗動物大量死亡。大部分實驗動物過早死亡引起了大量相關數據的丟失，在一定程度上影響了實驗結果。因此，苯酚模型并沒有被后來的研究者們推廣應用。
2.2 芐基二甲基十四烷氯化銨(benzyldim ethyltetradecyl ammonium chloride，BAC)造模方法
BAC造模方法是典型的去神經模型方法，應用BAC注射于犬食管下端括約肌可產生與賁門失弛緩癥患者相似的臨床、形態學及病理生理學表現。早在1995年，Gaumnitz等[13]通過開腹對負鼠食管黏膜下注射BAC，4周后實驗動物出現了顯著的賁門失弛緩癥表現。向正國等[14]在建立賁門失弛緩癥犬動物模型的研究中，隨機將健康成年犬20只分成實驗組和對照組，每組10只。用戊巴比妥鈉按動物麻醉標準靜脈麻醉，固定于處置臺上，用口墊固定頭部，插入胃鏡，準確識別食管下端括約肌，從活檢孔插入小型注射針。實驗組用4 mmol/L的BAC，12 mL/只，在食管下端括約肌處環周多點注射于肌層，每點約0.5 mL；對照組用生理鹽水做相應處理。BAC注射后3 d開始半流質飲食，之后慢慢過渡到普食，觀察實驗動物的進食及體質量變化，BAC注射前以及注射后6周進行食管下端括約肌壓力測量和食管吞鋇造影檢查。結果顯示，BAC注射后10 d實驗組有犬開始出現返食、進食減少，6周后進食率減少達到80%，返食率高達60%，注射前后體質量比較差異有統計學意義(P < 0.05)。食管下端括約肌壓力升高和吞咽后松弛不良是賁門失弛緩癥的特點，其中食管測壓檢查是診斷賁門失弛緩癥的金標準，該研究中食管測壓的診斷符合率為100%。之后BAC造模被廣泛應用，以此來研究賁門失弛緩癥的臨床治療，進一步分析神經病因，已成功用于研究食管癌前病變與賁門失弛緩癥的研究[15]，也用于小腸疾病的造模[16]。
通過BAC造模發現，食管肌間神經叢氮能神經細胞以及神經纖維明顯減少[17]，這符合神經源性學說。另外，還發現了膽堿能神經纖維數量增加，但乙酰膽堿酯酶陽性神經減少[18]，這給臨床上用硝酸脂類、鈣離子通道阻滯劑、抗膽堿能藥物以及肉毒素局部注射[19]治療提供了可靠的依據，這些都為進一步研究賁門失弛緩的病因機制指明了方向。不但如此，BAC造模方便，應用內鏡注射藥物對實驗動物傷害小，并且可以重復給藥，動物模型建立所需時間少，可以動態觀察疾病的進展，成功率較高。因此可以認為，應用BAC可有效建立賁門失弛緩癥的動物模型，為賁門失弛緩癥的病因學研究和臨床治療提供可靠的依據。當然BAC模型也有其局限，其無法從更深的角度去解釋賁門失弛緩癥的病因，因為膽堿能神經元并沒有伴隨著非腎上腺素能非膽堿能神經元的減少而減少，然而BAC的損傷作用并沒有選擇性，并且人類不可能后天過多地接觸破壞神經的毒物，致使其神經元損壞和相關神經遞質的減少，隨后食管出現相應的病變，當然更不能解釋先天性賁門失弛緩癥的病因[20]。
3 基因模型的造模方法
賁門失弛緩癥的發病具有很明顯的家族集聚性[21]和地域聚居性[22]，所以先天性學說[23]認為，賁門失弛緩癥是由基因缺陷或突變引起，以常染色體隱性遺傳方式發病。基因是控制生物性狀的基本遺傳單位，基因模型是一種新型模型，其是從先天性學說出發制備的模型。
早在1978年，Jeremy Allgrove發現了AAA癥候群[24-25]即賁門失弛緩癥、無淚癥和阿狄森斯病，這是一個罕見的疾病，為常染色體隱性遺傳模式。1988年Randelia等[26]在研究ICRC/HiCri老鼠賁門失弛緩癥時發現該疾病為常染色體隱性遺傳的特點，所以賁門失弛緩癥的發病與性別無關，這與臨床相符。可見賁門失弛緩癥與遺傳存在一定的相關性。之后，越來越多的基因受到了研究者的關注，如Lsc/p115 [27]、Sprouty2 [28]、Rassf1a [29]及JAM-C [30]基因都表現出與賁門失弛緩癥的相關性。2014年，Pang等[31]將Pvrl3-Cre基因[32]插入到細菌人造克隆質粒，隨后線性化，凈化，注入到Wistar大鼠的胚胎，將注射的胚胎移入假孕的雌性老鼠，用PCR篩選出表型成功的后代，將這些后代與未轉基因的老鼠雜交，產生的18只雄鼠為實驗對象，將這些動物飼養到3～4個月時均出現了賁門失弛緩癥的癥狀。
越來越多的證據[33-34]指向遺傳因素，為后期的研究提供了可靠的依據和指明了進一步的研究方向。從基因層面研究出確切的相關疾病基因，可以指導我們進行有效的病因治療；并且在疾病出現前，通過檢測相關基因，提前采取治療措施，可以獲得更好的治療效果以及減少疾病的發病率，對賁門失弛緩癥的防治具有及其重大的意義。因此，基因模型吸引了越來越多研究者的關注。但是，由于制備基因模型的成本高，難度大，成功率低，而且相關基因并不是很明確。每個基因決定著其特定的性狀，但其表達又受到很多因素的影響，基因模型仍面臨著巨大的挑戰。
4 小結
賁門失弛緩癥明確的發病機制尚未發現，目前主要認為具有基因易感性的個體，在其后的生活中受到對食管刺激的因素(如病毒感染)，從而促發自身免疫性疾病，使大量炎癥細胞集聚于食管肌層，產生炎癥介質進而破壞相關神經節細胞引發疾病[35]。制備動物模型可以幫助我們更好地理解賁門失弛緩癥的發病機制。上述模型都基于相應的發病機制學說而制備的模型，都表現出各自的有效性和優越性。以肌肉病變為中心，基于肌源性學說制備的梗阻性模型，顯然已經過時。目前廣泛接受的是神經源性學說，但去神經模型也還有更多的神經遞質需要研究。隨著基因技術的發展，遺傳因素所指向的基因將會引領下一波研究熱潮。
賁門失弛緩癥是一種食管動力障礙性疾病，指吞咽后食管缺乏蠕動，食管下端括約肌高壓及對吞咽動作的松弛反應減弱，人群發病率約為1：100 000 [1-2]，其主要臨床癥狀有吞咽困難、返流嘔吐、胸部疼痛不適、體重下降及貧血[3]。賁門失弛緩癥的發病機制不明，主要有肌源性學說、神經源性學說和先天性學說[3-4]，相應的賁門失弛緩癥動物模型主要經歷了梗阻模型、去神經模型和基因模型。研究者們通過模仿人類賁門失弛緩癥的臨床癥狀以及一些相關的輔助檢查，評估動物模型的可行性和可信性，現我們對其造模方法及可能機制做如下綜述。
1 梗阻模型的造模方法
肌源性學說[5]認為，賁門失弛緩癥患者的食管下端括約肌壓力會升高，是由于食管下端括約肌自身病變引起，肌肉肥大病變使其失去了正常的運動功能而繼發引起相應的癥狀。基于此學說，研究者們建立了相應的食管梗阻動物模型。
早在1986年，Little等[6]就建立了梗阻模型，以研究不完全梗阻對貓食管功能的影響以及與臨床的相關性，鋇餐檢查結果顯示，貓食管擴張，在影像學上得到了證實。之后的1991年，Tung等[7]也建立了此梗阻模型，證實了梗阻負鼠的食管組織中的肥厚平滑肌超微結構的變化，符合病變食管肌肉的組織細胞學改變，促進了人們對賁門失弛緩癥的進一步認識。到了1999年，Schneider等[8]在研究失弛緩性的食管異常活動是可逆時制備了經典的梗阻模型，將20只成年貓隨機分成實驗組和對照組，對照組，有4只貓，單純接受剖腹手術；實驗組，有16只貓，接受剖腹手術并放置一個塑料環于食管下端，塑料環的周長為靜息下胃食管交界處周長的110%。在隨后的1、2、4、6周，隨機選取4只貓，撤去其塑料環，用食管測壓法測量塑料環放置之前、塑料環放置后和期間間隔移除塑料環之后貓的食管壓力，分別在上述的每個時間點測量食管下端括約肌靜息下的壓力和百分比、收縮時的傳播波形、振幅和持續時間，并與對照組進行比較。結果顯示，實驗組貓的食管下端括約肌失去順從性，從而出現的梗阻、食管收縮振幅的急劇減少及蠕動的典型波形與賁門失弛緩癥患者相似。可見食管梗阻模型對動物的作用時間快，效果顯著，出現的癥狀也與人賁門失弛緩癥及其相似，在一定程度上有其獨特優點。
盡管以上這些模擬遠端食管梗阻的模型可以證明食管蠕動停止繼發于梗阻，并且也可表現出與人賁門失弛緩癥相似的癥狀，但是梗阻模型只是讓食管被動不能舒張，靠機械性產生的阻力在梗阻解除后可以完全消失[8]，這顯然與臨床不符，并且這些模型不足以解釋整個失弛緩性的動態過程。可見單一的肌肉因素并不是主導病因，肌源性學說并不能完全說明賁門失弛緩癥的發病機制。另外，由于采用剖腹放置塑料環和去除塑料環對實驗動物都是一種極大的傷害，這種傷害不可避免地會影響實驗結果，所以梗阻模型因其局限性并沒有被研究者廣泛應用。
2 去神經模型的造模方法
食管運動和食管下端括約肌的舒縮功能受迷走神經、交感神經和食管壁內的肌間神經叢共同調節。神經源性學說從神經機制出發[9-10]，認為賁門失弛緩癥不是食管下端括約肌本身的病變，而是支配松弛食管下端括約肌的神經減少或缺乏引起的病變，其中有兩種重要神經元支配食管下端括約肌的運動，一種為膽堿能神經元，釋放乙酰膽堿引起肌肉收縮，另一種是抑制性性質的非腎上腺素能非膽堿能神經元，釋放一氧化氮和血管活性腸肽[11]，引起肌肉舒張。賁門失弛緩癥由于非腎上腺素能非膽堿能神經元病變，導致抑制性神經遞質一氧化氮和血管活性腸肽減少，使調節食管下端括約肌興奮性和抑制性的神經失衡，引起食管下端括約肌壓力增高，松弛功能減弱，從而出現一系列的臨床癥狀[5]。基于此，研究者們探索了多種去神經模型的造模方法。
2.1 苯酚造模方法
Deloyers等[12]采用苯酚建立一種去神經的動物模型，以便研究賁門失弛緩癥的發病機制，將19只成年貓作為實驗組，進行麻醉，腹部切口，暴露賁門，用注射器量取2 mL亞甲藍染色的濃度為5%的苯酚溶液(苯酚是一種獸醫治療藥物，在人類也用于化學性動脈周圍交感神經切除術)，準確定位于食管內環肌和外縱肌之間，在賁門上1 cm處注入食管壁。在相同條件下的另外4只貓，以同樣方法注射2 mL高濃度的氨水(神經細胞的另外一種損傷劑)作為對照組。結果顯示，對照組的4只貓均死于嚴重的食管壞死和急性腹膜炎，實驗組有11只貓于當天或第2 d晚上死亡，這些死亡的貓食欲急劇下降，體質量減輕。實驗組的其他8只貓也在建模后0.5～5.5個月死亡，其中7只貓出現了相應的臨床癥狀、影像學改變、組織學上巨食管的改變。可見，苯酚模型是從微觀角度出發制備的去神經模型，不是單純從癥狀和結構上模仿，而是從神經細胞的受損去考慮賁門失弛緩癥的病因，基于此而建立的模型，為后來的研究指明了進一步的方向。之前，許多研究者對此病的可能病因傾向于腸肌叢神經節的破壞[12]，但苯酚對神經的破壞并沒有選擇性，它可以損傷附近的所有神經，包括交感和副交感神經，所以它并不能完全解釋賁門失弛緩癥的神經源性學說。不僅如此，這種模型存在更嚴重的不足，苯酚毒性太強，致使實驗動物大量死亡。大部分實驗動物過早死亡引起了大量相關數據的丟失，在一定程度上影響了實驗結果。因此，苯酚模型并沒有被后來的研究者們推廣應用。
2.2 芐基二甲基十四烷氯化銨(benzyldim ethyltetradecyl ammonium chloride，BAC)造模方法
BAC造模方法是典型的去神經模型方法，應用BAC注射于犬食管下端括約肌可產生與賁門失弛緩癥患者相似的臨床、形態學及病理生理學表現。早在1995年，Gaumnitz等[13]通過開腹對負鼠食管黏膜下注射BAC，4周后實驗動物出現了顯著的賁門失弛緩癥表現。向正國等[14]在建立賁門失弛緩癥犬動物模型的研究中，隨機將健康成年犬20只分成實驗組和對照組，每組10只。用戊巴比妥鈉按動物麻醉標準靜脈麻醉，固定于處置臺上，用口墊固定頭部，插入胃鏡，準確識別食管下端括約肌，從活檢孔插入小型注射針。實驗組用4 mmol/L的BAC，12 mL/只，在食管下端括約肌處環周多點注射于肌層，每點約0.5 mL；對照組用生理鹽水做相應處理。BAC注射后3 d開始半流質飲食，之后慢慢過渡到普食，觀察實驗動物的進食及體質量變化，BAC注射前以及注射后6周進行食管下端括約肌壓力測量和食管吞鋇造影檢查。結果顯示，BAC注射后10 d實驗組有犬開始出現返食、進食減少，6周后進食率減少達到80%，返食率高達60%，注射前后體質量比較差異有統計學意義(P < 0.05)。食管下端括約肌壓力升高和吞咽后松弛不良是賁門失弛緩癥的特點，其中食管測壓檢查是診斷賁門失弛緩癥的金標準，該研究中食管測壓的診斷符合率為100%。之后BAC造模被廣泛應用，以此來研究賁門失弛緩癥的臨床治療，進一步分析神經病因，已成功用于研究食管癌前病變與賁門失弛緩癥的研究[15]，也用于小腸疾病的造模[16]。
通過BAC造模發現，食管肌間神經叢氮能神經細胞以及神經纖維明顯減少[17]，這符合神經源性學說。另外，還發現了膽堿能神經纖維數量增加，但乙酰膽堿酯酶陽性神經減少[18]，這給臨床上用硝酸脂類、鈣離子通道阻滯劑、抗膽堿能藥物以及肉毒素局部注射[19]治療提供了可靠的依據，這些都為進一步研究賁門失弛緩的病因機制指明了方向。不但如此，BAC造模方便，應用內鏡注射藥物對實驗動物傷害小，并且可以重復給藥，動物模型建立所需時間少，可以動態觀察疾病的進展，成功率較高。因此可以認為，應用BAC可有效建立賁門失弛緩癥的動物模型，為賁門失弛緩癥的病因學研究和臨床治療提供可靠的依據。當然BAC模型也有其局限，其無法從更深的角度去解釋賁門失弛緩癥的病因，因為膽堿能神經元并沒有伴隨著非腎上腺素能非膽堿能神經元的減少而減少，然而BAC的損傷作用并沒有選擇性，并且人類不可能后天過多地接觸破壞神經的毒物，致使其神經元損壞和相關神經遞質的減少，隨后食管出現相應的病變，當然更不能解釋先天性賁門失弛緩癥的病因[20]。
3 基因模型的造模方法
賁門失弛緩癥的發病具有很明顯的家族集聚性[21]和地域聚居性[22]，所以先天性學說[23]認為，賁門失弛緩癥是由基因缺陷或突變引起，以常染色體隱性遺傳方式發病。基因是控制生物性狀的基本遺傳單位，基因模型是一種新型模型，其是從先天性學說出發制備的模型。
早在1978年，Jeremy Allgrove發現了AAA癥候群[24-25]即賁門失弛緩癥、無淚癥和阿狄森斯病，這是一個罕見的疾病，為常染色體隱性遺傳模式。1988年Randelia等[26]在研究ICRC/HiCri老鼠賁門失弛緩癥時發現該疾病為常染色體隱性遺傳的特點，所以賁門失弛緩癥的發病與性別無關，這與臨床相符。可見賁門失弛緩癥與遺傳存在一定的相關性。之后，越來越多的基因受到了研究者的關注，如Lsc/p115 [27]、Sprouty2 [28]、Rassf1a [29]及JAM-C [30]基因都表現出與賁門失弛緩癥的相關性。2014年，Pang等[31]將Pvrl3-Cre基因[32]插入到細菌人造克隆質粒，隨后線性化，凈化，注入到Wistar大鼠的胚胎，將注射的胚胎移入假孕的雌性老鼠，用PCR篩選出表型成功的后代，將這些后代與未轉基因的老鼠雜交，產生的18只雄鼠為實驗對象，將這些動物飼養到3～4個月時均出現了賁門失弛緩癥的癥狀。
越來越多的證據[33-34]指向遺傳因素，為后期的研究提供了可靠的依據和指明了進一步的研究方向。從基因層面研究出確切的相關疾病基因，可以指導我們進行有效的病因治療；并且在疾病出現前，通過檢測相關基因，提前采取治療措施，可以獲得更好的治療效果以及減少疾病的發病率，對賁門失弛緩癥的防治具有及其重大的意義。因此，基因模型吸引了越來越多研究者的關注。但是，由于制備基因模型的成本高，難度大，成功率低，而且相關基因并不是很明確。每個基因決定著其特定的性狀，但其表達又受到很多因素的影響，基因模型仍面臨著巨大的挑戰。
4 小結
賁門失弛緩癥明確的發病機制尚未發現，目前主要認為具有基因易感性的個體，在其后的生活中受到對食管刺激的因素(如病毒感染)，從而促發自身免疫性疾病，使大量炎癥細胞集聚于食管肌層，產生炎癥介質進而破壞相關神經節細胞引發疾病[35]。制備動物模型可以幫助我們更好地理解賁門失弛緩癥的發病機制。上述模型都基于相應的發病機制學說而制備的模型，都表現出各自的有效性和優越性。以肌肉病變為中心，基于肌源性學說制備的梗阻性模型，顯然已經過時。目前廣泛接受的是神經源性學說，但去神經模型也還有更多的神經遞質需要研究。隨著基因技術的發展，遺傳因素所指向的基因將會引領下一波研究熱潮。