引用本文： 劉楊, 吳高松, 王文斌, 繆文青, 黃明, 陳大平. 17-AAG聯合紫杉醇對人未分化甲狀腺癌FRO細胞增殖和凋亡影響的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(3): 292-296. doi: 10.7507/1007-9424.20160080 復制
未分化甲狀腺癌是人類惡性腫瘤中侵襲性最強、最易發生化療抵抗的腫瘤之一，其惡性程度很高[1]，且進展迅速，常規治療方法的效果微乎其微，預后極差，確診后平均存活期僅6～8個月[2]。因此，尋找以腫瘤細胞為作用靶點的分子靶向治療成為了當今研究的熱點。17-丙烯胺基-17-去甲氧格爾德霉素（17-AAG）是第一個進入臨床研究的具有抗腫瘤活性的熱休克蛋白90 （HSP90）抑制劑，其通過特異性競爭抑制HSP90氨基端的ATP酶活性，而抑制腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移[3-4]。本實驗通過細胞體外培養，檢測17-AAG、紫杉醇單藥和聯合用藥對人未分化甲狀腺癌FRO細胞的抑制作用，并研究兩者是否有協同作用，以為未分化甲狀腺癌的臨床治療提供理論和實驗依據。
1 材料和方法
1.1 主要材料及設備
主要材料：人未分化甲狀腺癌FRO細胞株購自上海生科院，17-AAG、氮唑藍及10%胎牛血清均購自美國Sigma公司，紫杉醇和RPMI-1640培養基均購自武漢天興生物公司，碘化丙啶（PI）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）及Caspase-9活性檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。主要設備：CCL-170B-8二氧化碳培養箱購自新加坡ESCO公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺購自蘇州蘇凈集團；XDS-1B倒置顯微鏡購自重慶光電儀器有限公司；ELx800TM用酶標儀購自美國BioTek公司；BD FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組
本實驗分為3個大組。空白對照組：不加藥物只加培養液；單藥實驗組：17-AAG的濃度分別為0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0以及5.0000 μmol/L，紫杉醇的濃度分別為0.001 0、0.010 0、0.100 0及1.000 0 μmol/L （根據預實驗選擇初始有效劑量，分別按照2倍和10倍劑量遞增）；聯合組：紫杉醇為前述單藥濃度梯度，聯合加入17-AAG（0.625 0 μmol/L）。當2種藥物聯用的時候，一般采用30%左右抑制率的濃度，0.625 0 μmol/L17-AAG組在72 h時其抑制率接近30%，因此選擇0.625 0 μmol/L。
1.2.2 細胞培養
將人未分化甲狀腺癌FRO細胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640高糖培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。每天定時觀察細胞生長情況，于倒置顯微鏡下查看細胞的形態、數目、培養液的顏色、有無污染等情況，隔天換液。根據細胞生長情況，3～5 d傳代，傳代10次。
1.2.3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT比色法）檢測藥物抑制效應
收集對數生長期的人未分化甲狀腺癌FRO細胞，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×105個/mL。在96孔培養板中每孔加入100 μL單細胞懸液〔邊緣孔用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS液）填充〕，移至37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h后換液。每個濃度組設5個平行孔，每孔加入含藥物的培養基100 μL。分別溫育24、48及72 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的氮唑藍溶液，培養4 h。終止細胞培養，小心吸凈上清液，再每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度值（OD490），計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%） = （空白對照組OD490值-實驗組OD490值）/空白對照組OD490值×100%。聯合用藥是否具有協同作用采用金正均法[5]計算q值來判斷，＞1.15為協同增效；0.85～1.15為單純相加，＜0.85為拮抗。
1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率
取對數生長期的人未分化甲狀腺癌FRO細胞制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106個/mL，將細胞分為4組：空白對照組不加藥物只加培養液，17-AAG組的濃度為0.625 0 μmol/L，紫杉醇組的濃度為0.100 0 μmol/L（根據紫杉醇的半數致死率確定的濃度）；17-AAG聯合紫杉醇組的17-AAG濃度為0.625 0 μmol/L，紫杉醇濃度為0.100 0 μmol/L。于6孔培養板中每孔加入2 mL單細胞懸液，培養24 h后棄去原培養液，加入含藥培養基，并設置空白對照組。培養24 h后收集細胞，用PBS液洗滌3次，每次5 min，加入RNA酶50 μL（濃度為0.5 mg/mL），入恒溫培養箱37 ℃孵育30 min，然后加入50 pg/mL的PI染色液100 μL，微量振蕩器上振蕩混勻，4 ℃冰箱內避光染色30 min。上流式細胞儀檢測，重復實驗3次。
1.2.5 Caspase-3和Caspase-9活性檢測
取對數生長期的FRO細胞制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106個/mL，細胞組別設置同細胞凋亡率實驗。于6孔培養板中每孔加入2 mL單細胞懸液，培養24 h后棄去原培養液，加入含藥培養基，并設置空白對照組。培養24 h后收集細胞，用裂解液冰上裂解15 min后，4 ℃、20 000×g離心10 min。把上清轉移到冰浴預冷的離心管中。取5 μL上清液，用Bradford法[6]測定蛋白濃度。另外取出10 μL待測樣品，加入80 μL緩沖液和10 μL Ac-LEHD-pNA 37 ℃孵育1 h后測定OD405值，對比標準曲線計算出樣品催化了多少量的pNA，再通過蛋白濃度計算Caspase-3和Caspase-9的酶活力單位。重復實驗3次。
1.3 統計學方法
本實驗所有數據均采用SPSS 17.0軟件進行分析。計量數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 MTT實驗結果
2.1.1 各劑量組的增殖抑制率
MTT結果顯示，同時點空白對照組、各劑量17-AAG組/紫杉醇組/17-AAG聯合紫杉醇組的增殖抑制率隨濃度升高而逐漸升高，任2組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），表明17-AAG、紫杉醇及17-AAG聯合紫杉醇具有劑量依賴性。各劑量17-AAG組/紫杉醇組/17-AAG聯合紫杉醇組的增殖抑制率在24、28及72 h逐漸增高，任2組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），表明17-AAG、紫杉醇及17-AAG聯合紫杉醇具有時間依賴性。同時點同濃度情況下，17-AAG聯合紫杉醇組的增殖抑制率均高于單獨用藥組（P＜0.05），見表 1。
表1
不同濃度的17-AAG、紫杉醇及17-AAG聯合紫杉醇組的增殖抑制率結果（％，2.1.2 協同作用
按照聯合用藥公式推算，各時點17-AAG與紫杉醇聯合的q值均大于1.15，兩者之間呈協同作用，且隨著時間的延長、紫杉醇濃度增加，其協同作用也增強，見表 2。
表2
不同時點17-AAG聯合紫杉醇對人未分化甲狀腺癌FRO細胞生長抑制的協同作用（2.2 流式細胞儀檢測結果
流式細胞儀結果顯示，17-AAG組、紫杉醇組及17-AAG聯合紫杉醇組FRO細胞的凋亡率均高于空白對照組（P＜0.05）；且17-AAG聯合紫杉醇組FRO細胞的凋亡率高于17-AAG組和紫杉醇組（P＜0.05）。該結果表明，17-AAG和紫杉醇均可以有效誘導FRO細胞的凋亡，而且聯合用藥后FRO細胞的凋亡率增加。細胞周期分析結果顯示，17-AAG組、紫杉醇組和17-AAG聯合紫杉醇組的G0 /G1期和S期細胞比例均低于空白對照組（P＜0.05），而G2 /M期細胞比例增加（P＜0.05），表明17-AAG、紫杉醇及17-AAG聯合紫杉醇均使FRO細胞阻滯于G2 /M期，見表 3和圖 1。
表3
4組人未分化甲狀腺癌FRO細胞的細胞凋亡率和細胞周期結果〔％，
圖1
示4組人未分化甲狀腺癌FRO細胞的凋亡率。1A：空白對照組；1B：17-AAG組；1C：紫杉醇組；1D：17-AAG聯合紫杉醇組
2.3 Caspase-3和Caspase-9活性的檢測結果
17-AAG組、紫杉醇組及17-AAG聯合紫杉醇組FRO細胞的Caspase-3和Caspase-9活性均高于空白對照組（P＜0.05）；且17-AAG聯合紫杉醇組細胞的Caspase-3和Caspase-9活性高于17-AAG組和紫杉醇組（P＜0.05），見表 4。
表4
4 組人未分化甲狀腺癌RFO 細胞中Caspase-3 和Caspase-9的活性（3 討論
甲狀腺未分化癌是高度惡性腫瘤，約占甲狀腺癌的2%～3% [7]，發病率約為（0.1～0.2）/10萬[8]，占全身惡性腫瘤的1% [9]。其病情發展非常迅速，致死率極高[10]，早期即可發生侵襲轉移，常規的手術、放療、化療或聯合治療的效果都不甚理想。因此，尋找新的腫瘤分子靶向治療藥物成為了廣大研究者的新目標。紫杉醇是一種廣譜抗癌藥物，對多種實體腫瘤如乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌等均有明顯的抑制作用[11]，其主要通過促進微管聚合、抑制微管降解而誘導多種癌細胞的凋亡[12]；同時調控免疫系統以促進多種細胞因子的釋放，從而對癌細胞產生增殖抑制和殺傷作用[13]。研究[14-16]表明，HSP90作為一種分子伴侶蛋白，在生物進化過程中高度保守，約占細胞質蛋白的1%～2%；其在腫瘤組織中高表達，而在正常組織中表達正常，與腫瘤發生相關蛋白的穩定性有關，是許多癌基因通路中的重要組成部分，因此也使得它成了許多抗腫瘤藥物的作用靶點之一。17-AAG是一種很強的HSP90抑制劑，其能與HSP90上的ATP位點結合，通過廣泛降解客戶蛋白、誘導腫瘤細胞凋亡、干擾細胞周期等抑制腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移。朱奇等[17]通過大量動物實驗發現，17-AAG對大鼠嗜鉻細胞瘤裸鼠移植瘤有明顯抑制作用，并可降低腫瘤組織中HSP90、磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3抗體（STAT3）及原癌基因人類表皮生長因子受體2 （ERBB2） 的表達。Wang等[18]用HSP90抑制劑作用于乳腺癌MCF-7細胞，結果發現其能抑制乳腺癌細胞的生長及增殖，并阻止細胞于G2 /M期。趙學榮等[19]發現，17-AAG作用于人結直腸癌HCT-15細胞株后，細胞周期發生G期阻滯，同時誘導細胞凋亡，提示17-AAG可能通過阻斷STAT3的表達、啟動線粒體凋亡通路來誘導細胞凋亡。
本實驗MTT結果表明，17-AGG、紫杉醇單藥及聯合用藥均能對人未分化乳腺癌FRO細胞產生抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，作用時間的延長，抑制作用明顯增強，呈現時間-劑量依賴性。不同濃度的紫杉醇與0.625 0 μmol/L的17-AAG聯合用藥對人未分化甲狀腺癌FRO細胞的抑制作用明顯強于單獨用藥組，且q值均大于1.15，表明紫杉醇聯合17-AAG對FRO細胞的作用具有協同效應。此外，流式細胞儀檢測結果表明，17-AAG組、紫杉醇組及17-AAG聯合紫杉醇組FRO細胞的凋亡率均高于空白對照組，且17-AAG聯合紫杉醇組FRO細胞的凋亡率高于17-AAG組和紫杉醇組；17-AAG、紫杉醇及兩者聯用阻止FRO細胞于G2 /M期。上述結果表明，17-AGG和紫杉醇均可引起人未分化甲狀腺癌FRO細胞的凋亡，且17-AAG可以增強紫杉醇的作用，抑制FRO細胞的生長。
細胞凋亡在組織進化、器官發育、機體穩態維持、預防腫瘤發生等過程中均有重要作用。Caspase家族即半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族，是執行細胞凋亡的主要酶類，通常在細胞中以無活性的酶原形式存在，在細胞凋亡過程中需要與其他蛋白一起協調作用調控細胞的凋亡[20]。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵因素，其直接影響細胞凋亡過程。近來研究[21]表明，Caspase-3影響的細胞凋亡過程存在于人體的各種細胞中，且其介導多種惡性腫瘤的凋亡過程。陳愛華等[22]研究發現，胰腺癌組織中Caspase-3的表達水平明顯高于胰腺炎患者。Caspase-9是線粒體凋亡途徑的上游核心因子，其活化能啟動級聯激活反應而促進細胞凋亡[23]。殷舞等[24]研究發現，Caspase-9在胃癌腹膜轉移癌患者的原發灶及轉移灶中的表達陽性率明顯高于胃癌無腹膜轉移組。本實驗結果表明，17-AAG、紫杉醇單藥及聯合用藥處理人未分化甲狀腺癌FRO細胞24 h后，17-AAG組、紫杉醇組以及17-AAG聯合紫杉醇組FRO細胞的Caspase-3和Caspase-9活性均高于空白對照組，且17-AAG聯合紫杉醇組細胞的Caspase-3和Caspase-9活性高于17-AAG組和紫杉醇組，表明17-AAG、紫杉醇及兩者聯用后，細胞中Caspase-3和Caspase-9的活性明顯增加，與文獻[25-26]報道一致。但是，由于本實驗設置復孔數量過少且藥物濃度梯度過少，實驗結果難免有所偏差。在后續的實驗中，應進一步增加復孔數量以期進一步驗證實驗結果的準確性。
綜上所述，17-AAG作為一類新型抗腫瘤藥物，具有抑制FRO細胞增殖和促進其凋亡的作用，小劑量的17-AAG聯合紫杉醇還可以增強紫杉醇對FRO細胞的殺傷作用，增加紫杉醇的敏感性。這為聯合用藥治療人未分化甲狀腺癌提供了實驗依據，也為治療人未分化甲狀腺癌提供了一條新的思路。
未分化甲狀腺癌是人類惡性腫瘤中侵襲性最強、最易發生化療抵抗的腫瘤之一，其惡性程度很高[1]，且進展迅速，常規治療方法的效果微乎其微，預后極差，確診后平均存活期僅6～8個月[2]。因此，尋找以腫瘤細胞為作用靶點的分子靶向治療成為了當今研究的熱點。17-丙烯胺基-17-去甲氧格爾德霉素（17-AAG）是第一個進入臨床研究的具有抗腫瘤活性的熱休克蛋白90 （HSP90）抑制劑，其通過特異性競爭抑制HSP90氨基端的ATP酶活性，而抑制腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移[3-4]。本實驗通過細胞體外培養，檢測17-AAG、紫杉醇單藥和聯合用藥對人未分化甲狀腺癌FRO細胞的抑制作用，并研究兩者是否有協同作用，以為未分化甲狀腺癌的臨床治療提供理論和實驗依據。
1 材料和方法
1.1 主要材料及設備
主要材料：人未分化甲狀腺癌FRO細胞株購自上海生科院，17-AAG、氮唑藍及10%胎牛血清均購自美國Sigma公司，紫杉醇和RPMI-1640培養基均購自武漢天興生物公司，碘化丙啶（PI）、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）及Caspase-9活性檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。主要設備：CCL-170B-8二氧化碳培養箱購自新加坡ESCO公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺購自蘇州蘇凈集團；XDS-1B倒置顯微鏡購自重慶光電儀器有限公司；ELx800TM用酶標儀購自美國BioTek公司；BD FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組
本實驗分為3個大組。空白對照組：不加藥物只加培養液；單藥實驗組：17-AAG的濃度分別為0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0以及5.0000 μmol/L，紫杉醇的濃度分別為0.001 0、0.010 0、0.100 0及1.000 0 μmol/L （根據預實驗選擇初始有效劑量，分別按照2倍和10倍劑量遞增）；聯合組：紫杉醇為前述單藥濃度梯度，聯合加入17-AAG（0.625 0 μmol/L）。當2種藥物聯用的時候，一般采用30%左右抑制率的濃度，0.625 0 μmol/L17-AAG組在72 h時其抑制率接近30%，因此選擇0.625 0 μmol/L。
1.2.2 細胞培養
將人未分化甲狀腺癌FRO細胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640高糖培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。每天定時觀察細胞生長情況，于倒置顯微鏡下查看細胞的形態、數目、培養液的顏色、有無污染等情況，隔天換液。根據細胞生長情況，3～5 d傳代，傳代10次。
1.2.3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT比色法）檢測藥物抑制效應
收集對數生長期的人未分化甲狀腺癌FRO細胞，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×105個/mL。在96孔培養板中每孔加入100 μL單細胞懸液〔邊緣孔用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS液）填充〕，移至37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h后換液。每個濃度組設5個平行孔，每孔加入含藥物的培養基100 μL。分別溫育24、48及72 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的氮唑藍溶液，培養4 h。終止細胞培養，小心吸凈上清液，再每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度值（OD490），計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%） = （空白對照組OD490值-實驗組OD490值）/空白對照組OD490值×100%。聯合用藥是否具有協同作用采用金正均法[5]計算q值來判斷，＞1.15為協同增效；0.85～1.15為單純相加，＜0.85為拮抗。
1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率
取對數生長期的人未分化甲狀腺癌FRO細胞制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106個/mL，將細胞分為4組：空白對照組不加藥物只加培養液，17-AAG組的濃度為0.625 0 μmol/L，紫杉醇組的濃度為0.100 0 μmol/L（根據紫杉醇的半數致死率確定的濃度）；17-AAG聯合紫杉醇組的17-AAG濃度為0.625 0 μmol/L，紫杉醇濃度為0.100 0 μmol/L。于6孔培養板中每孔加入2 mL單細胞懸液，培養24 h后棄去原培養液，加入含藥培養基，并設置空白對照組。培養24 h后收集細胞，用PBS液洗滌3次，每次5 min，加入RNA酶50 μL（濃度為0.5 mg/mL），入恒溫培養箱37 ℃孵育30 min，然后加入50 pg/mL的PI染色液100 μL，微量振蕩器上振蕩混勻，4 ℃冰箱內避光染色30 min。上流式細胞儀檢測，重復實驗3次。
1.2.5 Caspase-3和Caspase-9活性檢測
取對數生長期的FRO細胞制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106個/mL，細胞組別設置同細胞凋亡率實驗。于6孔培養板中每孔加入2 mL單細胞懸液，培養24 h后棄去原培養液，加入含藥培養基，并設置空白對照組。培養24 h后收集細胞，用裂解液冰上裂解15 min后，4 ℃、20 000×g離心10 min。把上清轉移到冰浴預冷的離心管中。取5 μL上清液，用Bradford法[6]測定蛋白濃度。另外取出10 μL待測樣品，加入80 μL緩沖液和10 μL Ac-LEHD-pNA 37 ℃孵育1 h后測定OD405值，對比標準曲線計算出樣品催化了多少量的pNA，再通過蛋白濃度計算Caspase-3和Caspase-9的酶活力單位。重復實驗3次。
1.3 統計學方法
本實驗所有數據均采用SPSS 17.0軟件進行分析。計量數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 MTT實驗結果
2.1.1 各劑量組的增殖抑制率
MTT結果顯示，同時點空白對照組、各劑量17-AAG組/紫杉醇組/17-AAG聯合紫杉醇組的增殖抑制率隨濃度升高而逐漸升高，任2組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），表明17-AAG、紫杉醇及17-AAG聯合紫杉醇具有劑量依賴性。各劑量17-AAG組/紫杉醇組/17-AAG聯合紫杉醇組的增殖抑制率在24、28及72 h逐漸增高，任2組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），表明17-AAG、紫杉醇及17-AAG聯合紫杉醇具有時間依賴性。同時點同濃度情況下，17-AAG聯合紫杉醇組的增殖抑制率均高于單獨用藥組（P＜0.05），見表 1。
表1
不同濃度的17-AAG、紫杉醇及17-AAG聯合紫杉醇組的增殖抑制率結果（％，2.1.2 協同作用
按照聯合用藥公式推算，各時點17-AAG與紫杉醇聯合的q值均大于1.15，兩者之間呈協同作用，且隨著時間的延長、紫杉醇濃度增加，其協同作用也增強，見表 2。
表2
不同時點17-AAG聯合紫杉醇對人未分化甲狀腺癌FRO細胞生長抑制的協同作用（2.2 流式細胞儀檢測結果
流式細胞儀結果顯示，17-AAG組、紫杉醇組及17-AAG聯合紫杉醇組FRO細胞的凋亡率均高于空白對照組（P＜0.05）；且17-AAG聯合紫杉醇組FRO細胞的凋亡率高于17-AAG組和紫杉醇組（P＜0.05）。該結果表明，17-AAG和紫杉醇均可以有效誘導FRO細胞的凋亡，而且聯合用藥后FRO細胞的凋亡率增加。細胞周期分析結果顯示，17-AAG組、紫杉醇組和17-AAG聯合紫杉醇組的G0 /G1期和S期細胞比例均低于空白對照組（P＜0.05），而G2 /M期細胞比例增加（P＜0.05），表明17-AAG、紫杉醇及17-AAG聯合紫杉醇均使FRO細胞阻滯于G2 /M期，見表 3和圖 1。
表3
4組人未分化甲狀腺癌FRO細胞的細胞凋亡率和細胞周期結果〔％，
圖1
示4組人未分化甲狀腺癌FRO細胞的凋亡率。1A：空白對照組；1B：17-AAG組；1C：紫杉醇組；1D：17-AAG聯合紫杉醇組
2.3 Caspase-3和Caspase-9活性的檢測結果
17-AAG組、紫杉醇組及17-AAG聯合紫杉醇組FRO細胞的Caspase-3和Caspase-9活性均高于空白對照組（P＜0.05）；且17-AAG聯合紫杉醇組細胞的Caspase-3和Caspase-9活性高于17-AAG組和紫杉醇組（P＜0.05），見表 4。
表4
4 組人未分化甲狀腺癌RFO 細胞中Caspase-3 和Caspase-9的活性（3 討論
甲狀腺未分化癌是高度惡性腫瘤，約占甲狀腺癌的2%～3% [7]，發病率約為（0.1～0.2）/10萬[8]，占全身惡性腫瘤的1% [9]。其病情發展非常迅速，致死率極高[10]，早期即可發生侵襲轉移，常規的手術、放療、化療或聯合治療的效果都不甚理想。因此，尋找新的腫瘤分子靶向治療藥物成為了廣大研究者的新目標。紫杉醇是一種廣譜抗癌藥物，對多種實體腫瘤如乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌等均有明顯的抑制作用[11]，其主要通過促進微管聚合、抑制微管降解而誘導多種癌細胞的凋亡[12]；同時調控免疫系統以促進多種細胞因子的釋放，從而對癌細胞產生增殖抑制和殺傷作用[13]。研究[14-16]表明，HSP90作為一種分子伴侶蛋白，在生物進化過程中高度保守，約占細胞質蛋白的1%～2%；其在腫瘤組織中高表達，而在正常組織中表達正常，與腫瘤發生相關蛋白的穩定性有關，是許多癌基因通路中的重要組成部分，因此也使得它成了許多抗腫瘤藥物的作用靶點之一。17-AAG是一種很強的HSP90抑制劑，其能與HSP90上的ATP位點結合，通過廣泛降解客戶蛋白、誘導腫瘤細胞凋亡、干擾細胞周期等抑制腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移。朱奇等[17]通過大量動物實驗發現，17-AAG對大鼠嗜鉻細胞瘤裸鼠移植瘤有明顯抑制作用，并可降低腫瘤組織中HSP90、磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3抗體（STAT3）及原癌基因人類表皮生長因子受體2 （ERBB2） 的表達。Wang等[18]用HSP90抑制劑作用于乳腺癌MCF-7細胞，結果發現其能抑制乳腺癌細胞的生長及增殖，并阻止細胞于G2 /M期。趙學榮等[19]發現，17-AAG作用于人結直腸癌HCT-15細胞株后，細胞周期發生G期阻滯，同時誘導細胞凋亡，提示17-AAG可能通過阻斷STAT3的表達、啟動線粒體凋亡通路來誘導細胞凋亡。
本實驗MTT結果表明，17-AGG、紫杉醇單藥及聯合用藥均能對人未分化乳腺癌FRO細胞產生抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，作用時間的延長，抑制作用明顯增強，呈現時間-劑量依賴性。不同濃度的紫杉醇與0.625 0 μmol/L的17-AAG聯合用藥對人未分化甲狀腺癌FRO細胞的抑制作用明顯強于單獨用藥組，且q值均大于1.15，表明紫杉醇聯合17-AAG對FRO細胞的作用具有協同效應。此外，流式細胞儀檢測結果表明，17-AAG組、紫杉醇組及17-AAG聯合紫杉醇組FRO細胞的凋亡率均高于空白對照組，且17-AAG聯合紫杉醇組FRO細胞的凋亡率高于17-AAG組和紫杉醇組；17-AAG、紫杉醇及兩者聯用阻止FRO細胞于G2 /M期。上述結果表明，17-AGG和紫杉醇均可引起人未分化甲狀腺癌FRO細胞的凋亡，且17-AAG可以增強紫杉醇的作用，抑制FRO細胞的生長。
細胞凋亡在組織進化、器官發育、機體穩態維持、預防腫瘤發生等過程中均有重要作用。Caspase家族即半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族，是執行細胞凋亡的主要酶類，通常在細胞中以無活性的酶原形式存在，在細胞凋亡過程中需要與其他蛋白一起協調作用調控細胞的凋亡[20]。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵因素，其直接影響細胞凋亡過程。近來研究[21]表明，Caspase-3影響的細胞凋亡過程存在于人體的各種細胞中，且其介導多種惡性腫瘤的凋亡過程。陳愛華等[22]研究發現，胰腺癌組織中Caspase-3的表達水平明顯高于胰腺炎患者。Caspase-9是線粒體凋亡途徑的上游核心因子，其活化能啟動級聯激活反應而促進細胞凋亡[23]。殷舞等[24]研究發現，Caspase-9在胃癌腹膜轉移癌患者的原發灶及轉移灶中的表達陽性率明顯高于胃癌無腹膜轉移組。本實驗結果表明，17-AAG、紫杉醇單藥及聯合用藥處理人未分化甲狀腺癌FRO細胞24 h后，17-AAG組、紫杉醇組以及17-AAG聯合紫杉醇組FRO細胞的Caspase-3和Caspase-9活性均高于空白對照組，且17-AAG聯合紫杉醇組細胞的Caspase-3和Caspase-9活性高于17-AAG組和紫杉醇組，表明17-AAG、紫杉醇及兩者聯用后，細胞中Caspase-3和Caspase-9的活性明顯增加，與文獻[25-26]報道一致。但是，由于本實驗設置復孔數量過少且藥物濃度梯度過少，實驗結果難免有所偏差。在后續的實驗中，應進一步增加復孔數量以期進一步驗證實驗結果的準確性。
綜上所述，17-AAG作為一類新型抗腫瘤藥物，具有抑制FRO細胞增殖和促進其凋亡的作用，小劑量的17-AAG聯合紫杉醇還可以增強紫杉醇對FRO細胞的殺傷作用，增加紫杉醇的敏感性。這為聯合用藥治療人未分化甲狀腺癌提供了實驗依據，也為治療人未分化甲狀腺癌提供了一條新的思路。
