引用本文： 楊自國, 郭曉波, 石玉龍, 李辰生, 李樂平. MSI2在胃癌中的表達及其意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(1): 52-55. doi: 10.7507/1007-9424.20160014 復制
胃癌是一種常見的影響人類健康的消化系統惡性疾病，在惡性腫瘤中發病率位居第5，在腫瘤相關性死亡中位居第3 [1-2]，而在發展中國家男性患者腫瘤相關性疾病中位居首位[3]。近年來，我國胃癌的死亡率有所下降，但是胃癌的診斷和治療依舊是腫瘤診治的一個核心負擔[4]。目前，胃癌的治療以手術為主，但是術后患者的預后依然很差；而在診斷方面，因缺乏特異性的標志物，胃癌患者多在晚期被發現或就診。胃癌的發生發展是一個多步驟多基因參與的復雜生物學過程，因此，篩選胃癌發生發展相關分子、探尋胃癌發生機理并有效地干預，是胃癌早期診斷和治療的重要策略。
RNA結合蛋白Musashi2（MSl2）是Musashi大家族的一員，是干細胞和早期祖細胞的重要分子標志物[5-6]。生理情況下MSI2在造血干細胞中大量表達并參與造血的調控，MSI2缺失會阻止造血干細胞自我更新并誘導其分化；在髓性白血病中，MSI2異常高表達、促進細胞的增值并影響白血病的預后[7-9]。MSI2在成人腫瘤發生過程中存在差異表達[10]，如在惡性膠質瘤[11]、胰腺癌[12]及肝細胞癌[13]中表達明顯高于癌旁組織，并且其表達水平與腫瘤的大小、脈管侵犯以及早期復發密切相關。本研究擬通過實時定量PCR方法檢測67例胃癌患者腫瘤組織和癌旁組織中MSI2 mRNA的表達水平，并應用Western blot方法對其中8例患者的MSI2蛋白表達水平進行檢測，分析MSI2表達水平與胃癌臨床病理學特征的關系，初步探討MSI2對胃癌發生發展的影響。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
收集山東大學附屬省立醫院胃腸外科2012年1月至2012年12月期間收治的67例胃癌患者的腫瘤標本。通過醫院病案查詢系統完善67例患者的臨床病理資料，選取了包括患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤侵襲深度、分期、分化程度以及大小。本研究獲山東大學附屬醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。
1.2 主要試劑
RNAiso試劑、逆轉錄試劑盒及SYBGreen購自Takara生物公司；兔抗人MSI2購自Abcam公司（貨號ab76148）；化學發光顯影液由MILLIPORE公司提供。
1.3 方法
1.3.1 胃癌組織中MSI2 mRNA表達水平檢測
采用實時定量PCR方法。通過RNAiso提取液氮中儲存胃癌組織的總RNA，分別根據說明書用逆轉錄試劑盒和SYBGreen擴增目的MSI2片段。引物均由Takara公司合成。MSI2上游引物為5?-GCAACGGC-CTTTACAAATGGATAC-3?，下游引物為5?-CAGGT-CTGAGGACATCACCTAAACA-3?；內參GAPDH上游引物為5?-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3?，下游引物為5?-TGGTGAAGACGCCAGT GGA-3?。所有反應均設3個復空，以DEPC水代替模板cDNA作為空白對照。實時PCR反應體系：Takara SYBR?PremixEx Taq（Tli RNaseH Plus）2×10μg，10μmol/L上下游引物各0.4μL，cDNA 2μL，H2O 7.2μL；反應條件：95℃30 s變性，95℃5 s、60℃30 s，擴增40個循環。通過分析MSI2 mRNA表達水平與胃癌臨床病理學特征之間的關系，探尋對胃癌發生發展的影響。
1.3.2 胃癌組織及其癌旁組織中MSI2蛋白表達的檢測
胃癌及其癌旁組織儲存于液氮中，選取PCR中高表達組樣本8對，采用Western blot蛋白免疫印跡法檢測MSI2蛋白的表達。每泳道上樣60μg蛋白樣品，用SDS丙烯酰胺電泳后電轉移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。用GE公司ImageQuant LAS 4000凝膠成像顯影。通過條帶灰度值定量相應蛋白表達水平。
1.4 統計學方法
采用SPSS 21.0統計軟件對數據進行分析，結果圖由GraphPad Prism 5.0軟件輸出。計數資料采用χ2檢驗，分析胃癌組織中MSI2 mRNA的表達與其臨床病理特征間的關系。Kaplan-Meier單因素分析計算累積生存率，生存期差異行log-rank檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MSI2在胃癌及其癌旁組織中的表達情況
首先對67例胃癌患者的癌組織及其癌旁組織行實時定量PCR檢測，結果提示MSI2 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中的相對表達量的差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 1。然后再從上述67例患者中選取mRNA水平高表達的8例行蛋白免疫印跡實驗，結果顯示，MSI2蛋白在此8例胃癌組織中的表達水平均上調（圖 2）。
圖1
示67例胃癌組織及其癌旁組織中MSI2 mRNA的表達結果??圖 2?示8例MSI2 mRNA高表達胃癌患者的MSI2蛋白表達結果。T：腫瘤組織；N：癌旁組織
2.2 MSI2 mRNA的表達與胃癌臨床病理學特征間的關系
將胃癌組織與相應癌旁組織MSI2 mRNA表達水平之比作為MSI2相對表達量，分析MSI2 mRNA表達水平與胃癌的臨床病理學特征進行相關性分析。結果提示，MSI2 mRNA表達水平和腫瘤浸潤深度（P=0.017）、TNM分期（P=0.028）、分化程度（P=0.020）及腫瘤大小（P=0.030）相關，與其他臨床病理因素如患者的性別、年齡及腫瘤部位無關（表 1）。
表1
胃癌組織中MSI2 mRNA表達與其臨床病理因素的關系
2.3 MSl2 mRNA表達與胃癌患者術后總體生存率的關系67例胃癌患者均獲隨訪，隨訪時間9～34個月，均數26.164個月。胃癌組織與相應癌旁組織中MSI2 mRNA相對表達量之比≥2倍者（高表達者）42例，< 2倍者（低表達者）25例；高表達者的總體生存率顯著低于低表達者，差異有統計學意義(χ2=4.221，P=0.040)，見圖 3。
圖3
不同MSI2 mRNA相對表達量的胃癌患者生存曲線
3 討論
胃癌作為一種常見的惡性疾病，多年來發病率及致死率居高不下，預后差。因此，探尋與胃癌相關的分子標志物，并尋找胃癌治療的新途徑具有重要的臨床意義。表達于祖細胞和干細胞的MSI2家族能夠促進惡性髓性白血病發生發展[7]，在急性淋巴細胞性白血病中呈高表達，并與其預后和生存率密切相關[14]。MSI2在慢性髓性白血病慢性期呈低表達，但在急性期出現表達上調[15]。通過沉默下調MSI2表達可以降低急性髓性白血病活性，并提高其柔紅霉素治療的敏感性[16]。MSI2也被證實在多種成人腫瘤中有異常表達，并參與腫瘤的發生發展[10]。MSI2在食管癌[11]、結腸癌[17-19]、肺癌[20-21]、乳腺癌[22]、肝細胞癌[13, 23-24]、胰腺癌[12]、惡性膠質瘤[11]、腦膜癌[25]等組織中表達上調，并參與腫瘤的發生，其表達與患者的腫瘤大小、脈管侵犯、侵襲、轉移、復發等臨床病理因素相關。MSI2在結腸腺癌中扮演促癌基因的作用，能夠促進腸黏膜細胞的轉化，并通過多種途徑抑制Lrig1、Bmpr1a、Cdkn1a、Pten等抑癌基因而發揮作用，進一步促進結腸腺癌的發生發展[17]。然而，在胃癌研究中，Emadi-Baygi等[26]證實，MSI2在胃癌組織和癌旁組織間表達無差異，但在Ⅱ期患者中表達較Ⅰ期下調。樣本量的擴大將有助于進一步明確MSI2在胃癌中的表達水平。
本研究檢測了MSI2 mRNA在67例胃癌組織及其癌旁組織中的表達水平，并分析其表達水平與胃癌臨床病理特征的關系。結果顯示，MSI2 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平差異無統計學意義；進一步研究MSI2 mRNA表達水平與胃癌臨床病理學特征的關系，發現MSI2 mRNA高表達者（胃癌組織與相應癌旁組織中MSI2 mRNA表達水平之比≥2倍）的比例在T1+T2期患者為37.5%（6/16），在T3+T4患者中為70.6%（36/51）；在Ⅰ+Ⅱ期患者中為42.1%（8/19），在Ⅲ+Ⅳ期患者中為70.8%（34/48）；在高分化至中-低分化患者中為50.0%（14/28），在低分化患者中為83.9%（26/31）；在腫瘤切面積≤4 cm2患者為42.3%（11/26），在切面積> 4 cm2患者中為75.6%（31/41）。該結果提示，MSI2 mRNA的相對表達水平與胃癌侵襲深度、腫瘤分期、腫瘤分化程度及腫瘤大小相關，MSI2 mRNA表達水平越高的患者，其腫瘤侵襲越深、TNM分期越晚、分化程度越差、腫瘤也越大。進一步篩選其中MSI2 mRNA表達上調的8例患者，檢測其MSI2蛋白的表達水平，結果顯示MSI2蛋白表達水平與mRNA表達水平基本一致。MSI2表達上調與胃癌相關臨床病理學因素的關系分析結果提示，MSI2可能在胃癌中扮演著癌基因的作用，能夠促進胃癌的發生發展和侵襲。高志剛等[12]在胰腺癌中證實，MSI2在胰腺癌組織中呈高表達，其表達水平與腫瘤大小相關，并且影響患者的預后。本研究結果也提示，MSI2 mRNA在胃癌組織中的相對表達水平與患者的預后相關。雖然MSI2在胃癌中發揮作用的機理目前尚不明確，但是進一步探索其功能與作用，可能成為胃癌潛在的分子標志物，為未來胃癌的診治提供新的治療靶點。
胃癌是一種常見的影響人類健康的消化系統惡性疾病，在惡性腫瘤中發病率位居第5，在腫瘤相關性死亡中位居第3 [1-2]，而在發展中國家男性患者腫瘤相關性疾病中位居首位[3]。近年來，我國胃癌的死亡率有所下降，但是胃癌的診斷和治療依舊是腫瘤診治的一個核心負擔[4]。目前，胃癌的治療以手術為主，但是術后患者的預后依然很差；而在診斷方面，因缺乏特異性的標志物，胃癌患者多在晚期被發現或就診。胃癌的發生發展是一個多步驟多基因參與的復雜生物學過程，因此，篩選胃癌發生發展相關分子、探尋胃癌發生機理并有效地干預，是胃癌早期診斷和治療的重要策略。
RNA結合蛋白Musashi2（MSl2）是Musashi大家族的一員，是干細胞和早期祖細胞的重要分子標志物[5-6]。生理情況下MSI2在造血干細胞中大量表達并參與造血的調控，MSI2缺失會阻止造血干細胞自我更新并誘導其分化；在髓性白血病中，MSI2異常高表達、促進細胞的增值并影響白血病的預后[7-9]。MSI2在成人腫瘤發生過程中存在差異表達[10]，如在惡性膠質瘤[11]、胰腺癌[12]及肝細胞癌[13]中表達明顯高于癌旁組織，并且其表達水平與腫瘤的大小、脈管侵犯以及早期復發密切相關。本研究擬通過實時定量PCR方法檢測67例胃癌患者腫瘤組織和癌旁組織中MSI2 mRNA的表達水平，并應用Western blot方法對其中8例患者的MSI2蛋白表達水平進行檢測，分析MSI2表達水平與胃癌臨床病理學特征的關系，初步探討MSI2對胃癌發生發展的影響。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
收集山東大學附屬省立醫院胃腸外科2012年1月至2012年12月期間收治的67例胃癌患者的腫瘤標本。通過醫院病案查詢系統完善67例患者的臨床病理資料，選取了包括患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤侵襲深度、分期、分化程度以及大小。本研究獲山東大學附屬醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。
1.2 主要試劑
RNAiso試劑、逆轉錄試劑盒及SYBGreen購自Takara生物公司；兔抗人MSI2購自Abcam公司（貨號ab76148）；化學發光顯影液由MILLIPORE公司提供。
1.3 方法
1.3.1 胃癌組織中MSI2 mRNA表達水平檢測
采用實時定量PCR方法。通過RNAiso提取液氮中儲存胃癌組織的總RNA，分別根據說明書用逆轉錄試劑盒和SYBGreen擴增目的MSI2片段。引物均由Takara公司合成。MSI2上游引物為5?-GCAACGGC-CTTTACAAATGGATAC-3?，下游引物為5?-CAGGT-CTGAGGACATCACCTAAACA-3?；內參GAPDH上游引物為5?-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3?，下游引物為5?-TGGTGAAGACGCCAGT GGA-3?。所有反應均設3個復空，以DEPC水代替模板cDNA作為空白對照。實時PCR反應體系：Takara SYBR?PremixEx Taq（Tli RNaseH Plus）2×10μg，10μmol/L上下游引物各0.4μL，cDNA 2μL，H2O 7.2μL；反應條件：95℃30 s變性，95℃5 s、60℃30 s，擴增40個循環。通過分析MSI2 mRNA表達水平與胃癌臨床病理學特征之間的關系，探尋對胃癌發生發展的影響。
1.3.2 胃癌組織及其癌旁組織中MSI2蛋白表達的檢測
胃癌及其癌旁組織儲存于液氮中，選取PCR中高表達組樣本8對，采用Western blot蛋白免疫印跡法檢測MSI2蛋白的表達。每泳道上樣60μg蛋白樣品，用SDS丙烯酰胺電泳后電轉移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。用GE公司ImageQuant LAS 4000凝膠成像顯影。通過條帶灰度值定量相應蛋白表達水平。
1.4 統計學方法
采用SPSS 21.0統計軟件對數據進行分析，結果圖由GraphPad Prism 5.0軟件輸出。計數資料采用χ2檢驗，分析胃癌組織中MSI2 mRNA的表達與其臨床病理特征間的關系。Kaplan-Meier單因素分析計算累積生存率，生存期差異行log-rank檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MSI2在胃癌及其癌旁組織中的表達情況
首先對67例胃癌患者的癌組織及其癌旁組織行實時定量PCR檢測，結果提示MSI2 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中的相對表達量的差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 1。然后再從上述67例患者中選取mRNA水平高表達的8例行蛋白免疫印跡實驗，結果顯示，MSI2蛋白在此8例胃癌組織中的表達水平均上調（圖 2）。
圖1
示67例胃癌組織及其癌旁組織中MSI2 mRNA的表達結果??圖 2?示8例MSI2 mRNA高表達胃癌患者的MSI2蛋白表達結果。T：腫瘤組織；N：癌旁組織
2.2 MSI2 mRNA的表達與胃癌臨床病理學特征間的關系
將胃癌組織與相應癌旁組織MSI2 mRNA表達水平之比作為MSI2相對表達量，分析MSI2 mRNA表達水平與胃癌的臨床病理學特征進行相關性分析。結果提示，MSI2 mRNA表達水平和腫瘤浸潤深度（P=0.017）、TNM分期（P=0.028）、分化程度（P=0.020）及腫瘤大小（P=0.030）相關，與其他臨床病理因素如患者的性別、年齡及腫瘤部位無關（表 1）。
表1
胃癌組織中MSI2 mRNA表達與其臨床病理因素的關系
2.3 MSl2 mRNA表達與胃癌患者術后總體生存率的關系67例胃癌患者均獲隨訪，隨訪時間9～34個月，均數26.164個月。胃癌組織與相應癌旁組織中MSI2 mRNA相對表達量之比≥2倍者（高表達者）42例，< 2倍者（低表達者）25例；高表達者的總體生存率顯著低于低表達者，差異有統計學意義(χ2=4.221，P=0.040)，見圖 3。
圖3
不同MSI2 mRNA相對表達量的胃癌患者生存曲線
3 討論
胃癌作為一種常見的惡性疾病，多年來發病率及致死率居高不下，預后差。因此，探尋與胃癌相關的分子標志物，并尋找胃癌治療的新途徑具有重要的臨床意義。表達于祖細胞和干細胞的MSI2家族能夠促進惡性髓性白血病發生發展[7]，在急性淋巴細胞性白血病中呈高表達，并與其預后和生存率密切相關[14]。MSI2在慢性髓性白血病慢性期呈低表達，但在急性期出現表達上調[15]。通過沉默下調MSI2表達可以降低急性髓性白血病活性，并提高其柔紅霉素治療的敏感性[16]。MSI2也被證實在多種成人腫瘤中有異常表達，并參與腫瘤的發生發展[10]。MSI2在食管癌[11]、結腸癌[17-19]、肺癌[20-21]、乳腺癌[22]、肝細胞癌[13, 23-24]、胰腺癌[12]、惡性膠質瘤[11]、腦膜癌[25]等組織中表達上調，并參與腫瘤的發生，其表達與患者的腫瘤大小、脈管侵犯、侵襲、轉移、復發等臨床病理因素相關。MSI2在結腸腺癌中扮演促癌基因的作用，能夠促進腸黏膜細胞的轉化，并通過多種途徑抑制Lrig1、Bmpr1a、Cdkn1a、Pten等抑癌基因而發揮作用，進一步促進結腸腺癌的發生發展[17]。然而，在胃癌研究中，Emadi-Baygi等[26]證實，MSI2在胃癌組織和癌旁組織間表達無差異，但在Ⅱ期患者中表達較Ⅰ期下調。樣本量的擴大將有助于進一步明確MSI2在胃癌中的表達水平。
本研究檢測了MSI2 mRNA在67例胃癌組織及其癌旁組織中的表達水平，并分析其表達水平與胃癌臨床病理特征的關系。結果顯示，MSI2 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平差異無統計學意義；進一步研究MSI2 mRNA表達水平與胃癌臨床病理學特征的關系，發現MSI2 mRNA高表達者（胃癌組織與相應癌旁組織中MSI2 mRNA表達水平之比≥2倍）的比例在T1+T2期患者為37.5%（6/16），在T3+T4患者中為70.6%（36/51）；在Ⅰ+Ⅱ期患者中為42.1%（8/19），在Ⅲ+Ⅳ期患者中為70.8%（34/48）；在高分化至中-低分化患者中為50.0%（14/28），在低分化患者中為83.9%（26/31）；在腫瘤切面積≤4 cm2患者為42.3%（11/26），在切面積> 4 cm2患者中為75.6%（31/41）。該結果提示，MSI2 mRNA的相對表達水平與胃癌侵襲深度、腫瘤分期、腫瘤分化程度及腫瘤大小相關，MSI2 mRNA表達水平越高的患者，其腫瘤侵襲越深、TNM分期越晚、分化程度越差、腫瘤也越大。進一步篩選其中MSI2 mRNA表達上調的8例患者，檢測其MSI2蛋白的表達水平，結果顯示MSI2蛋白表達水平與mRNA表達水平基本一致。MSI2表達上調與胃癌相關臨床病理學因素的關系分析結果提示，MSI2可能在胃癌中扮演著癌基因的作用，能夠促進胃癌的發生發展和侵襲。高志剛等[12]在胰腺癌中證實，MSI2在胰腺癌組織中呈高表達，其表達水平與腫瘤大小相關，并且影響患者的預后。本研究結果也提示，MSI2 mRNA在胃癌組織中的相對表達水平與患者的預后相關。雖然MSI2在胃癌中發揮作用的機理目前尚不明確，但是進一步探索其功能與作用，可能成為胃癌潛在的分子標志物，為未來胃癌的診治提供新的治療靶點。
