引用本文： 沈豐, 孫少華, 吳紅偉, 胡洪生, 周文波, 王飛. 薏苡仁提取物對C57小鼠肝癌模型IL-6抑制作用的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(1): 38-41. doi: 10.7507/1007-9424.20160010 復制
原發性肝癌以肝細胞肝癌為主，是嚴重危害人類生命健康的重大疾病之一[1]。流行病學研究[2-4]表明，很多腫瘤的發生與慢性炎癥有關聯，而且持續性的無菌性炎癥可增加腫瘤發生的危險性并加速腫瘤的發展。臨床試驗[5-6]證明，薏苡仁提取物注射液對多種惡性腫瘤的治療效果明顯。鑒于薏苡仁提取物的獨特療效，加深對于這一制劑的分子生物學基礎的了解、探討其在肝癌發生發展過程中的抑制作用，將有助于提高薏苡仁提取物注射液在臨床的應用水平，增加評估預后的分子生物學指標。本研究觀察了薏苡仁提取物注射液（康萊特注射液）對C57小鼠肝癌模型成瘤率、腫瘤生長以及血清IL-6水平的影響，探討薏苡仁提取物在抑制肝癌發展中的重要作用。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
實驗動物為雄性C57小鼠，購自上海動物實驗中心；康萊特注射液（薏苡仁提取物注射液）購自浙江康萊特藥業有限公司；化學致癌物質二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）購自SIGMA公司，用于制備肝癌動物模型。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組及小鼠肝癌模型的制備
C57小鼠雄性10只，雌性20只，自行繁育后選取出生15 d的雄性C57小鼠52只，采用隨機分配的方法將小鼠分為4組：空白對照組（n=8），于小鼠出生第15天腹腔內注射生理鹽水2 mL/kg，1次/d, 每月注射21 d共8個月；DEN組（n=16），于小鼠出生第15天腹腔內注射DEN（25 mg/kg）1次；DEN+康萊特組（n=18），于小鼠出生第15天腹腔內注射DEN（25 mg/kg）1次，48 h后該組小鼠開始腹腔注射康萊特注射液2 mg/（kg· d），每月注射21 d共8個月；康萊特對照組（n=10），于鼠出生第17 d開始腹腔注射康萊特注射液2 mg/（kg· d），每月注射21 d共8個月。觀察4組小鼠的一般情況，包括：進食、活動情況（是否自如），毛皮光澤情況，監測體質量1次/3 d，并根據體質量測量結果調整用藥量，記錄各組死亡小鼠的數目。
1.2.2 小鼠血清收集
分別于小鼠出生的第15、17、60、120、180以及240天時采集4組小鼠鼠尾血：用拇指和食指從背部抓住小鼠頸部皮膚，將小鼠頭朝上，小鼠固定后將其尾巴置于50℃熱水中浸泡數分鐘，使其尾部血管充盈；擦干尾部，再用刀片切去尾尖2 mm長，用試管接流出的血液，同時自鼠尾根部向尾尖按摩。取血后用棉球壓迫鼠尾尖止血，每次采血量為0.1 mL，然后于-80℃超低溫冰箱保存以備IL-6檢測用。血清IL-6水平檢測采用Elisa法。
1.2.3 小鼠肝臟標本制作、HE染色、光鏡下檢查
所有實驗小鼠均于8月齡時終止實驗，斷頸處死，打開腹腔切取肝臟標本，測量腫瘤大小、觀查成瘤率。切除的肝臟經10%甲醛液固定、石蠟包埋切片、HE染色后光鏡下觀察肝臟組織的病理學改變。
1.3 統計學方法
實驗數據按完全隨機對照設計的要求收集整理，實驗所得數據以均數±標準誤（
2 結果
2.1 薏苡仁提取物對C57小鼠肝癌模型成瘤率及腫瘤生長的影響
空白對照組及康萊特對照組組小鼠的成瘤率均為0。DEN組1例小鼠于開始腹腔注射DEN第28天因腹瀉死亡，剖開腹腔見少量腹水，肝臟未見明顯結節；14例肝癌模型造模成功，DEN組成瘤率為87.5%（14/16）。DEN+康萊特組肝癌模型造模成功10例，無死亡小鼠，成瘤率為55.6%（10/18），與DEN組比較其成瘤率降低（P < 0.01）。DEN組14例肝癌模型中有8只小鼠肝臟腫瘤呈彌漫性（圖 1），腫瘤直徑為（0.8±0.06）cm，單個腫瘤最大直徑為0.88 cm（圖 2）。DEN+康萊特組小鼠腹腔內未見腹水，肝臟質地均勻，表面光滑，腫瘤直徑為（0.3±0.05）cm，單個腫瘤最大直徑為0.4 cm, 該組小鼠的腫瘤直徑明顯小于DEN組（P < 0.01）。小鼠肝癌組織光鏡下可見肝小葉結構消失，肝細胞以實性排列為主，見病理性核分裂像，間質內可見淋巴細胞浸潤，局部間質有出血（圖 3、圖 4）。
圖1
示DEN組肝臟彌漫性分布的腫瘤（黑箭）??圖 2?示DEN組肝臟最大的腫瘤（黑箭）??圖 3?示小鼠肝癌組織的病理學改變，黑箭所示為病理性核分裂像（HE×40）??圖 4?黑箭所示為肝癌組織內淋巴細胞浸潤（HE×200）
2.2 薏苡仁提取物對C57小鼠血清IL-6水平的影響
空白對照組與康萊特對照組小鼠血清IL-6水平各時間點比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。DEN組腹腔注射DEN后2 d（小鼠出生第17天）小鼠血清IL-6水平則明顯升高，與對照組組及康萊特對照組比較差異有統計學意義（P < 0.01）；小鼠出生第60天開始逐漸降低，但仍高于對照組組及康萊特對照組（P < 0.01）。DEN+康萊特組，在腹腔注射康萊特2個療程（小鼠出生第60天）后血清IL-6水平與DEN組比較明顯下降，差異有統計學意義（P < 0.01）。見表 1。
表1
各組小鼠出生后不同時相血清IL-6檢測結果（3 討論
19世紀普魯士科學家Rudolph Virchow首先提出了惡性腫瘤發展的炎性機理，他觀察到腫瘤經常發生在有持續性炎癥的地方，并且腫瘤組織經常存在炎性浸潤[7]。肝癌的發生與很多危險因素有關，其中炎癥是肝癌發生的主要原因之一[8]，肝細胞肝癌是經典的炎癥相關性腫瘤[9]。在肝癌與炎癥的關系中，炎癥因子IL-6目前備受關注。它是迄今為止發現的功能最為廣泛的細胞因子之一，也是機體內復雜的細胞因子網絡中的關鍵成員。在腫瘤的研究[10]中發現，IL-6的高表達和異常的信號通路與腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移密切相關。研究[11]表明，IL-6與肝癌關系密切。在乙醇性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、脂肪肝等慢性肝臟炎癥時血清中的IL-6濃度增高，并且高濃度的IL-6可能導致原發性肝癌的發生[12]。血清高水平IL-6預示著慢性乙型肝炎患者將來可能發展為原發性肝癌[13]。有學者[14]認為可將循環中IL-6作為原發性肝癌的一種腫瘤標志物。
臨床實驗[15-16]證明，薏苡仁提取物注射液對多種惡性腫瘤的治療效果明顯，并能顯著提高患者的免疫功能、改善患者的生存質量和延長生存期。1961年，日本東京大學學者Ukita Chunoshin首次發現荷瘤小鼠腹腔注射薏苡仁乙醇提取物能抑制艾氏腹水癌細胞的增殖，延長動物的生存時間，表現出明顯的抗腫瘤活性，并認為薏苡仁酯是其抗癌活性成分。本研究選擇的薏苡仁提取物注射液為康萊特注射液。
本研究依據Naugler等[17]研究結果選取出生15 d的雄性小鼠腹腔注射化學致癌物質DEN制作肝癌模型，其結果與Naugler等的觀察結果相似，肝癌模型造模順利，DEN組有14例腹腔注射DEN后肝癌模型造模成功，成瘤率達87.5%，切除的肝臟標本病理學檢查發現間質內有淋巴細胞浸潤，其血清IL-6水平明顯升高；但DEN+康萊特組腹腔注射薏苡仁提取物康萊特注射液后血清IL-6水平明顯降低，同時成瘤率亦下降、腫瘤直徑明顯小于DEN組，提示薏苡仁提取物對DEN處理C57小鼠肝癌模型IL-6有明顯的抑制作用。薏苡仁提取物降低血清IL-6水平可能影響到多個信號通路。PKCα是薏苡仁提取物的一個特定分子靶向，非細胞毒性劑量即可抑制此酶。有文獻[18]報道在裸鼠異種移植乳腺癌中這種PKC抑制作用可以造成核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）轉錄活性的降低。NF-κB被公認是癌癥治療的靶向，IL-1和TNF可通過核NF-κB誘導IL-6的基因表達。現已知NF-κB能進一步誘導IL-6產生，形成的TLR4-NF-κB-IL-6信號通路在肝癌的發生中起著關鍵的作用[19-21]。
由于炎癥反應還可以直接激活轉錄激活因子3（signal transducer and activators of transcription，STAT3）信號通路[22-23]，STAT3作為核轉錄因子，在腫瘤發生發展中有多方面的作用：①它可激活mcl-1、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細胞周期蛋白E1（cyclin E1）、c-fos基因、c-myc基因、c-jun轉錄調節因子等細胞周期和增殖基因。如cyclin D1的異常表達可以加速細胞周期循環，導致肝細胞持續異常增殖。②它可激活Bcl-xL、survivin等抗凋亡基因，減少肝細胞的凋亡、促進周圍肝細胞的增殖。STAT3還通過促進血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等因子的分泌增加為腫瘤的生長提供良好的微環境。推測薏苡仁提取物對IL-6的抑制作用可能影響到STAT3信號通路，但具體的分子機理尚不清楚，是否還有其他的影響機理參與也有待以后進一步的深入研究。還有，臨床中是否可以將血清IL-6作為肝癌一個評價指標尚需待臨床進一步驗證
原發性肝癌以肝細胞肝癌為主，是嚴重危害人類生命健康的重大疾病之一[1]。流行病學研究[2-4]表明，很多腫瘤的發生與慢性炎癥有關聯，而且持續性的無菌性炎癥可增加腫瘤發生的危險性并加速腫瘤的發展。臨床試驗[5-6]證明，薏苡仁提取物注射液對多種惡性腫瘤的治療效果明顯。鑒于薏苡仁提取物的獨特療效，加深對于這一制劑的分子生物學基礎的了解、探討其在肝癌發生發展過程中的抑制作用，將有助于提高薏苡仁提取物注射液在臨床的應用水平，增加評估預后的分子生物學指標。本研究觀察了薏苡仁提取物注射液（康萊特注射液）對C57小鼠肝癌模型成瘤率、腫瘤生長以及血清IL-6水平的影響，探討薏苡仁提取物在抑制肝癌發展中的重要作用。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
實驗動物為雄性C57小鼠，購自上海動物實驗中心；康萊特注射液（薏苡仁提取物注射液）購自浙江康萊特藥業有限公司；化學致癌物質二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）購自SIGMA公司，用于制備肝癌動物模型。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組及小鼠肝癌模型的制備
C57小鼠雄性10只，雌性20只，自行繁育后選取出生15 d的雄性C57小鼠52只，采用隨機分配的方法將小鼠分為4組：空白對照組（n=8），于小鼠出生第15天腹腔內注射生理鹽水2 mL/kg，1次/d, 每月注射21 d共8個月；DEN組（n=16），于小鼠出生第15天腹腔內注射DEN（25 mg/kg）1次；DEN+康萊特組（n=18），于小鼠出生第15天腹腔內注射DEN（25 mg/kg）1次，48 h后該組小鼠開始腹腔注射康萊特注射液2 mg/（kg· d），每月注射21 d共8個月；康萊特對照組（n=10），于鼠出生第17 d開始腹腔注射康萊特注射液2 mg/（kg· d），每月注射21 d共8個月。觀察4組小鼠的一般情況，包括：進食、活動情況（是否自如），毛皮光澤情況，監測體質量1次/3 d，并根據體質量測量結果調整用藥量，記錄各組死亡小鼠的數目。
1.2.2 小鼠血清收集
分別于小鼠出生的第15、17、60、120、180以及240天時采集4組小鼠鼠尾血：用拇指和食指從背部抓住小鼠頸部皮膚，將小鼠頭朝上，小鼠固定后將其尾巴置于50℃熱水中浸泡數分鐘，使其尾部血管充盈；擦干尾部，再用刀片切去尾尖2 mm長，用試管接流出的血液，同時自鼠尾根部向尾尖按摩。取血后用棉球壓迫鼠尾尖止血，每次采血量為0.1 mL，然后于-80℃超低溫冰箱保存以備IL-6檢測用。血清IL-6水平檢測采用Elisa法。
1.2.3 小鼠肝臟標本制作、HE染色、光鏡下檢查
所有實驗小鼠均于8月齡時終止實驗，斷頸處死，打開腹腔切取肝臟標本，測量腫瘤大小、觀查成瘤率。切除的肝臟經10%甲醛液固定、石蠟包埋切片、HE染色后光鏡下觀察肝臟組織的病理學改變。
1.3 統計學方法
實驗數據按完全隨機對照設計的要求收集整理，實驗所得數據以均數±標準誤（
2 結果
2.1 薏苡仁提取物對C57小鼠肝癌模型成瘤率及腫瘤生長的影響
空白對照組及康萊特對照組組小鼠的成瘤率均為0。DEN組1例小鼠于開始腹腔注射DEN第28天因腹瀉死亡，剖開腹腔見少量腹水，肝臟未見明顯結節；14例肝癌模型造模成功，DEN組成瘤率為87.5%（14/16）。DEN+康萊特組肝癌模型造模成功10例，無死亡小鼠，成瘤率為55.6%（10/18），與DEN組比較其成瘤率降低（P < 0.01）。DEN組14例肝癌模型中有8只小鼠肝臟腫瘤呈彌漫性（圖 1），腫瘤直徑為（0.8±0.06）cm，單個腫瘤最大直徑為0.88 cm（圖 2）。DEN+康萊特組小鼠腹腔內未見腹水，肝臟質地均勻，表面光滑，腫瘤直徑為（0.3±0.05）cm，單個腫瘤最大直徑為0.4 cm, 該組小鼠的腫瘤直徑明顯小于DEN組（P < 0.01）。小鼠肝癌組織光鏡下可見肝小葉結構消失，肝細胞以實性排列為主，見病理性核分裂像，間質內可見淋巴細胞浸潤，局部間質有出血（圖 3、圖 4）。
圖1
示DEN組肝臟彌漫性分布的腫瘤（黑箭）??圖 2?示DEN組肝臟最大的腫瘤（黑箭）??圖 3?示小鼠肝癌組織的病理學改變，黑箭所示為病理性核分裂像（HE×40）??圖 4?黑箭所示為肝癌組織內淋巴細胞浸潤（HE×200）
2.2 薏苡仁提取物對C57小鼠血清IL-6水平的影響
空白對照組與康萊特對照組小鼠血清IL-6水平各時間點比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。DEN組腹腔注射DEN后2 d（小鼠出生第17天）小鼠血清IL-6水平則明顯升高，與對照組組及康萊特對照組比較差異有統計學意義（P < 0.01）；小鼠出生第60天開始逐漸降低，但仍高于對照組組及康萊特對照組（P < 0.01）。DEN+康萊特組，在腹腔注射康萊特2個療程（小鼠出生第60天）后血清IL-6水平與DEN組比較明顯下降，差異有統計學意義（P < 0.01）。見表 1。
表1
各組小鼠出生后不同時相血清IL-6檢測結果（3 討論
19世紀普魯士科學家Rudolph Virchow首先提出了惡性腫瘤發展的炎性機理，他觀察到腫瘤經常發生在有持續性炎癥的地方，并且腫瘤組織經常存在炎性浸潤[7]。肝癌的發生與很多危險因素有關，其中炎癥是肝癌發生的主要原因之一[8]，肝細胞肝癌是經典的炎癥相關性腫瘤[9]。在肝癌與炎癥的關系中，炎癥因子IL-6目前備受關注。它是迄今為止發現的功能最為廣泛的細胞因子之一，也是機體內復雜的細胞因子網絡中的關鍵成員。在腫瘤的研究[10]中發現，IL-6的高表達和異常的信號通路與腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移密切相關。研究[11]表明，IL-6與肝癌關系密切。在乙醇性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、脂肪肝等慢性肝臟炎癥時血清中的IL-6濃度增高，并且高濃度的IL-6可能導致原發性肝癌的發生[12]。血清高水平IL-6預示著慢性乙型肝炎患者將來可能發展為原發性肝癌[13]。有學者[14]認為可將循環中IL-6作為原發性肝癌的一種腫瘤標志物。
臨床實驗[15-16]證明，薏苡仁提取物注射液對多種惡性腫瘤的治療效果明顯，并能顯著提高患者的免疫功能、改善患者的生存質量和延長生存期。1961年，日本東京大學學者Ukita Chunoshin首次發現荷瘤小鼠腹腔注射薏苡仁乙醇提取物能抑制艾氏腹水癌細胞的增殖，延長動物的生存時間，表現出明顯的抗腫瘤活性，并認為薏苡仁酯是其抗癌活性成分。本研究選擇的薏苡仁提取物注射液為康萊特注射液。
本研究依據Naugler等[17]研究結果選取出生15 d的雄性小鼠腹腔注射化學致癌物質DEN制作肝癌模型，其結果與Naugler等的觀察結果相似，肝癌模型造模順利，DEN組有14例腹腔注射DEN后肝癌模型造模成功，成瘤率達87.5%，切除的肝臟標本病理學檢查發現間質內有淋巴細胞浸潤，其血清IL-6水平明顯升高；但DEN+康萊特組腹腔注射薏苡仁提取物康萊特注射液后血清IL-6水平明顯降低，同時成瘤率亦下降、腫瘤直徑明顯小于DEN組，提示薏苡仁提取物對DEN處理C57小鼠肝癌模型IL-6有明顯的抑制作用。薏苡仁提取物降低血清IL-6水平可能影響到多個信號通路。PKCα是薏苡仁提取物的一個特定分子靶向，非細胞毒性劑量即可抑制此酶。有文獻[18]報道在裸鼠異種移植乳腺癌中這種PKC抑制作用可以造成核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）轉錄活性的降低。NF-κB被公認是癌癥治療的靶向，IL-1和TNF可通過核NF-κB誘導IL-6的基因表達。現已知NF-κB能進一步誘導IL-6產生，形成的TLR4-NF-κB-IL-6信號通路在肝癌的發生中起著關鍵的作用[19-21]。
由于炎癥反應還可以直接激活轉錄激活因子3（signal transducer and activators of transcription，STAT3）信號通路[22-23]，STAT3作為核轉錄因子，在腫瘤發生發展中有多方面的作用：①它可激活mcl-1、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細胞周期蛋白E1（cyclin E1）、c-fos基因、c-myc基因、c-jun轉錄調節因子等細胞周期和增殖基因。如cyclin D1的異常表達可以加速細胞周期循環，導致肝細胞持續異常增殖。②它可激活Bcl-xL、survivin等抗凋亡基因，減少肝細胞的凋亡、促進周圍肝細胞的增殖。STAT3還通過促進血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等因子的分泌增加為腫瘤的生長提供良好的微環境。推測薏苡仁提取物對IL-6的抑制作用可能影響到STAT3信號通路，但具體的分子機理尚不清楚，是否還有其他的影響機理參與也有待以后進一步的深入研究。還有，臨床中是否可以將血清IL-6作為肝癌一個評價指標尚需待臨床進一步驗證
