引用本文： 張舒, 呂青. 脂肪干細胞在脂肪組織修復重建中的應用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(9): 1148-1152. doi: 10.7507/1007-9424.20150298 復制
乳腺癌為我國女性發病率最高的惡性腫瘤[1]，每年有大量女性患者接受乳腺切除手術，術后乳房的缺損給女性患者的身心帶來極大負擔。目前臨床修復乳房的方法主要包括：人工材料填充、傳統組織瓣手術以及自體脂肪移植三類。但是這些方法都存在各自的局限性：人工填充材料的組織相容性較差，可導致纖維囊包裹、炎性肉芽腫、假體破裂等并發癥[2]；自體脂肪移植由于移植的脂肪顆粒缺乏足夠的新生血管滋養，導致移植物壞死率和吸收率高[3]；自體游離組織瓣雖然存活率高，但會給患者造成新的創傷。脂肪是塑造乳房形態的重要構成，脂肪組織工程通過構建天然脂肪組織，有望解決乳房修復重建的難題。組織工程即是構建種子細胞與生物支架材料復合形成的細胞-材料復合物，在體內，這種生物支架材料逐漸降解的同時，周圍細胞不斷增殖分化，形成新的形態、功能與修復組織一致的替代組織，從而達到修復創傷和重建功能的目的[4]。組織工程的三大要素包括生物材料、細胞因子和干細胞，其中對干細胞的研究是重建醫學的重要挑戰。干細胞包括胚胎干細胞、多能干細胞以及成體干細胞，是一類具有自我更新和多項分化潛能的細胞。適用于組織工程的干細胞需要滿足以下條件[5]：來源充足、采集方便及可通過微創的方式獲取；其多項分化能力可調節可控制；自體或異體移植安全高效；可規模化的進行人工生產。骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是最早被認識的全能干細胞，但由于其體內儲存量較小、提取創傷大，因此實用性受限。脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs），又名脂肪間充質干細胞（adipose mesenchymal stem cells，AdMSCs）、成脂細胞（lipoblast）、前脂肪細胞（preadipocyte）或抽脂組織提取細胞（PLA），系指從脂肪組織中通過膠原酶消化后得到的一類貼壁細胞。ADSCs富含于人體體表脂肪組織中，來源充足，通過吸脂術采集安全且創傷小，加之其在成脂分化方面的突出優勢，ADSCs在脂肪組織工程中被廣泛關注。筆者通過復習國內外的ADSCs相關文獻，探討其在脂肪組織修復重建中的作用。
1 ADSCs的生物學特性
脂肪組織是一種含有復雜成分的組織，其中90%為成熟脂肪細胞，另還含有前脂肪細胞、成纖維細胞、血管上皮細胞、血管平滑肌細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等[6]。脂肪組織中的干細胞儲備量高于其他組織，一般情況下，一次門診局麻下的吸脂手術即可抽取0.3～1.0 L脂肪組織，而每抽取300 mL的脂肪組織就可提取1×107個ADSCs [7]。換句話說，每克脂肪組織可產出大約5 000纖維母細胞克隆形成單位（CFU-F）的ADSCs，而每毫升骨髓僅產出約100～1 000 CFU-F干細胞[8]，可見ADSCs有著豐富的來源。
體表脂肪組織經膠原酶消化，低速離心后去除成熟脂肪細胞、脂滴以及纖維結締組織后，留下間充質血管細胞部分（stromal-vascular cell fraction，SVF）。將SVF置于培養瓶中培養24 h后移除紅細胞，用含10%胎牛血清的基礎培養基培養，貼壁生長的細胞即為ADSCs [9]。貼壁的ADSCs呈長梭形或紡錘狀，胞漿內缺乏脂滴，形態與成纖維細胞相似，在培養瓶內單層展開[10]。通過對SVF的表型進行分析，發現SVF中主要存在三類細胞：表達CD31-/CD34+/CD45-/CD90+/CD105-/CD146-的ADSCs、表達CD31+/CD34+/CD45-/CD90+/CD105-/CD146+的內皮祖細胞以及表達CD31-/CD34+/CD45-/CD90+/CD105-/CD146+的周細胞[11]。Mitchell等[12]發現，大約有0.8%～54.0%的ADSCs在早期可表達一些間質細胞的經典標志物，如CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105及CD166；且隨著細胞增殖傳代，這些標志物的表達率不斷增高，到后期間質細胞標志物的表達陽性率高達98%。但是目前仍未找到ADSCs特異性的免疫表型，對ADSCs的鑒定可參考BMSCs的鑒定標準：①在標準培養條件下貼壁生長的細胞；②具有成骨、成脂、成軟骨等多向分化能力；③表達CD73、CD90和CD105；④表達干細胞標志物，如干細胞因子受體（c-kit）、CD14、CD11b、CD34、CD45、CD19、CD79或人白細胞抗原（HLA）-DR [13]。值得注意的是，ADSCs與BMSCs的表型并非完全相同，例如CD34在分離培養ADSCs的早期階段可呈陽性表達，而在BMSCs中則始終不表達。
ADSCs的生物學特性受到供體年齡、部位等多種因素的影響。白色脂肪組織中ADSCs的含量高于內臟脂肪組織，上臂高于腹股溝[14]；供者年齡越小其ADSCs的增殖能力越強，更容易分化為成熟脂肪細胞；上腹壁脂肪組織中的ADSCs的抗凋亡能力強于上臂、大腿內側以及腹腔內脂肪組織，故上腹壁ADSCs的體外培養存活率更高[15]。
2 ADSCs的多向分化能力
作為多能干細胞，ADSCs在不同條件下可誘導分化為脂肪[9, 16]、軟骨[17]、骨[18]、心肌[19]、肌肉[20]、血管、上皮細胞[21]、神經系統細胞[22]等多種組織細胞。ADSCs的表觀基因組中有脂肪形成的啟動因子，證明ADSCs有向脂肪細胞譜系分化的傾向[23]。雞尾酒培養基（含3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松和胰島素） 可誘導ADSCs體外向成熟脂肪細胞分化[16]。培養基中添加環格列酮和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ （PPAR-γ）激動劑[15]，或通過對ADSCs生長的微環境進行調控，如使用適當的支架材料或添加特定的細胞因子[24-26]，均可促進ADSCs的成脂分化。
ADSCs在形態學和功能上被證實能向前神經細胞分化[25]。神經細胞一直被認為是非再生組織，這一發現有望給神經系統的損傷修復帶來希望。有研究者[26]將ADSCs靜脈注射至脊髓受傷的動物模型體內，發現ADSCs出現向受傷部位遷移并向神經細胞轉化的現象。另外，有臨床前期研究[27]表明，大腦缺血和出血的患者接受靜脈注射ADSCs治療后其腦積水和腦萎縮的發生減少，提示無論在功能上還是在組織學上均取得了較滿意的治療結果。
ADSCs也被用于心肌梗塞治療的研究。Gaustad等[27]將人ADSCs暴露于兔心肌細胞提取物中，并通過形態學、免疫組織化學和自主搏動性實驗證實了ADSCs能向心肌細胞分化。Yamada等[28]在體外誘導ADSCs使其具有心肌細胞的形態，并將其注射至心肌梗塞的動物模型體內，發現ADSCs有利于心臟結構和功能的恢復。
除此之外，ADSCs還具有向內胚層細胞分化的潛能。研究[29-30]表明，ADSCs可表達類似肝細胞的表型特征，并且可分泌肝細胞生長因子（HGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），因此ADSCs有望應用到肝炎和肝硬變的治療中，以修復受損的肝細胞。此外，將ADSCs暴露于煙酰胺、HGF和五肽胃泌素后，ADSCs表現出類似胰腺的功能，分泌胰島素、胰高血糖素和生長激素抑制素[31]，這可能為內分泌疾病的治療提供了新思路。
3 ADSCs的促血管化作用
自體脂肪移植術由于游離脂肪組織不能及時生成滋養血管以提供養分，導致移植物缺血壞死和吸收，使得脂肪移植的臨床應用受限。在組織工程的研究中如何提高移植物的血管化能力也是一個難點。多項研究[32-35]表明，ADSCs具有促進組織血管形成的作用。首先，ADSCs在低氧環境下能分泌多種與血管化相關的細胞因子，如血管上皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維生長因子2 （FGF-2）、HGF和胎盤生長因子，這些血管化相關的細胞因子可促進血管生長。其次，ADSCs主要位于脂肪毛細血管的血管壁上，并且具有一些周細胞的特征，對內皮細胞的形成具有協同作用。故ADSCs不僅可以穩定內皮網絡，還有利于血管網的形成和重塑[36]。此外，ADSCs經誘導可分化為血管上皮細胞[37]，直接參與血管壁的形成，從而有利于血管化。
4 ADSCs在脂肪組織修復重建中的應用前景和展望
ADSCs作為人體儲量最豐富的間充質干細胞，已作為種子細胞被應用到脂肪組織工程的研究中。多項研究[38-40]證實，復合了ADSCs的生物材料內出現更多成熟脂肪細胞和新生微血管。ADSCs很容易誘導成脂，并且經過多次傳代后依然具有成脂分化能力，在大面積燒傷、創傷等造成脂肪來源緊張的情況下，成熟脂肪細胞無法進行體外擴增，利用ADSCs增殖后再誘導分化成脂可有效地提供更多的白色脂肪組織。更重要的是，ADSCs不僅在形態上向脂肪細胞分化，還能表現出一些成熟脂肪細胞的功能，如成脂分化的ADSCs在兒茶酚胺的刺激下可脂解，在α腎上腺素的介導下抗脂解，并且能分泌脂聯素、瘦素等脂肪因子[41]，故ADSCs是脂肪組織工程理想的種子細胞。
ADSCs旁分泌多種細胞因子和生長因子，可招募宿主干細胞并促進其分化；同時ADSCs的抗缺氧能力強于成熟脂肪細胞[42]，ADSCs在低氧狀態下能產生抗氧化物質、自由基清除劑及熱休克蛋白，以清除組織缺氧產生的有害物質，從而有利于軟組織的創傷后修復[43]。研究[44-45]表明，ADSCs在放療后軟組織損傷的治療中，可促進脂肪血管化和真皮修復，減少軟組織感染。將ADSCs注射至糖尿病型潰瘍的動物模型中，可加速潰瘍的愈合[46]。
目前自體脂肪組織移植已被廣泛用于乳腺癌術后的乳房重建中，但由于游離脂肪組織不能快速血管化，較高的壞死吸收率影響了其治療效果。將ADSCs應用于脂肪組織移植術中，ADSCs分泌的VEGF、FGF-2、HGF等細胞因子可促進移植物血管化，從而提高脂肪細胞的存活率，使移植物的體積得以更好地維持。雖然多個臨床觀察研究[47-49]均表明，在乳腺癌患者術后的脂肪組織移植治療中應用ADSCs是安全有效的，但是有基礎研究表明，間充質干細胞可促進腫瘤細胞增殖，減少其凋亡[50]，有增加腫瘤復發和轉移的潛在風險[51]，且高濃度的ADSCs可造成移植物更顯著的纖維化[52]。可見ADSCs的臨床應用還需要更多相關研究的支持和指導。
5 小結
ADSCs可從皮下脂肪組織中反復多次提取，有充足的來源，分離培養容易。ADSCs可向多種中胚層組織分化，并且具有較強的成脂分化能力。ADSCs的旁分泌功能可促進脂肪組織的血管化，可提高移植組織的存活率。由此可見，ADSCs在脂肪組織工程、游離脂肪組織移植、脂肪軟組織創傷修復等方面均具有廣闊的應用前景。
乳腺癌為我國女性發病率最高的惡性腫瘤[1]，每年有大量女性患者接受乳腺切除手術，術后乳房的缺損給女性患者的身心帶來極大負擔。目前臨床修復乳房的方法主要包括：人工材料填充、傳統組織瓣手術以及自體脂肪移植三類。但是這些方法都存在各自的局限性：人工填充材料的組織相容性較差，可導致纖維囊包裹、炎性肉芽腫、假體破裂等并發癥[2]；自體脂肪移植由于移植的脂肪顆粒缺乏足夠的新生血管滋養，導致移植物壞死率和吸收率高[3]；自體游離組織瓣雖然存活率高，但會給患者造成新的創傷。脂肪是塑造乳房形態的重要構成，脂肪組織工程通過構建天然脂肪組織，有望解決乳房修復重建的難題。組織工程即是構建種子細胞與生物支架材料復合形成的細胞-材料復合物，在體內，這種生物支架材料逐漸降解的同時，周圍細胞不斷增殖分化，形成新的形態、功能與修復組織一致的替代組織，從而達到修復創傷和重建功能的目的[4]。組織工程的三大要素包括生物材料、細胞因子和干細胞，其中對干細胞的研究是重建醫學的重要挑戰。干細胞包括胚胎干細胞、多能干細胞以及成體干細胞，是一類具有自我更新和多項分化潛能的細胞。適用于組織工程的干細胞需要滿足以下條件[5]：來源充足、采集方便及可通過微創的方式獲取；其多項分化能力可調節可控制；自體或異體移植安全高效；可規模化的進行人工生產。骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是最早被認識的全能干細胞，但由于其體內儲存量較小、提取創傷大，因此實用性受限。脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs），又名脂肪間充質干細胞（adipose mesenchymal stem cells，AdMSCs）、成脂細胞（lipoblast）、前脂肪細胞（preadipocyte）或抽脂組織提取細胞（PLA），系指從脂肪組織中通過膠原酶消化后得到的一類貼壁細胞。ADSCs富含于人體體表脂肪組織中，來源充足，通過吸脂術采集安全且創傷小，加之其在成脂分化方面的突出優勢，ADSCs在脂肪組織工程中被廣泛關注。筆者通過復習國內外的ADSCs相關文獻，探討其在脂肪組織修復重建中的作用。
1 ADSCs的生物學特性
脂肪組織是一種含有復雜成分的組織，其中90%為成熟脂肪細胞，另還含有前脂肪細胞、成纖維細胞、血管上皮細胞、血管平滑肌細胞、單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等[6]。脂肪組織中的干細胞儲備量高于其他組織，一般情況下，一次門診局麻下的吸脂手術即可抽取0.3～1.0 L脂肪組織，而每抽取300 mL的脂肪組織就可提取1×107個ADSCs [7]。換句話說，每克脂肪組織可產出大約5 000纖維母細胞克隆形成單位（CFU-F）的ADSCs，而每毫升骨髓僅產出約100～1 000 CFU-F干細胞[8]，可見ADSCs有著豐富的來源。
體表脂肪組織經膠原酶消化，低速離心后去除成熟脂肪細胞、脂滴以及纖維結締組織后，留下間充質血管細胞部分（stromal-vascular cell fraction，SVF）。將SVF置于培養瓶中培養24 h后移除紅細胞，用含10%胎牛血清的基礎培養基培養，貼壁生長的細胞即為ADSCs [9]。貼壁的ADSCs呈長梭形或紡錘狀，胞漿內缺乏脂滴，形態與成纖維細胞相似，在培養瓶內單層展開[10]。通過對SVF的表型進行分析，發現SVF中主要存在三類細胞：表達CD31-/CD34+/CD45-/CD90+/CD105-/CD146-的ADSCs、表達CD31+/CD34+/CD45-/CD90+/CD105-/CD146+的內皮祖細胞以及表達CD31-/CD34+/CD45-/CD90+/CD105-/CD146+的周細胞[11]。Mitchell等[12]發現，大約有0.8%～54.0%的ADSCs在早期可表達一些間質細胞的經典標志物，如CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105及CD166；且隨著細胞增殖傳代，這些標志物的表達率不斷增高，到后期間質細胞標志物的表達陽性率高達98%。但是目前仍未找到ADSCs特異性的免疫表型，對ADSCs的鑒定可參考BMSCs的鑒定標準：①在標準培養條件下貼壁生長的細胞；②具有成骨、成脂、成軟骨等多向分化能力；③表達CD73、CD90和CD105；④表達干細胞標志物，如干細胞因子受體（c-kit）、CD14、CD11b、CD34、CD45、CD19、CD79或人白細胞抗原（HLA）-DR [13]。值得注意的是，ADSCs與BMSCs的表型并非完全相同，例如CD34在分離培養ADSCs的早期階段可呈陽性表達，而在BMSCs中則始終不表達。
ADSCs的生物學特性受到供體年齡、部位等多種因素的影響。白色脂肪組織中ADSCs的含量高于內臟脂肪組織，上臂高于腹股溝[14]；供者年齡越小其ADSCs的增殖能力越強，更容易分化為成熟脂肪細胞；上腹壁脂肪組織中的ADSCs的抗凋亡能力強于上臂、大腿內側以及腹腔內脂肪組織，故上腹壁ADSCs的體外培養存活率更高[15]。
2 ADSCs的多向分化能力
作為多能干細胞，ADSCs在不同條件下可誘導分化為脂肪[9, 16]、軟骨[17]、骨[18]、心肌[19]、肌肉[20]、血管、上皮細胞[21]、神經系統細胞[22]等多種組織細胞。ADSCs的表觀基因組中有脂肪形成的啟動因子，證明ADSCs有向脂肪細胞譜系分化的傾向[23]。雞尾酒培養基（含3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松和胰島素） 可誘導ADSCs體外向成熟脂肪細胞分化[16]。培養基中添加環格列酮和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ （PPAR-γ）激動劑[15]，或通過對ADSCs生長的微環境進行調控，如使用適當的支架材料或添加特定的細胞因子[24-26]，均可促進ADSCs的成脂分化。
ADSCs在形態學和功能上被證實能向前神經細胞分化[25]。神經細胞一直被認為是非再生組織，這一發現有望給神經系統的損傷修復帶來希望。有研究者[26]將ADSCs靜脈注射至脊髓受傷的動物模型體內，發現ADSCs出現向受傷部位遷移并向神經細胞轉化的現象。另外，有臨床前期研究[27]表明，大腦缺血和出血的患者接受靜脈注射ADSCs治療后其腦積水和腦萎縮的發生減少，提示無論在功能上還是在組織學上均取得了較滿意的治療結果。
ADSCs也被用于心肌梗塞治療的研究。Gaustad等[27]將人ADSCs暴露于兔心肌細胞提取物中，并通過形態學、免疫組織化學和自主搏動性實驗證實了ADSCs能向心肌細胞分化。Yamada等[28]在體外誘導ADSCs使其具有心肌細胞的形態，并將其注射至心肌梗塞的動物模型體內，發現ADSCs有利于心臟結構和功能的恢復。
除此之外，ADSCs還具有向內胚層細胞分化的潛能。研究[29-30]表明，ADSCs可表達類似肝細胞的表型特征，并且可分泌肝細胞生長因子（HGF）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），因此ADSCs有望應用到肝炎和肝硬變的治療中，以修復受損的肝細胞。此外，將ADSCs暴露于煙酰胺、HGF和五肽胃泌素后，ADSCs表現出類似胰腺的功能，分泌胰島素、胰高血糖素和生長激素抑制素[31]，這可能為內分泌疾病的治療提供了新思路。
3 ADSCs的促血管化作用
自體脂肪移植術由于游離脂肪組織不能及時生成滋養血管以提供養分，導致移植物缺血壞死和吸收，使得脂肪移植的臨床應用受限。在組織工程的研究中如何提高移植物的血管化能力也是一個難點。多項研究[32-35]表明，ADSCs具有促進組織血管形成的作用。首先，ADSCs在低氧環境下能分泌多種與血管化相關的細胞因子，如血管上皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維生長因子2 （FGF-2）、HGF和胎盤生長因子，這些血管化相關的細胞因子可促進血管生長。其次，ADSCs主要位于脂肪毛細血管的血管壁上，并且具有一些周細胞的特征，對內皮細胞的形成具有協同作用。故ADSCs不僅可以穩定內皮網絡，還有利于血管網的形成和重塑[36]。此外，ADSCs經誘導可分化為血管上皮細胞[37]，直接參與血管壁的形成，從而有利于血管化。
4 ADSCs在脂肪組織修復重建中的應用前景和展望
ADSCs作為人體儲量最豐富的間充質干細胞，已作為種子細胞被應用到脂肪組織工程的研究中。多項研究[38-40]證實，復合了ADSCs的生物材料內出現更多成熟脂肪細胞和新生微血管。ADSCs很容易誘導成脂，并且經過多次傳代后依然具有成脂分化能力，在大面積燒傷、創傷等造成脂肪來源緊張的情況下，成熟脂肪細胞無法進行體外擴增，利用ADSCs增殖后再誘導分化成脂可有效地提供更多的白色脂肪組織。更重要的是，ADSCs不僅在形態上向脂肪細胞分化，還能表現出一些成熟脂肪細胞的功能，如成脂分化的ADSCs在兒茶酚胺的刺激下可脂解，在α腎上腺素的介導下抗脂解，并且能分泌脂聯素、瘦素等脂肪因子[41]，故ADSCs是脂肪組織工程理想的種子細胞。
ADSCs旁分泌多種細胞因子和生長因子，可招募宿主干細胞并促進其分化；同時ADSCs的抗缺氧能力強于成熟脂肪細胞[42]，ADSCs在低氧狀態下能產生抗氧化物質、自由基清除劑及熱休克蛋白，以清除組織缺氧產生的有害物質，從而有利于軟組織的創傷后修復[43]。研究[44-45]表明，ADSCs在放療后軟組織損傷的治療中，可促進脂肪血管化和真皮修復，減少軟組織感染。將ADSCs注射至糖尿病型潰瘍的動物模型中，可加速潰瘍的愈合[46]。
目前自體脂肪組織移植已被廣泛用于乳腺癌術后的乳房重建中，但由于游離脂肪組織不能快速血管化，較高的壞死吸收率影響了其治療效果。將ADSCs應用于脂肪組織移植術中，ADSCs分泌的VEGF、FGF-2、HGF等細胞因子可促進移植物血管化，從而提高脂肪細胞的存活率，使移植物的體積得以更好地維持。雖然多個臨床觀察研究[47-49]均表明，在乳腺癌患者術后的脂肪組織移植治療中應用ADSCs是安全有效的，但是有基礎研究表明，間充質干細胞可促進腫瘤細胞增殖，減少其凋亡[50]，有增加腫瘤復發和轉移的潛在風險[51]，且高濃度的ADSCs可造成移植物更顯著的纖維化[52]。可見ADSCs的臨床應用還需要更多相關研究的支持和指導。
5 小結
ADSCs可從皮下脂肪組織中反復多次提取，有充足的來源，分離培養容易。ADSCs可向多種中胚層組織分化，并且具有較強的成脂分化能力。ADSCs的旁分泌功能可促進脂肪組織的血管化，可提高移植組織的存活率。由此可見，ADSCs在脂肪組織工程、游離脂肪組織移植、脂肪軟組織創傷修復等方面均具有廣闊的應用前景。