引用本文： 郭恩玲, 孔靜, 劉彬彬, 姜清泉. 生物型人工肝模型的建立及其在實驗中的應用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(9): 1137-1142. doi: 10.7507/1007-9424.20150296 復制
人工肝是模擬人體肝臟的一種模型，根據性質不同分為非生物型人工肝、生物型人工肝及混合型人工肝3種。非生物型人工肝包括血液灌流、血漿置換、血液濾過、血漿透析濾過、白蛋白透析等方法；生物型人工肝通過在體外培養的肝細胞的基礎上建立體外生物裝置以代替衰竭的肝功能；混合型人工肝聯合了非生物型人工肝的解毒功能與生物型人工肝的合成、轉化等功能。生物型人工肝模型廣泛應用于有關肝臟的各種研究中，如藥物對肝臟的毒性研究、不同肝病的病因研究、肝臟的藥代動力學變化研究等。同時，由于國內肝移植的供體稀缺，人工肝模型的建立亦可以有效解決肝供體短缺的問題。在肝細胞的分離和培養及生物型人工肝模型的建立方面，國內外的研究方法眾多，筆者現就肝細胞的分離、培養等作一綜述，以為日后各項研究提供參考。
1 肝細胞的取材
1.1 人體
人肝細胞是最理想的人工肝材料，但其取材較困難，受到倫理學的限制，僅能從手術切除的部分肝組織中獲得，且其取下的肝組織多為不健康肝源，造成其相應研究結果受到很大的影響。
1.2 大鼠和小鼠
在鼠的肝細胞方面，從分離到培養技術都較為成熟，且其肝細胞模型的建立對于研究藥理、毒理及疾病病因方面均有著深刻的意義。
1.3 豬
豬肝細胞曾一度成為生物型人工肝領域中應用較多的肝細胞，因為豬肝細胞的細胞色素P450（CYP450）含量及其代謝能力與人肝細胞最為接近，所以其代謝功能和人肝細胞有很多相同之處。此外，其混合氧化酶的高水平表達正是代償肝功能衰竭患者解毒功能的重要基礎[1]。與人肝細胞比較，豬肝細胞的取材范圍廣、細胞分離方法可以有多重選擇、可以大量制備、細胞活力較好及細胞培養效果良好[2]，但在培養過程中發現維持豬肝細胞功能的時間較短，一般短于10 d，且難以傳代培養，不易于開展實驗室大量生產和制備；此外，其存在免疫反應和傳染病毒的潛在高危風險，因此將豬肝細胞用于生物型人工肝領域仍有其局限性[3]。
2 肝細胞的分離方法
2.1 機械分離法
2.1.1 單純剪切法
肝組織離體后，將其剪成小塊，再通過震蕩、擠壓等物理手段進一步分離肝細胞。該方法的操作簡單，成本低，但獲得的單細胞的數量較少，且對肝細胞的破壞較大，部分損傷也不可逆，在之后的培養過程中，細胞的存活率低。該方法不限肝細胞的取材，因此較易獲得肝細胞。1961年，Hillis等[4]最早采用此方法進行了人胚肝細胞的培養。但是在培養過程中，由于成纖維細胞增殖能力極強，在其增殖與分化的過程中，其與肝實質細胞的形態相似，不易區分，從而難以觀察肝細胞的數目、生長情況及分化程度[5]。此外，在培養胚胎肝細胞的過程中，未分化肝細胞的分化及功能獲得與正常肝細胞有一定差異，因而此法比較局限[6]。該方法現已被棄用，但對于某些需要獲得大量肝細胞的實驗，也可采用該方法。
2.1.2 剪切螯合法
在上述方法的基礎上，用含有能結合Ca2+的螯合劑〔如枸櫞酸鹽或乙二胺四乙酸（EDTA）等）〕的消化液進行螯合消化，通過螯合肝細胞間的Ca2+依賴性黏附因子，使細胞間橋粒斷裂而獲得單個的肝細胞。單獨使用螯合劑的效果并不理想，常需與下面介紹的酶消化法聯合使用。
2.2 酶消化法
2.2.1 胰酶消化法
該方法通過胰酶來破壞細胞間質——肝細胞之間的橋連，以獲得游離的肝細胞。但該方法的缺點也較為明顯，由于胰蛋白酶為強消化酶，消化作用較強，不僅能消化細胞間質，也能消化細胞本身，因此對酶的濃度以及酶的作用時間的要求較嚴格，如控制不當，會造成大量肝細胞死亡，導致無法進行細胞培養。
2.2.2 膠原酶消化法
該方法通過膠原酶來破壞肝細胞之間的橋連，以獲得游離的肝細胞。其優點是不僅能得到較多的肝細胞，而且肝細胞的活性佳；但相對來說，該方法的費用較高。該方法對取材要求不限，在溫度較低的環境下，將肝臟直接分離后置于培養基中剪碎，隨后加入膠原酶，破壞肝細胞間的連接，再經震蕩、沉淀，最后離心獲得上清液，以取得游離的肝細胞懸液。該方法的關鍵在于對酶濃度和消化時間的調節。此方法的應用范圍有一定的局限，僅適用于涉及肝細胞功能、肝細胞對外界的反應等少部分研究。需要注意的是，在成年鼠肝臟的分離培養中，由于成年鼠的肝組織連接多而緊密，分離困難，若剪得過于碎小，則邊緣的肝細胞多已遭到破壞，不易成活；若肝臟的分離塊過大，則造成消化時，中心的細胞未能接觸到膠原酶，沒能得到消化，周邊的細胞卻因消化過度而被破壞。在培養胚胎肝細胞時，又有細胞未分化的缺點，此時成纖維細胞大量增生，同時混有大量血細胞，肝細胞的純度降低，故不常采用。Howard等[7]開啟了膠原酶分離肝細胞的先河，他們在19世紀70年代中期，運用機械分離法+酶消化法分離鼠的肝細胞獲得成功，而后Berry等[8]將此方法進一步改善并開創了Seglen改良的兩步膠原酶灌注法。現在Seglen改良的兩步膠原酶灌注法已廣泛應用于各種有關肝臟功能的實驗研究中。此后眾多研究者對Seglen改良的兩步膠原酶灌注法加以改進，以探索更優的實驗步驟，使對肝細胞的損傷降至最小，以更有利于肝細胞的培養[9]。
2.3 灌流消化法
該方法在原始的膠原酶消化法的基礎上進一步發展而來，可以廣泛應用于各種實驗動物的研究中。現將其影響因素一一進行闡述如下。
2.3.1 Ca2+的作用
Ca2+主要影響肝細胞間的分離方式和膠原酶的活性。肝細胞通過縫隙連接、緊密連接、橋粒以及由上述任何兩種連接方式形成的復合連接進行連接。其中橋粒是Ca2+依賴性連接，因此在灌注時應選用Ca2+螯合劑，同時應選用無Ca2+的灌注液進行灌注，這樣通過橋粒連接的細胞膜會分解成為只含有半個橋粒的核小體，有助于肝細胞的分離。但是為提高膠原酶的活性，需要將Ca2+的濃度維持在0.05% [9]。對于其機理，Berry等[9]認為，Ca2+的濃度能影響細胞內外的Na+、K+平衡，使Na+、K+平衡紊亂，導致肝細胞壞死，從而影響肝細胞的分離及培養。
2.3.2 膠原酶的選擇及灌流速度
由于膠原酶的價格較為昂貴，因此對膠原酶的濃度及速度選擇一直困惑著大多實驗者。Sudhakaran等[10]認為，膠原酶Ⅰ和膠原酶Ⅳ的肝細胞分離效果更好。近來膠原酶的選擇日益多樣化，Shen等[11]在分離成年大鼠的肝細胞時采用的是膠原酶Ⅱ，他認為，配制好的膠原酶Ⅱ應該在30 min內用完，否則膠原酶的活性將會大大降低。而在分離小鼠的肝細胞時，Edwards等[12]選擇的是膠原酶H。對于灌流速度，一般采取高速（40～50 mL/min）灌流法和低速（5 mL/min）灌流法。高速灌流法的缺點在于即使重復使用膠原酶，也會造成膠原酶的用量較大，浪費過多，導致實驗費用增高。但相對來說，此法對肝細胞的分離效果較好。而低速灌流法使用的膠原酶量相對較少，較為經濟，但分離效果相對較差。不管選用哪一種方法，都應對灌流的操作進行把關，因灌流過程中存在氣泡或混入其他雜質致肝臟血管阻塞時，都會影響灌注的效果。
2.3.3 pH值和緩沖液
灌注液的pH值應保持在7.4～7.6之間（與培養基的pH值接近）。若偏離此范圍，將影響膠原酶的活性，因此緩沖液起到了關鍵的作用。Seglen [13]認為，有機緩沖液〔4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）〕較為簡單而實用。
2.3.4 灌流液溫度的控制
配制好的灌流液在灌流前應保存在42 ℃的恒溫箱中，這樣可以使其在灌注過程中達到37 ℃[12]。另外，在灌注過程中應保持灌注液的溫度為37 ℃，這樣可以保證灌注液發揮更好的作用，同時可以避免細胞凋亡。
2.3.5 插管方式的選擇
插管方式包括經典的門靜脈插管、左心室插管、右心房的肝上下腔靜脈插管等。經典的門靜脈插管法：穿刺針插入門靜脈后，啟動蠕動泵，同時剪斷肝上下腔靜脈遠端，用灌注液快速經門靜脈灌注以清除肝內血液，使肝臟呈米黃色。當下腔靜脈中流出的液體變清時，開始灌注消化酶液以充分消化肝臟，直至肝臟表面出現龜裂狀裂隙且變軟[14-15]。這種方法已在大鼠的肝細胞分離方面得到了廣泛的應用，同時其也可以在一些較大的動物上使用。而對于小鼠來說，其門靜脈較細，插管技術需要進一步提升。Ouji等[16]提出了一種新的插管方式，即從鼠的左心室插入針頭，利用血液循環通路將灌注液灌注到肝臟內。通過這種插管方式獲得的細胞數量為3.1×106～6.3×107個，活性為（89.3±6.5）%；而經典的門靜脈插管法獲得的細胞數量為（2.2～5.2）×107個，活性為（83.3±4.1）%，兩者差異不大[16]。故Ouji等[16]認為，左心室插管法可等同于經典的門靜脈插管法，并具有操作簡單的優點，適用于體型較小的鼠，尤其是新生鼠的肝細胞分離。余招焱等[17]也提出了一種新的插管方法，即在腎臟平面以上結扎肝上下腔靜脈，剪斷肝蒂，剪開胸廓及肝臟上方的兩側膈肌，通過右心房裂口向下方插入肝上下腔靜脈。由于右心房猶如漏斗狀的外形使得插管過程較為簡便，實驗者通過短期的學習較易掌握這種插管方式。其實驗結果也證實了此插管方法的可行性[17]，避免了門靜脈穿透后無法繼續進行插管導致的實驗動物死亡（因大出血而死亡），避免了實驗失敗。同時，下腔靜脈的管徑較粗，可以承受較大的液體灌注量而不至于發生血管破裂等，有利于肝臟的均勻灌注[17]。
2.4 細胞純化
提取肝細胞后，用細胞刮板將肝細胞分散到含有培養基的培養皿內，用100 μm或者200 μm不銹鋼篩目過濾細胞液，以去除結締組織和未消化的細胞。然后在4 ℃的條件下離心（50×g，3 min），吸取上層清液后，重新懸浮，再離心兩次（條件同前）。Shen等[11]提出，在第三次離心過程中，以部分percoll液代替部分培養基，則經過離心后，可形成連續的濃度梯度，壞死的細胞將在上層，而底部則是可進行培養的細胞。
3 肝細胞的培養條件
肝細胞的功能包括白蛋白分泌和尿素合成，其表達CYP3A4基因。肝細胞表面可分為血竇面、肝細胞連接面和膽小管面三面。例如，膽汁酸分泌到膽管時會通過膽小管面，而白蛋白分泌到血液循環中則是通過在血竇面的竇周隙完成物質交換而實現的。膽小管面將肝細胞分成兩個基底面，在肝細胞培養過程中，基底面將會和細胞外基質貼合，所以細胞外基質在肝細胞的培養過程中發揮著重要作用[18]。研究者對肝細胞的培養液進行了不斷探索，在培養液中添加抗生素、生長因子、鼠尾膠原、胰島素、胰高血糖素、地塞米松等，以實現不同的目的。
3.1 培養液的選擇
目前用到的基礎培養液有DMEM、RPMI 1640、L-15、Hepatozyme-SFM、Willams’E完全培養基等，其中DMEM培養基較為常用。周星輝等[19]指出，在原代肝細胞出現增殖前（培養1～5 d），DMEM培養基的培養效果明顯好于RPMI 1640培養基。Willams’E完全培養基的成份適合肝細胞培養，但此培養基的價格相對昂貴。
3.2 培養液的添加物
3.2.1 胰島素
胰島素的作用是使接種的細胞更容易存活，促進核蛋白磷酸化。另外，胰島素具有特異性生長因子的作用，能結合到生長因子受體上，有利于球蛋白、糖原和DNA合成，以及脂肪生成；同時，其能催化許多酶類，如乙酰-輔酶A羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6P）、葡萄糖激酶、酪氨酸轉化酶及鳥氨酸脫氫酶，尤其是在胰島素和上皮細胞生長因子（EGF）的協同作用下能誘導合成鳥氨酸脫氫酶[20]。胰島素和胰高血糖素都有促進肝細胞再生的作用[21]。
3.2.2 地塞米松
地塞米松的作用是使細胞分裂相增多，并使毛細膽管樣結構擴張明顯。隨著地塞米松濃度的遞增，毛細膽管樣結構擴張的程度也會發生改變：在0.5 μmol/L濃度下，地塞米松就可以引起毛細膽管樣結構擴張；在5～20 μmol/L濃度時細胞狀態好，并且可以引起毛細膽管樣結構明顯擴張[22]。
3.2.3 血清
血清的作用是提供肝細胞生長所需要的營養，但過多的血清會導致成纖維細胞大量生長。現大多數研究者選用胎牛血清。研究[23]表明，血清中含有一些生長因子和激素，其能結合肝細胞表面的各種生長因子受體和激素受體，能促進肝細胞的生長、分化及增殖，同時對維持肝細胞的生物學功能也具有重要意義。
3.2.4 生長因子
生長因子主要有EGF、肝細胞生長因子（HGF）等。EGF的作用是通過提高細胞的DNA合成能力，從而刺激細胞的增殖。EGF是一種很強的促細胞分裂因子，其還具有促進肝細胞的氨基酸轉運、蛋白合成等功能，這可能是因為EGF可以明顯降低臭氧所致的3H釋放、消除臭氧降低細胞內還原型谷胱甘肽含量的作用，增加細胞內谷胱甘肽總含量，進而減少細胞膜的脂質過氧化[24]。
3.3 聚苯乙烯培養板
聚苯乙烯培養板最常用于HepG2細胞株（人肝癌細胞）的培養中，以及人和其他動物的肝細胞的培養中[25]。
4 肝細胞的培養方法
4.1 傳統的單層膠原培養
該方法的優點在于操作較為簡單，但肝細胞的生存時間較短，一般不會超過1周；同時培養出的肝細胞的功能也受到不同程度的影響，不能培養出肝細胞的極性；肝細胞培養12～24 h后其喪失間隙連接，3～5 d后細胞呈扁平狀，并失去其特異的分泌功能，最終于1～2周內死亡[26]。
4.2 三明治雙層膠原培養
該方法的培養環境較傳統的單層膠原培養法更接近肝細胞在體內的環境，從形態和功能上恢復了肝細胞的極性，改善了細胞基質的拓撲結構，國外已用于小規模的生物型人工肝構型[27-28]。Choi等[29]認為，三明治雙層膠原培養法能為肝細胞提供一個更接近于體內的幾何形狀的環境，細胞表現出膽小管面、基底面和Disse間隙；同時，他通過分析抗胰蛋白酶α1（AAT）、肝細胞核因子4α（HNF4A）、甲胎蛋白、白蛋白、酪氨酸氨基轉移酶（TAT）基因、G6P、色氨酸氧化酶（TO）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達情況，從而證實了三明治雙層膠原培養法的效果明顯優于單層膠原培養法。
膠原蛋白對肝細胞有很強的黏附能力，能較長時間地維持細胞活力狀態，有效地保持和誘導細胞分化[30]。國內張先杰等[31]運用三明治雙層膠原培養法培養肝細胞，結果肝細胞在48 h內形成膽小管，并發展成肝板樣結構；肝細胞相對扁平，個體細胞的收縮明顯，阻止了細胞的進一步延伸；肝細胞呈多邊形，其胞漿濃縮，大多數細胞呈單核或雙核；同時蛋白分泌功能穩定，蛋白水平持續增高。原代培養的肝細胞在藥物代謝研究中得到了廣泛的應用。Komoroski等[32]研究了金絲桃素（St John’s Wort）對人原代肝細胞的誘導和抑制作用，同時探討了金絲桃素和貫葉金絲桃素對人原代肝細胞中CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4基因的表達、蛋白含量及其酶活性的影響，結果表明，原代培養的肝細胞能成為檢測中草藥產物對CYP450酶影響的體外通用模型。Cai等[33]利用原代培養的大鼠肝細胞模型證實了四氯化碳誘導的肝毒性是通過氧化損傷造成的，此模型在藥物代謝及毒理學中都得到了廣泛的應用。
4.3 微載體培養
微載體通常適用于貼壁依賴型細胞生長的微珠，它的直徑為60～250 μm [34]。它增大了細胞的培養面積，同時使細胞處于均一的環境，由于更加符合體內三維立體環境，從而避免了細胞接觸抑制的發生。其能夠控制溫度、pH值、CO2等培養系統環境條件，并能觀察微珠上細胞的生長情況。該培養方法為均相培養，可高效地利用培養基，并兼有單層培養和懸浮培養的優勢[35]。匡潔等[36]探索出了一種新型的微囊包載體肝細胞培養模式，由于微載體有單層培養無法比擬的體表面積（4 600 cm2/g），利用微載體Cytodex3可在較短時間及較小空間內達到高密度細胞培養的目的[36]。通過連接設計良好的生物反應器來輔助微載體培養，然后根據細胞的增殖情況適時增加微載體，最高可使細胞密度達10倍以上[37]。
利用海藻酸鈉/殼聚糖/海藻酸鈉（ACA）微囊免疫隔離的功能，使微載體在囊內對細胞起立體支撐作用，則細胞的生存環境更加符合體內環境，更有利于細胞活性的維持[38]。采用微載體模式培養肝細胞，可觀察到白蛋白水平呈逐漸升高的趨勢[36]。近年來，有不少學者通過不斷分析肝細胞周圍的基質成分、在制備微囊的過程中模擬肝細胞周圍的基質成分、向ACA溶液中添加木糖葡聚糖等物質，使肝細胞的功能得到進一步提升[39]。肝細胞在微囊內聚集成球形三維結構，細胞間接觸良好，可進行較大規模培養。可將微囊化肝細胞置入容器內，以血液或血漿直接進行灌流，以應用于異種肝細胞移植[40]。
5 生物反應器
生物反應器是生物型人工肝的主要功能部件，決定了生物型人工肝的治療效果。生物反應器必須具備以下功能：①提供給肝細胞一個良好的生長代謝環境；②提供一個血液或血漿與肝細胞相互作用的場所；③避免宿主免疫系統對肝細胞的損傷；④為肝細胞提供高通量的物質交換效能[41]。目前，生物型人工肝最常用的生物反應器是半透膜中空纖維型生物反應器。使用半透膜中空纖維型生物反應器時，一般將肝細胞種植于纖維管的外表面，血漿通過中空纖維毛細管柱對肝細胞進行灌注，肝細胞通過多孔質的中空纖維壁與血漿進行自由分子交換，從而達到吸收氧和營養物質的目的，并發揮解毒功能和代謝產物的功能[42]。
6 小結
對于供體的選擇要根據不同的實驗目的采取不同的細胞來源。在對肝細胞進行分離的過程中，單純的機械分離和胰酶/膠原酶消化法可以同時使用，以達到協同作用的目的。但是，即使同時使用機械分離和胰酶/膠原酶消化，也會造成肝細胞的存活率較低，肝細胞的純度較差。現在應用較多的是膠原酶灌注的方法，雖然此種方法較為繁瑣，對實驗者的要求較高，因實驗者要根據具體情況略微調整濃度、灌流時間、培養基種類等，但該方法極大地改善了肝細胞的存活率和肝細胞的純度，對于接下來的肝細胞培養奠定了基礎。在肝細胞的培養過程中，各研究者經過不斷的探索，從傳統的單層膠原培養到三明治雙層膠原培養，再到微載體培養，不斷地在體外尋找能更好地模擬體內、更適合肝細胞生長的環境。肝細胞的分離和培養還需要更多的研究者進行不斷探索，且各種方法均存在著各種各樣的不足，這些不足等待著更多的研究者去克服和改善。對生物反應器的不斷探索，將對生物型人工肝的廣泛臨床應用起到關鍵的作用。
人工肝是模擬人體肝臟的一種模型，根據性質不同分為非生物型人工肝、生物型人工肝及混合型人工肝3種。非生物型人工肝包括血液灌流、血漿置換、血液濾過、血漿透析濾過、白蛋白透析等方法；生物型人工肝通過在體外培養的肝細胞的基礎上建立體外生物裝置以代替衰竭的肝功能；混合型人工肝聯合了非生物型人工肝的解毒功能與生物型人工肝的合成、轉化等功能。生物型人工肝模型廣泛應用于有關肝臟的各種研究中，如藥物對肝臟的毒性研究、不同肝病的病因研究、肝臟的藥代動力學變化研究等。同時，由于國內肝移植的供體稀缺，人工肝模型的建立亦可以有效解決肝供體短缺的問題。在肝細胞的分離和培養及生物型人工肝模型的建立方面，國內外的研究方法眾多，筆者現就肝細胞的分離、培養等作一綜述，以為日后各項研究提供參考。
1 肝細胞的取材
1.1 人體
人肝細胞是最理想的人工肝材料，但其取材較困難，受到倫理學的限制，僅能從手術切除的部分肝組織中獲得，且其取下的肝組織多為不健康肝源，造成其相應研究結果受到很大的影響。
1.2 大鼠和小鼠
在鼠的肝細胞方面，從分離到培養技術都較為成熟，且其肝細胞模型的建立對于研究藥理、毒理及疾病病因方面均有著深刻的意義。
1.3 豬
豬肝細胞曾一度成為生物型人工肝領域中應用較多的肝細胞，因為豬肝細胞的細胞色素P450（CYP450）含量及其代謝能力與人肝細胞最為接近，所以其代謝功能和人肝細胞有很多相同之處。此外，其混合氧化酶的高水平表達正是代償肝功能衰竭患者解毒功能的重要基礎[1]。與人肝細胞比較，豬肝細胞的取材范圍廣、細胞分離方法可以有多重選擇、可以大量制備、細胞活力較好及細胞培養效果良好[2]，但在培養過程中發現維持豬肝細胞功能的時間較短，一般短于10 d，且難以傳代培養，不易于開展實驗室大量生產和制備；此外，其存在免疫反應和傳染病毒的潛在高危風險，因此將豬肝細胞用于生物型人工肝領域仍有其局限性[3]。
2 肝細胞的分離方法
2.1 機械分離法
2.1.1 單純剪切法
肝組織離體后，將其剪成小塊，再通過震蕩、擠壓等物理手段進一步分離肝細胞。該方法的操作簡單，成本低，但獲得的單細胞的數量較少，且對肝細胞的破壞較大，部分損傷也不可逆，在之后的培養過程中，細胞的存活率低。該方法不限肝細胞的取材，因此較易獲得肝細胞。1961年，Hillis等[4]最早采用此方法進行了人胚肝細胞的培養。但是在培養過程中，由于成纖維細胞增殖能力極強，在其增殖與分化的過程中，其與肝實質細胞的形態相似，不易區分，從而難以觀察肝細胞的數目、生長情況及分化程度[5]。此外，在培養胚胎肝細胞的過程中，未分化肝細胞的分化及功能獲得與正常肝細胞有一定差異，因而此法比較局限[6]。該方法現已被棄用，但對于某些需要獲得大量肝細胞的實驗，也可采用該方法。
2.1.2 剪切螯合法
在上述方法的基礎上，用含有能結合Ca2+的螯合劑〔如枸櫞酸鹽或乙二胺四乙酸（EDTA）等）〕的消化液進行螯合消化，通過螯合肝細胞間的Ca2+依賴性黏附因子，使細胞間橋粒斷裂而獲得單個的肝細胞。單獨使用螯合劑的效果并不理想，常需與下面介紹的酶消化法聯合使用。
2.2 酶消化法
2.2.1 胰酶消化法
該方法通過胰酶來破壞細胞間質——肝細胞之間的橋連，以獲得游離的肝細胞。但該方法的缺點也較為明顯，由于胰蛋白酶為強消化酶，消化作用較強，不僅能消化細胞間質，也能消化細胞本身，因此對酶的濃度以及酶的作用時間的要求較嚴格，如控制不當，會造成大量肝細胞死亡，導致無法進行細胞培養。
2.2.2 膠原酶消化法
該方法通過膠原酶來破壞肝細胞之間的橋連，以獲得游離的肝細胞。其優點是不僅能得到較多的肝細胞，而且肝細胞的活性佳；但相對來說，該方法的費用較高。該方法對取材要求不限，在溫度較低的環境下，將肝臟直接分離后置于培養基中剪碎，隨后加入膠原酶，破壞肝細胞間的連接，再經震蕩、沉淀，最后離心獲得上清液，以取得游離的肝細胞懸液。該方法的關鍵在于對酶濃度和消化時間的調節。此方法的應用范圍有一定的局限，僅適用于涉及肝細胞功能、肝細胞對外界的反應等少部分研究。需要注意的是，在成年鼠肝臟的分離培養中，由于成年鼠的肝組織連接多而緊密，分離困難，若剪得過于碎小，則邊緣的肝細胞多已遭到破壞，不易成活；若肝臟的分離塊過大，則造成消化時，中心的細胞未能接觸到膠原酶，沒能得到消化，周邊的細胞卻因消化過度而被破壞。在培養胚胎肝細胞時，又有細胞未分化的缺點，此時成纖維細胞大量增生，同時混有大量血細胞，肝細胞的純度降低，故不常采用。Howard等[7]開啟了膠原酶分離肝細胞的先河，他們在19世紀70年代中期，運用機械分離法+酶消化法分離鼠的肝細胞獲得成功，而后Berry等[8]將此方法進一步改善并開創了Seglen改良的兩步膠原酶灌注法。現在Seglen改良的兩步膠原酶灌注法已廣泛應用于各種有關肝臟功能的實驗研究中。此后眾多研究者對Seglen改良的兩步膠原酶灌注法加以改進，以探索更優的實驗步驟，使對肝細胞的損傷降至最小，以更有利于肝細胞的培養[9]。
2.3 灌流消化法
該方法在原始的膠原酶消化法的基礎上進一步發展而來，可以廣泛應用于各種實驗動物的研究中。現將其影響因素一一進行闡述如下。
2.3.1 Ca2+的作用
Ca2+主要影響肝細胞間的分離方式和膠原酶的活性。肝細胞通過縫隙連接、緊密連接、橋粒以及由上述任何兩種連接方式形成的復合連接進行連接。其中橋粒是Ca2+依賴性連接，因此在灌注時應選用Ca2+螯合劑，同時應選用無Ca2+的灌注液進行灌注，這樣通過橋粒連接的細胞膜會分解成為只含有半個橋粒的核小體，有助于肝細胞的分離。但是為提高膠原酶的活性，需要將Ca2+的濃度維持在0.05% [9]。對于其機理，Berry等[9]認為，Ca2+的濃度能影響細胞內外的Na+、K+平衡，使Na+、K+平衡紊亂，導致肝細胞壞死，從而影響肝細胞的分離及培養。
2.3.2 膠原酶的選擇及灌流速度
由于膠原酶的價格較為昂貴，因此對膠原酶的濃度及速度選擇一直困惑著大多實驗者。Sudhakaran等[10]認為，膠原酶Ⅰ和膠原酶Ⅳ的肝細胞分離效果更好。近來膠原酶的選擇日益多樣化，Shen等[11]在分離成年大鼠的肝細胞時采用的是膠原酶Ⅱ，他認為，配制好的膠原酶Ⅱ應該在30 min內用完，否則膠原酶的活性將會大大降低。而在分離小鼠的肝細胞時，Edwards等[12]選擇的是膠原酶H。對于灌流速度，一般采取高速（40～50 mL/min）灌流法和低速（5 mL/min）灌流法。高速灌流法的缺點在于即使重復使用膠原酶，也會造成膠原酶的用量較大，浪費過多，導致實驗費用增高。但相對來說，此法對肝細胞的分離效果較好。而低速灌流法使用的膠原酶量相對較少，較為經濟，但分離效果相對較差。不管選用哪一種方法，都應對灌流的操作進行把關，因灌流過程中存在氣泡或混入其他雜質致肝臟血管阻塞時，都會影響灌注的效果。
2.3.3 pH值和緩沖液
灌注液的pH值應保持在7.4～7.6之間（與培養基的pH值接近）。若偏離此范圍，將影響膠原酶的活性，因此緩沖液起到了關鍵的作用。Seglen [13]認為，有機緩沖液〔4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）〕較為簡單而實用。
2.3.4 灌流液溫度的控制
配制好的灌流液在灌流前應保存在42 ℃的恒溫箱中，這樣可以使其在灌注過程中達到37 ℃[12]。另外，在灌注過程中應保持灌注液的溫度為37 ℃，這樣可以保證灌注液發揮更好的作用，同時可以避免細胞凋亡。
2.3.5 插管方式的選擇
插管方式包括經典的門靜脈插管、左心室插管、右心房的肝上下腔靜脈插管等。經典的門靜脈插管法：穿刺針插入門靜脈后，啟動蠕動泵，同時剪斷肝上下腔靜脈遠端，用灌注液快速經門靜脈灌注以清除肝內血液，使肝臟呈米黃色。當下腔靜脈中流出的液體變清時，開始灌注消化酶液以充分消化肝臟，直至肝臟表面出現龜裂狀裂隙且變軟[14-15]。這種方法已在大鼠的肝細胞分離方面得到了廣泛的應用，同時其也可以在一些較大的動物上使用。而對于小鼠來說，其門靜脈較細，插管技術需要進一步提升。Ouji等[16]提出了一種新的插管方式，即從鼠的左心室插入針頭，利用血液循環通路將灌注液灌注到肝臟內。通過這種插管方式獲得的細胞數量為3.1×106～6.3×107個，活性為（89.3±6.5）%；而經典的門靜脈插管法獲得的細胞數量為（2.2～5.2）×107個，活性為（83.3±4.1）%，兩者差異不大[16]。故Ouji等[16]認為，左心室插管法可等同于經典的門靜脈插管法，并具有操作簡單的優點，適用于體型較小的鼠，尤其是新生鼠的肝細胞分離。余招焱等[17]也提出了一種新的插管方法，即在腎臟平面以上結扎肝上下腔靜脈，剪斷肝蒂，剪開胸廓及肝臟上方的兩側膈肌，通過右心房裂口向下方插入肝上下腔靜脈。由于右心房猶如漏斗狀的外形使得插管過程較為簡便，實驗者通過短期的學習較易掌握這種插管方式。其實驗結果也證實了此插管方法的可行性[17]，避免了門靜脈穿透后無法繼續進行插管導致的實驗動物死亡（因大出血而死亡），避免了實驗失敗。同時，下腔靜脈的管徑較粗，可以承受較大的液體灌注量而不至于發生血管破裂等，有利于肝臟的均勻灌注[17]。
2.4 細胞純化
提取肝細胞后，用細胞刮板將肝細胞分散到含有培養基的培養皿內，用100 μm或者200 μm不銹鋼篩目過濾細胞液，以去除結締組織和未消化的細胞。然后在4 ℃的條件下離心（50×g，3 min），吸取上層清液后，重新懸浮，再離心兩次（條件同前）。Shen等[11]提出，在第三次離心過程中，以部分percoll液代替部分培養基，則經過離心后，可形成連續的濃度梯度，壞死的細胞將在上層，而底部則是可進行培養的細胞。
3 肝細胞的培養條件
肝細胞的功能包括白蛋白分泌和尿素合成，其表達CYP3A4基因。肝細胞表面可分為血竇面、肝細胞連接面和膽小管面三面。例如，膽汁酸分泌到膽管時會通過膽小管面，而白蛋白分泌到血液循環中則是通過在血竇面的竇周隙完成物質交換而實現的。膽小管面將肝細胞分成兩個基底面，在肝細胞培養過程中，基底面將會和細胞外基質貼合，所以細胞外基質在肝細胞的培養過程中發揮著重要作用[18]。研究者對肝細胞的培養液進行了不斷探索，在培養液中添加抗生素、生長因子、鼠尾膠原、胰島素、胰高血糖素、地塞米松等，以實現不同的目的。
3.1 培養液的選擇
目前用到的基礎培養液有DMEM、RPMI 1640、L-15、Hepatozyme-SFM、Willams’E完全培養基等，其中DMEM培養基較為常用。周星輝等[19]指出，在原代肝細胞出現增殖前（培養1～5 d），DMEM培養基的培養效果明顯好于RPMI 1640培養基。Willams’E完全培養基的成份適合肝細胞培養，但此培養基的價格相對昂貴。
3.2 培養液的添加物
3.2.1 胰島素
胰島素的作用是使接種的細胞更容易存活，促進核蛋白磷酸化。另外，胰島素具有特異性生長因子的作用，能結合到生長因子受體上，有利于球蛋白、糖原和DNA合成，以及脂肪生成；同時，其能催化許多酶類，如乙酰-輔酶A羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6P）、葡萄糖激酶、酪氨酸轉化酶及鳥氨酸脫氫酶，尤其是在胰島素和上皮細胞生長因子（EGF）的協同作用下能誘導合成鳥氨酸脫氫酶[20]。胰島素和胰高血糖素都有促進肝細胞再生的作用[21]。
3.2.2 地塞米松
地塞米松的作用是使細胞分裂相增多，并使毛細膽管樣結構擴張明顯。隨著地塞米松濃度的遞增，毛細膽管樣結構擴張的程度也會發生改變：在0.5 μmol/L濃度下，地塞米松就可以引起毛細膽管樣結構擴張；在5～20 μmol/L濃度時細胞狀態好，并且可以引起毛細膽管樣結構明顯擴張[22]。
3.2.3 血清
血清的作用是提供肝細胞生長所需要的營養，但過多的血清會導致成纖維細胞大量生長。現大多數研究者選用胎牛血清。研究[23]表明，血清中含有一些生長因子和激素，其能結合肝細胞表面的各種生長因子受體和激素受體，能促進肝細胞的生長、分化及增殖，同時對維持肝細胞的生物學功能也具有重要意義。
3.2.4 生長因子
生長因子主要有EGF、肝細胞生長因子（HGF）等。EGF的作用是通過提高細胞的DNA合成能力，從而刺激細胞的增殖。EGF是一種很強的促細胞分裂因子，其還具有促進肝細胞的氨基酸轉運、蛋白合成等功能，這可能是因為EGF可以明顯降低臭氧所致的3H釋放、消除臭氧降低細胞內還原型谷胱甘肽含量的作用，增加細胞內谷胱甘肽總含量，進而減少細胞膜的脂質過氧化[24]。
3.3 聚苯乙烯培養板
聚苯乙烯培養板最常用于HepG2細胞株（人肝癌細胞）的培養中，以及人和其他動物的肝細胞的培養中[25]。
4 肝細胞的培養方法
4.1 傳統的單層膠原培養
該方法的優點在于操作較為簡單，但肝細胞的生存時間較短，一般不會超過1周；同時培養出的肝細胞的功能也受到不同程度的影響，不能培養出肝細胞的極性；肝細胞培養12～24 h后其喪失間隙連接，3～5 d后細胞呈扁平狀，并失去其特異的分泌功能，最終于1～2周內死亡[26]。
4.2 三明治雙層膠原培養
該方法的培養環境較傳統的單層膠原培養法更接近肝細胞在體內的環境，從形態和功能上恢復了肝細胞的極性，改善了細胞基質的拓撲結構，國外已用于小規模的生物型人工肝構型[27-28]。Choi等[29]認為，三明治雙層膠原培養法能為肝細胞提供一個更接近于體內的幾何形狀的環境，細胞表現出膽小管面、基底面和Disse間隙；同時，他通過分析抗胰蛋白酶α1（AAT）、肝細胞核因子4α（HNF4A）、甲胎蛋白、白蛋白、酪氨酸氨基轉移酶（TAT）基因、G6P、色氨酸氧化酶（TO）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達情況，從而證實了三明治雙層膠原培養法的效果明顯優于單層膠原培養法。
膠原蛋白對肝細胞有很強的黏附能力，能較長時間地維持細胞活力狀態，有效地保持和誘導細胞分化[30]。國內張先杰等[31]運用三明治雙層膠原培養法培養肝細胞，結果肝細胞在48 h內形成膽小管，并發展成肝板樣結構；肝細胞相對扁平，個體細胞的收縮明顯，阻止了細胞的進一步延伸；肝細胞呈多邊形，其胞漿濃縮，大多數細胞呈單核或雙核；同時蛋白分泌功能穩定，蛋白水平持續增高。原代培養的肝細胞在藥物代謝研究中得到了廣泛的應用。Komoroski等[32]研究了金絲桃素（St John’s Wort）對人原代肝細胞的誘導和抑制作用，同時探討了金絲桃素和貫葉金絲桃素對人原代肝細胞中CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4基因的表達、蛋白含量及其酶活性的影響，結果表明，原代培養的肝細胞能成為檢測中草藥產物對CYP450酶影響的體外通用模型。Cai等[33]利用原代培養的大鼠肝細胞模型證實了四氯化碳誘導的肝毒性是通過氧化損傷造成的，此模型在藥物代謝及毒理學中都得到了廣泛的應用。
4.3 微載體培養
微載體通常適用于貼壁依賴型細胞生長的微珠，它的直徑為60～250 μm [34]。它增大了細胞的培養面積，同時使細胞處于均一的環境，由于更加符合體內三維立體環境，從而避免了細胞接觸抑制的發生。其能夠控制溫度、pH值、CO2等培養系統環境條件，并能觀察微珠上細胞的生長情況。該培養方法為均相培養，可高效地利用培養基，并兼有單層培養和懸浮培養的優勢[35]。匡潔等[36]探索出了一種新型的微囊包載體肝細胞培養模式，由于微載體有單層培養無法比擬的體表面積（4 600 cm2/g），利用微載體Cytodex3可在較短時間及較小空間內達到高密度細胞培養的目的[36]。通過連接設計良好的生物反應器來輔助微載體培養，然后根據細胞的增殖情況適時增加微載體，最高可使細胞密度達10倍以上[37]。
利用海藻酸鈉/殼聚糖/海藻酸鈉（ACA）微囊免疫隔離的功能，使微載體在囊內對細胞起立體支撐作用，則細胞的生存環境更加符合體內環境，更有利于細胞活性的維持[38]。采用微載體模式培養肝細胞，可觀察到白蛋白水平呈逐漸升高的趨勢[36]。近年來，有不少學者通過不斷分析肝細胞周圍的基質成分、在制備微囊的過程中模擬肝細胞周圍的基質成分、向ACA溶液中添加木糖葡聚糖等物質，使肝細胞的功能得到進一步提升[39]。肝細胞在微囊內聚集成球形三維結構，細胞間接觸良好，可進行較大規模培養。可將微囊化肝細胞置入容器內，以血液或血漿直接進行灌流，以應用于異種肝細胞移植[40]。
5 生物反應器
生物反應器是生物型人工肝的主要功能部件，決定了生物型人工肝的治療效果。生物反應器必須具備以下功能：①提供給肝細胞一個良好的生長代謝環境；②提供一個血液或血漿與肝細胞相互作用的場所；③避免宿主免疫系統對肝細胞的損傷；④為肝細胞提供高通量的物質交換效能[41]。目前，生物型人工肝最常用的生物反應器是半透膜中空纖維型生物反應器。使用半透膜中空纖維型生物反應器時，一般將肝細胞種植于纖維管的外表面，血漿通過中空纖維毛細管柱對肝細胞進行灌注，肝細胞通過多孔質的中空纖維壁與血漿進行自由分子交換，從而達到吸收氧和營養物質的目的，并發揮解毒功能和代謝產物的功能[42]。
6 小結
對于供體的選擇要根據不同的實驗目的采取不同的細胞來源。在對肝細胞進行分離的過程中，單純的機械分離和胰酶/膠原酶消化法可以同時使用，以達到協同作用的目的。但是，即使同時使用機械分離和胰酶/膠原酶消化，也會造成肝細胞的存活率較低，肝細胞的純度較差。現在應用較多的是膠原酶灌注的方法，雖然此種方法較為繁瑣，對實驗者的要求較高，因實驗者要根據具體情況略微調整濃度、灌流時間、培養基種類等，但該方法極大地改善了肝細胞的存活率和肝細胞的純度，對于接下來的肝細胞培養奠定了基礎。在肝細胞的培養過程中，各研究者經過不斷的探索，從傳統的單層膠原培養到三明治雙層膠原培養，再到微載體培養，不斷地在體外尋找能更好地模擬體內、更適合肝細胞生長的環境。肝細胞的分離和培養還需要更多的研究者進行不斷探索，且各種方法均存在著各種各樣的不足，這些不足等待著更多的研究者去克服和改善。對生物反應器的不斷探索，將對生物型人工肝的廣泛臨床應用起到關鍵的作用。