引用本文： 梁正云, 王萌, 管文賢. 產氣莢膜梭菌腸毒素在惡性腫瘤治療中的進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(7): 893-987. doi: 10.7507/1007-9424.20150233 復制
大約85%的惡性腫瘤來源于上皮細胞，上皮細胞間的緊密連接與惡性腫瘤的發生、發展密切相關，腫瘤的發生往往伴隨著緊密連接功能的降低及緊密連接蛋白表達的改變。Claudin-3、-4作為緊密連接結構的重要組成蛋白，在調節細胞旁滲透性及維持細胞極性中起著重要作用[1]。研究[2]發現，緊密連接蛋白Claudin-3、-4在多種腫瘤細胞中異常表達，因此，作為Claudin-3、-4的配體，產氣莢膜梭菌腸毒素（CPE）成為了潛在的腫瘤靶向藥物。體外研究[3]證實，CPE確有靶向作用，且CPE在動物皮下移植瘤模型中取得一定療效，但是，因其較大的腸毒性等副作用限制了它的臨床應用。近年，利用CPE的羧基端多肽片段（C-CPE）的靶向性，將其連上一個其他的具有抗腫瘤效應的分子，改造為一個毒副作用較低的靶向藥物的研究取得了一定的進展[4]。現將CPE及C-CPE的一些研究進展綜述如下。
1 CPE蛋白
1.1 CPE蛋白簡介
產氣莢膜梭菌是一種革蘭陽性厭氧菌，人和牲畜均可作為宿主，主要經糞口傳播，可引起氣性壞疽、腸道感染等疾病。其分泌的外毒素是主要致病因子，根據其分泌的外毒素不同，將其分為5型（A～E），少部分（不到5%）A型產氣莢膜梭菌在形成孢子時還會分泌另外一種外毒素稱為產氣莢膜梭菌腸毒素（CPE），CPE可引起腸上皮脫落、腸壞疽、腸液吸收障礙等胃腸道疾病，進而導致嚴重腹瀉、腹痛性痙攣等臨床癥狀，這種癥狀一般12～24 h內恢復，但對老年人或患有藥物性便秘的人來說可導致死亡[5]。
1.2 CPE蛋白的結構
CPE由319個氨基酸組成，相對分子質量約為35×103，有3個功能結構區域，分別為區域Ⅰ，區域Ⅱ和區域Ⅲ。其中區域Ⅰ由C端125個氨基酸組成，是介導CPE靶向結合受體的區域；區域Ⅱ和區域Ⅲ稱為N端，是CPE毒性區域，可與細胞膜上受體形成多蛋白復合物CH-1，并插入細胞膜形成活化孔，導致鈣離子內流，引起細胞脹裂或caspase-3途徑的細胞凋亡。在N端還有1個由37個氨基酸組成的未知結構區域，將這個區域去掉后會使得CPE毒性增強2～3倍，可能是由于該區域的去除暴露了區域Ⅱ，促進了CH-1的形成。因此，該區域可能對CPE的齊聚反應起到開關的作用[6]。
由于CPE毒副反應大，其安全劑量、有效劑量及致死劑量之間相差較小，因此，有人[7]將CPE的N端毒性區域去掉，以期利用CPE蛋白C端即C-CPE的靶向效果并取得了成功。C-CPE是CPE的194～319氨基酸殘基片段，含有9條β鏈。C-CPE具有完整的Claudin蛋白靶向性，與某些細胞毒性藥物如TNF-α、蛋白合成抑制因子（PSIF）等連接后仍有靶向性[8-9]，故其可作為一個潛在的腫瘤靶向工具。也有研究[3]表明，一定濃度的C-CPE可加強高表達Claudin蛋白的惡性腫瘤對某些化療藥物如紫杉醇、卡鉑等的敏感性。
1.3 CPE的細胞毒性
當CPE與其受體結合后，在細胞膜上形成一個相對分子質量約90×103的小復合物，該小復合物對十二烷基硫酸鈉（SDS）敏感，其包含了CPE、Claudin受體蛋白和Claudin非受體蛋白，非受體蛋白的作用可能是與其他Claudin蛋白相互作用。6個小復合物聚合形成1個大的對SDS抵抗復合物，稱為CPE六聚體（CH-1）。CH-1是相對分子質量約450×103、同樣含有CP6分子CPE、受體Claudins和非受體Claudins。CH-1在細胞膜上可形成前孔，37 ℃下可迅速插入細胞膜形成活性孔。活性孔將導致鈣離子內流，當CPE劑量大時，在細胞膜上可形成多個CH-1，最終導致大量鈣離子內流而造成細胞脹裂死亡，當CPE劑量小時，活化孔只有少量鈣離子內流，最終引起經典的caspase-3途徑的細胞凋亡[10]。
CPE膜孔的形成也會導致細胞形態學上的改變，使得細胞基底側暴露出來，這將使得CPE形成另外一個大的復合物CH-2，它不僅含有CH-1的成分，還含有另外一種緊密連接蛋白occludin。CH-2將導致occludin的內化，同時，CPE處理過的細胞還會發生Claudin內化[11]。這種改變形成的機理尚不清楚，但這種效果可能是CPE破壞緊密連接的機理之一。
2 Claudin蛋白
2.1 Claudin蛋白簡介
緊密連接是上皮細胞之間的重要結構，對維持上皮細胞的屏障功能及細胞旁滲透性起著非常重要的作用。在一些研究中，上皮細胞緊密連接的破壞和功能紊亂與腫瘤的發生密切相關[12]；緊密連接由多種蛋白如Claudins蛋白家族、occludin蛋白及連接黏附分子（JAMs） 3種完整的蛋白、閉合小蛋白（ZO-1、ZO-2）等，其中Claudins蛋白最為重要[13]。現在已經發現的Claudins蛋白家族成員有24個，相對分子質量在20×103～27×103之間，含有4個跨膜區域、2個胞外環（ECL-1和ECL-2）、1個胞質尾區及細胞內的氨基端和羧基端[14]。Claudins蛋白在不同組織中表達不一，主要分布于肺、胃、小腸等組織，對維持緊密連接的結構及功能、穩定細胞旁滲透性及細胞極性起著重要作用[15]。
2.2 Claudin蛋白與腫瘤
自Claudin蛋白被發現以來，越來越多的研究表明Claudin蛋白與腫瘤密切相關。1999年Swisshelm等[16]發現，乳腺癌細胞的Claudin-1 mRNA表達比正常乳腺上皮細胞減少；隨后的研究[17]在至少12種腫瘤細胞中發現了Claudin表達的改變。Claudins蛋白在腫瘤細胞中表達改變的機理尚不清楚，但有研究[18-19]表明，一些細胞因子會影響Claudins的表達，如肝細胞生長因子和表皮生長因子降低Claudin-7的表達，但會增加Claudin-1、-3、-4的表達，TNF-α、TNF-β及IL-17會引起Claudin-1表達的增加等。另外，高表達Claudin-4的胰腺癌細胞表現出了較低的運動性及侵襲性，在小鼠體內模型試驗中，高表達Claudin-4的胰腺癌發生肺轉移的可能較低[20]；而Tsutsumi等[21]對100例胰腺導管腺癌的研究發現，高表達Claudin-4的患者比低表達者有更長的生存期；相反，高表達Claudin-3、-4的卵巢癌惡性程度更高，用siRNA抑制Claudin-3、-4后，卵巢癌的侵襲性受到了抑制。在結腸癌小鼠體內模型中，抑制Claudin-1基因及過表達試驗均獲得同樣的結果[22-23]。
Claudin蛋白在胃癌的研究中越來越受到重視。Jung等[24]在對72例胃癌的研究中發現，73.6%的患者高表達Claudin-2，而僅44.4%的患者高表達Claudin-4；在勞倫分型的腸型腺癌的患者顯著低表達Claudin-1；淋巴結轉移陽性的患者顯著低表達Claudin-3、-4，據此推測，Claudin-3、-4可能與胃癌的淋巴轉移有關。Zhu等[25]發現僅15.9%的正常胃黏膜高表達Claudin-4，而90%以上的腸上皮化生及胃上皮異型增生患者高表達Claudin-4，而確診為胃癌的患者約53.2%高表達Claudin-4，說明Claudin-4在胃癌及前期病變中異常表達。Mima等[26]發現，非甾體類抗炎藥能通過增加人胃癌細胞的Ca2+內流而誘導Claudin-4表達，且高表達Claudin-4的胃癌細胞降低了細胞的遷移，在瓊脂培養基中細胞群體的形成也受到抑制，而用干擾RNA抑制Claudin-4表達后，非甾體類抗炎藥則不能抑制細胞遷移力。這些研究表明，Claudin蛋白的異常表達與胃癌的發生及生長密切相關。
2.3 Claudin蛋白與CPE
自從1997年Katahira等[27]發現本來對CPE抵抗的成纖維母細胞在轉染表達Vero細胞中的一個相對分子質量為22×103的蛋白后變為對CPE敏感后，Claudins蛋白逐漸受到重視。有研究[28]表明，CPE能與Claudin-3、-4、-6、-8、-14結合，而未檢測出Claudin-1、-2、-5、-10能作為CPE受體。相關研究[29]表明，成纖維母細胞在轉染表達Claudin-1和僅有ECL-2序列的Claudin-4后對CPE仍相當敏感；相反，僅表達Claudin-1的ECL-2序列和Claudin-4的成纖維細胞對CPE同樣敏感，這高度提示CPE主要與Claudins蛋白的ECL-2結合而發揮作用。ECL-2有一個螺旋-轉角-螺旋結構，該結構中間的天冬氨酸殘基對與CPE結合起著非常重要的作用，而其殘基上的亮氨酸殘基可能參與結合過程[30]。
3 CPE在治療惡性腫瘤中的應用
3.1 簡介
大約85%的惡性腫瘤起源于上皮細胞，針對上皮細胞的靶向治療受到重視。表達于腫瘤上皮頂端連接間的Claudins蛋白對限制腫瘤細胞的生長起著重要作用。Claudin-3、-4被證實為CPE受體，而這兩種蛋白在卵巢癌、乳腺癌、子宮內膜漿乳癌、胰腺癌、前列腺癌等腫瘤細胞中高表達，這為這些腫瘤的治療提供了新的靶點[2]。CPE與Claudin-3、-4受體結合后在5～15 min內可導致細胞腫脹溶解，這為CPE成為Claudins蛋白靶向化療藥物提供了可能。
3.2 CPE與卵巢癌
卵巢癌是最重大的婦科腫瘤之一。除小部分Ⅰ期腫瘤外，其5年生存率不足50%，而且大部分卵巢癌對現有化療藥物不敏感，因此，開發新的化療藥物顯得尤為重要。有研究[31]證實，卵巢癌細胞高表達Claudin-3、-4，但在正常卵巢細胞中未檢測到Claudins的表達。值得關注的是，對化療藥物抵抗的卵巢癌較敏感者其高表達Claudin-3、-4更明顯，這為CPE靶向治療卵巢癌提供了希望[32]。Santin等[33]成功使用CPE治療了化療抵抗的人卵巢癌動物模型，CPE對卵巢癌的細胞毒性呈劑量依賴，且CPE處理的細胞24 h后均死亡；化療抵抗的卵巢癌異種移植動物模型中，腹腔內注射致死劑量（4～8.5 μg/mL）能顯著抑制腫瘤的生長，延長了動物模型的生存時間。研究結果表明，CPE可能成為卵巢癌靶向治療的新藥物。
3.3 CPE與乳腺癌及子宮內膜漿乳癌
乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，盡管他莫西芬和芳香酶抑制劑能顯著延長早期乳腺癌患者的生存時間，但進展期乳腺癌和轉移性乳腺癌仍然難以治愈。Claudin-3、-4在大部分原發乳腺癌及乳腺癌腦轉移細胞中高表達，這也為乳腺癌治療提供了新靶點。Kominsky等[34-35]在嚴重免疫缺陷的小鼠T47D細胞腫瘤動物模型瘤體內注射CPE，導致了腫瘤生長明顯受抑和壞死，并且未引起副作用，但腹腔內注射卻顯示有毒性反應且對腫瘤生長沒有影響；后來他們又發現CPE抑制了2只乳腺癌腦轉移模型小鼠的腫瘤生長，延長了生存期，并且未引發明顯的副作用和中樞神經系統毒性。這些研究表明，CPE可能對乳腺癌有效。
惡性程度很高的子宮內膜漿乳癌（USPC）同樣高表達Claudin-3、-4。Santin等[36]證明了CPE對USPC細胞的殺傷作用呈劑量依賴性，對不表達Claudin-3、-4的細胞沒有影響；瘤內注射CPE對USPC異種種植模型和腹腔內注射對化療抵抗的USPC腹腔內種植模型的治療均取得較好的效果。
3.4 CPE與胰腺癌及前列腺癌
胰腺癌因其較高的轉移率及復發率被認為是最惡性的腫瘤之一。有研究[37]發現，CPE對大部分胰腺癌的裸鼠動物模型及體外腫瘤細胞均有較好的腫瘤抑制效應，CPE對胰腺癌細胞的毒性作用與劑量及Claudin-4表達水平密切相關；同時，TGF-β能抑制Claudin-4的表達及細胞對CPE的敏感性。在胰腺導管腺癌HPAC細胞的實驗中，用siRNA抑制Claudin-4基因后，CPE的毒性明顯降低，提示CPE對胰腺癌HPAC的毒性作用是因為其表達Claudin-4 [38]。
Long等[39]報道了前列腺癌及前列腺上皮內瘤變的上皮細胞均高表達Claudin-3、-4，從1例正在接受抗雄激素治療的骨髓轉移的前列腺癌患者身上獲得的轉移前列腺癌細胞同樣高表達Claudin-3、-4，且對CPE的細胞毒作用有較好的敏感性。CPE對前列腺癌細胞的毒性作用不僅與Claudin-4有關，還與Claudin-4的細胞定位有關，例如在前列腺癌細胞PC3中，Claudin-4分布于整個細胞膜，而在正常前列腺上皮細胞PrEC中，Claudin-4僅分布在緊密連接處。實驗證明[40]，CPE對PC3細胞有很好的細胞毒作用，而對PrEC細胞幾乎無毒性，且在PC3異種移植的小鼠體內模型中，腫瘤周圍注射CPE能明顯抑制腫瘤的生長。因前列腺特異性抗原PSA具有蛋白水解作用，2014年Romanov等[41]設計了一個復合物，該復合物包含了一個能被PSA水解的位點和Claudin-3對接位點，將這個復合物連接在CPE的羧基端，獲得一個新的復合物CPE-M，該復合物對能分泌PSA的細胞具有毒性作用，而對不分泌PSA的細胞幾乎無毒性，這為克服CPE治療前列腺癌的毒副作用提供了新的思路。
3.5 C-CPE與腫瘤治療
因為Claudin-3,-4同樣表達于肺、胃、小腸等正常組織如中，故CPE對正常組織也具有一定毒性，且CPE作為食物中毒的毒力因子和促炎因子，容易引起各種毒副作用，再加上CPE相關的食物傳播疾病非常廣發，許多人體內產生了針對CPE的抗體，雖然并沒有證明這種抗體對CPE具有中和作用，但CPE已經被證明至少擁有一個中和抗原表位。這些都限制了CPE的臨床使用。因此，為克服這些缺點，研究者[42]把CPE的N端毒性區域去掉，獲得C端CPE即C-CPE，C-CPE雖然不能導致細胞死亡，但具有良好的靶向性和較小的抗原特性，且與Claudin-3、-4結合后能破壞緊密連接，提高細胞旁通透性，為化療藥物進入細胞提供了新的思路。
一些研究者將C-CPE用作化療藥物傳遞工具，取得較好的結果。Yuan等[8]用C-CPE與TNF-α結合，獲得CPE-TNF，證實C-CPE-TNF在TNF含量較單獨TNF低5倍情況下，對高表達Claudin-3、-4的卵巢癌細胞毒性大6.7倍左右，提示C-CPE-TNF可增加TNF療效并降低TNF的副反應；Saeki等[9]用C-CPE融合從綠膿桿菌中提取出的蛋白合成抑制因子（PSIF）獲得C-CPE-PSIF，并用于處理乳腺癌細胞株和乳腺癌小鼠模型瘤內注射，顯示了C-CPE-PSIF對乳腺癌生長的顯著抑制作用，且未引起明顯的副作用。Kakutani等[43]發現，雖然20 μg/mL的白喉毒素（DAT）對過表達Claudin-4的L細胞無毒性，但利用白喉毒素A片段和C-CPE融合獲得DAT-C-CPE，卻在1 μg/mL時能殺傷L細胞，且DAT-C-CPE僅對過表達Claudin-4的細胞具有毒性，而對過表達Claudin-1、-2及-5的細胞無毒性，且用C-CPE預處理細胞后能能降低DAT-C-CPE毒性，這證明融合蛋白DAT-C-CPE的羧基端的確對Claudin-4具有靶向性。Gao等[44]報道了C-CPE還能增強紫杉醇和卡鉑對乳腺癌細胞的毒性作用，在體內模型中，C-CPE和紫杉醇聯合用藥比單藥效果好1.5倍左右；Li等[45]利用熒光染料CF-570標記C-CPE及變異C-CPE （用酪氨酸和亮氨酸分別替換第306和第315位點的丙氨酸），分別處理過表達Claudin-1、-2、-3、-4、-5的L細胞，證明了C-CPE對Claudin-3、-4的靶向作用以及第306及319位點的丙氨酸對C-CPE的靶向性的重要作用。
4 結語
總的說來，CPE在某些惡性腫瘤治療的研究中取得一定的進展，但因其毒性作用限制了其臨床試驗。在去除其毒性區域后獲得的C-CPE具有低毒性及很好的靶向作用，為臨床治療腫瘤提供了新的靶向工具。但是因其受體Claudins蛋白在部分正常組織中仍有一定表達，這就使得C-CPE的靶向藥物仍存在一定毒副作用。如何更好地保護正常組織及找到一個新的能與其結合的化療藥物成為了新的挑戰。
大約85%的惡性腫瘤來源于上皮細胞，上皮細胞間的緊密連接與惡性腫瘤的發生、發展密切相關，腫瘤的發生往往伴隨著緊密連接功能的降低及緊密連接蛋白表達的改變。Claudin-3、-4作為緊密連接結構的重要組成蛋白，在調節細胞旁滲透性及維持細胞極性中起著重要作用[1]。研究[2]發現，緊密連接蛋白Claudin-3、-4在多種腫瘤細胞中異常表達，因此，作為Claudin-3、-4的配體，產氣莢膜梭菌腸毒素（CPE）成為了潛在的腫瘤靶向藥物。體外研究[3]證實，CPE確有靶向作用，且CPE在動物皮下移植瘤模型中取得一定療效，但是，因其較大的腸毒性等副作用限制了它的臨床應用。近年，利用CPE的羧基端多肽片段（C-CPE）的靶向性，將其連上一個其他的具有抗腫瘤效應的分子，改造為一個毒副作用較低的靶向藥物的研究取得了一定的進展[4]。現將CPE及C-CPE的一些研究進展綜述如下。
1 CPE蛋白
1.1 CPE蛋白簡介
產氣莢膜梭菌是一種革蘭陽性厭氧菌，人和牲畜均可作為宿主，主要經糞口傳播，可引起氣性壞疽、腸道感染等疾病。其分泌的外毒素是主要致病因子，根據其分泌的外毒素不同，將其分為5型（A～E），少部分（不到5%）A型產氣莢膜梭菌在形成孢子時還會分泌另外一種外毒素稱為產氣莢膜梭菌腸毒素（CPE），CPE可引起腸上皮脫落、腸壞疽、腸液吸收障礙等胃腸道疾病，進而導致嚴重腹瀉、腹痛性痙攣等臨床癥狀，這種癥狀一般12～24 h內恢復，但對老年人或患有藥物性便秘的人來說可導致死亡[5]。
1.2 CPE蛋白的結構
CPE由319個氨基酸組成，相對分子質量約為35×103，有3個功能結構區域，分別為區域Ⅰ，區域Ⅱ和區域Ⅲ。其中區域Ⅰ由C端125個氨基酸組成，是介導CPE靶向結合受體的區域；區域Ⅱ和區域Ⅲ稱為N端，是CPE毒性區域，可與細胞膜上受體形成多蛋白復合物CH-1，并插入細胞膜形成活化孔，導致鈣離子內流，引起細胞脹裂或caspase-3途徑的細胞凋亡。在N端還有1個由37個氨基酸組成的未知結構區域，將這個區域去掉后會使得CPE毒性增強2～3倍，可能是由于該區域的去除暴露了區域Ⅱ，促進了CH-1的形成。因此，該區域可能對CPE的齊聚反應起到開關的作用[6]。
由于CPE毒副反應大，其安全劑量、有效劑量及致死劑量之間相差較小，因此，有人[7]將CPE的N端毒性區域去掉，以期利用CPE蛋白C端即C-CPE的靶向效果并取得了成功。C-CPE是CPE的194～319氨基酸殘基片段，含有9條β鏈。C-CPE具有完整的Claudin蛋白靶向性，與某些細胞毒性藥物如TNF-α、蛋白合成抑制因子（PSIF）等連接后仍有靶向性[8-9]，故其可作為一個潛在的腫瘤靶向工具。也有研究[3]表明，一定濃度的C-CPE可加強高表達Claudin蛋白的惡性腫瘤對某些化療藥物如紫杉醇、卡鉑等的敏感性。
1.3 CPE的細胞毒性
當CPE與其受體結合后，在細胞膜上形成一個相對分子質量約90×103的小復合物，該小復合物對十二烷基硫酸鈉（SDS）敏感，其包含了CPE、Claudin受體蛋白和Claudin非受體蛋白，非受體蛋白的作用可能是與其他Claudin蛋白相互作用。6個小復合物聚合形成1個大的對SDS抵抗復合物，稱為CPE六聚體（CH-1）。CH-1是相對分子質量約450×103、同樣含有CP6分子CPE、受體Claudins和非受體Claudins。CH-1在細胞膜上可形成前孔，37 ℃下可迅速插入細胞膜形成活性孔。活性孔將導致鈣離子內流，當CPE劑量大時，在細胞膜上可形成多個CH-1，最終導致大量鈣離子內流而造成細胞脹裂死亡，當CPE劑量小時，活化孔只有少量鈣離子內流，最終引起經典的caspase-3途徑的細胞凋亡[10]。
CPE膜孔的形成也會導致細胞形態學上的改變，使得細胞基底側暴露出來，這將使得CPE形成另外一個大的復合物CH-2，它不僅含有CH-1的成分，還含有另外一種緊密連接蛋白occludin。CH-2將導致occludin的內化，同時，CPE處理過的細胞還會發生Claudin內化[11]。這種改變形成的機理尚不清楚，但這種效果可能是CPE破壞緊密連接的機理之一。
2 Claudin蛋白
2.1 Claudin蛋白簡介
緊密連接是上皮細胞之間的重要結構，對維持上皮細胞的屏障功能及細胞旁滲透性起著非常重要的作用。在一些研究中，上皮細胞緊密連接的破壞和功能紊亂與腫瘤的發生密切相關[12]；緊密連接由多種蛋白如Claudins蛋白家族、occludin蛋白及連接黏附分子（JAMs） 3種完整的蛋白、閉合小蛋白（ZO-1、ZO-2）等，其中Claudins蛋白最為重要[13]。現在已經發現的Claudins蛋白家族成員有24個，相對分子質量在20×103～27×103之間，含有4個跨膜區域、2個胞外環（ECL-1和ECL-2）、1個胞質尾區及細胞內的氨基端和羧基端[14]。Claudins蛋白在不同組織中表達不一，主要分布于肺、胃、小腸等組織，對維持緊密連接的結構及功能、穩定細胞旁滲透性及細胞極性起著重要作用[15]。
2.2 Claudin蛋白與腫瘤
自Claudin蛋白被發現以來，越來越多的研究表明Claudin蛋白與腫瘤密切相關。1999年Swisshelm等[16]發現，乳腺癌細胞的Claudin-1 mRNA表達比正常乳腺上皮細胞減少；隨后的研究[17]在至少12種腫瘤細胞中發現了Claudin表達的改變。Claudins蛋白在腫瘤細胞中表達改變的機理尚不清楚，但有研究[18-19]表明，一些細胞因子會影響Claudins的表達，如肝細胞生長因子和表皮生長因子降低Claudin-7的表達，但會增加Claudin-1、-3、-4的表達，TNF-α、TNF-β及IL-17會引起Claudin-1表達的增加等。另外，高表達Claudin-4的胰腺癌細胞表現出了較低的運動性及侵襲性，在小鼠體內模型試驗中，高表達Claudin-4的胰腺癌發生肺轉移的可能較低[20]；而Tsutsumi等[21]對100例胰腺導管腺癌的研究發現，高表達Claudin-4的患者比低表達者有更長的生存期；相反，高表達Claudin-3、-4的卵巢癌惡性程度更高，用siRNA抑制Claudin-3、-4后，卵巢癌的侵襲性受到了抑制。在結腸癌小鼠體內模型中，抑制Claudin-1基因及過表達試驗均獲得同樣的結果[22-23]。
Claudin蛋白在胃癌的研究中越來越受到重視。Jung等[24]在對72例胃癌的研究中發現，73.6%的患者高表達Claudin-2，而僅44.4%的患者高表達Claudin-4；在勞倫分型的腸型腺癌的患者顯著低表達Claudin-1；淋巴結轉移陽性的患者顯著低表達Claudin-3、-4，據此推測，Claudin-3、-4可能與胃癌的淋巴轉移有關。Zhu等[25]發現僅15.9%的正常胃黏膜高表達Claudin-4，而90%以上的腸上皮化生及胃上皮異型增生患者高表達Claudin-4，而確診為胃癌的患者約53.2%高表達Claudin-4，說明Claudin-4在胃癌及前期病變中異常表達。Mima等[26]發現，非甾體類抗炎藥能通過增加人胃癌細胞的Ca2+內流而誘導Claudin-4表達，且高表達Claudin-4的胃癌細胞降低了細胞的遷移，在瓊脂培養基中細胞群體的形成也受到抑制，而用干擾RNA抑制Claudin-4表達后，非甾體類抗炎藥則不能抑制細胞遷移力。這些研究表明，Claudin蛋白的異常表達與胃癌的發生及生長密切相關。
2.3 Claudin蛋白與CPE
自從1997年Katahira等[27]發現本來對CPE抵抗的成纖維母細胞在轉染表達Vero細胞中的一個相對分子質量為22×103的蛋白后變為對CPE敏感后，Claudins蛋白逐漸受到重視。有研究[28]表明，CPE能與Claudin-3、-4、-6、-8、-14結合，而未檢測出Claudin-1、-2、-5、-10能作為CPE受體。相關研究[29]表明，成纖維母細胞在轉染表達Claudin-1和僅有ECL-2序列的Claudin-4后對CPE仍相當敏感；相反，僅表達Claudin-1的ECL-2序列和Claudin-4的成纖維細胞對CPE同樣敏感，這高度提示CPE主要與Claudins蛋白的ECL-2結合而發揮作用。ECL-2有一個螺旋-轉角-螺旋結構，該結構中間的天冬氨酸殘基對與CPE結合起著非常重要的作用，而其殘基上的亮氨酸殘基可能參與結合過程[30]。
3 CPE在治療惡性腫瘤中的應用
3.1 簡介
大約85%的惡性腫瘤起源于上皮細胞，針對上皮細胞的靶向治療受到重視。表達于腫瘤上皮頂端連接間的Claudins蛋白對限制腫瘤細胞的生長起著重要作用。Claudin-3、-4被證實為CPE受體，而這兩種蛋白在卵巢癌、乳腺癌、子宮內膜漿乳癌、胰腺癌、前列腺癌等腫瘤細胞中高表達，這為這些腫瘤的治療提供了新的靶點[2]。CPE與Claudin-3、-4受體結合后在5～15 min內可導致細胞腫脹溶解，這為CPE成為Claudins蛋白靶向化療藥物提供了可能。
3.2 CPE與卵巢癌
卵巢癌是最重大的婦科腫瘤之一。除小部分Ⅰ期腫瘤外，其5年生存率不足50%，而且大部分卵巢癌對現有化療藥物不敏感，因此，開發新的化療藥物顯得尤為重要。有研究[31]證實，卵巢癌細胞高表達Claudin-3、-4，但在正常卵巢細胞中未檢測到Claudins的表達。值得關注的是，對化療藥物抵抗的卵巢癌較敏感者其高表達Claudin-3、-4更明顯，這為CPE靶向治療卵巢癌提供了希望[32]。Santin等[33]成功使用CPE治療了化療抵抗的人卵巢癌動物模型，CPE對卵巢癌的細胞毒性呈劑量依賴，且CPE處理的細胞24 h后均死亡；化療抵抗的卵巢癌異種移植動物模型中，腹腔內注射致死劑量（4～8.5 μg/mL）能顯著抑制腫瘤的生長，延長了動物模型的生存時間。研究結果表明，CPE可能成為卵巢癌靶向治療的新藥物。
3.3 CPE與乳腺癌及子宮內膜漿乳癌
乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，盡管他莫西芬和芳香酶抑制劑能顯著延長早期乳腺癌患者的生存時間，但進展期乳腺癌和轉移性乳腺癌仍然難以治愈。Claudin-3、-4在大部分原發乳腺癌及乳腺癌腦轉移細胞中高表達，這也為乳腺癌治療提供了新靶點。Kominsky等[34-35]在嚴重免疫缺陷的小鼠T47D細胞腫瘤動物模型瘤體內注射CPE，導致了腫瘤生長明顯受抑和壞死，并且未引起副作用，但腹腔內注射卻顯示有毒性反應且對腫瘤生長沒有影響；后來他們又發現CPE抑制了2只乳腺癌腦轉移模型小鼠的腫瘤生長，延長了生存期，并且未引發明顯的副作用和中樞神經系統毒性。這些研究表明，CPE可能對乳腺癌有效。
惡性程度很高的子宮內膜漿乳癌（USPC）同樣高表達Claudin-3、-4。Santin等[36]證明了CPE對USPC細胞的殺傷作用呈劑量依賴性，對不表達Claudin-3、-4的細胞沒有影響；瘤內注射CPE對USPC異種種植模型和腹腔內注射對化療抵抗的USPC腹腔內種植模型的治療均取得較好的效果。
3.4 CPE與胰腺癌及前列腺癌
胰腺癌因其較高的轉移率及復發率被認為是最惡性的腫瘤之一。有研究[37]發現，CPE對大部分胰腺癌的裸鼠動物模型及體外腫瘤細胞均有較好的腫瘤抑制效應，CPE對胰腺癌細胞的毒性作用與劑量及Claudin-4表達水平密切相關；同時，TGF-β能抑制Claudin-4的表達及細胞對CPE的敏感性。在胰腺導管腺癌HPAC細胞的實驗中，用siRNA抑制Claudin-4基因后，CPE的毒性明顯降低，提示CPE對胰腺癌HPAC的毒性作用是因為其表達Claudin-4 [38]。
Long等[39]報道了前列腺癌及前列腺上皮內瘤變的上皮細胞均高表達Claudin-3、-4，從1例正在接受抗雄激素治療的骨髓轉移的前列腺癌患者身上獲得的轉移前列腺癌細胞同樣高表達Claudin-3、-4，且對CPE的細胞毒作用有較好的敏感性。CPE對前列腺癌細胞的毒性作用不僅與Claudin-4有關，還與Claudin-4的細胞定位有關，例如在前列腺癌細胞PC3中，Claudin-4分布于整個細胞膜，而在正常前列腺上皮細胞PrEC中，Claudin-4僅分布在緊密連接處。實驗證明[40]，CPE對PC3細胞有很好的細胞毒作用，而對PrEC細胞幾乎無毒性，且在PC3異種移植的小鼠體內模型中，腫瘤周圍注射CPE能明顯抑制腫瘤的生長。因前列腺特異性抗原PSA具有蛋白水解作用，2014年Romanov等[41]設計了一個復合物，該復合物包含了一個能被PSA水解的位點和Claudin-3對接位點，將這個復合物連接在CPE的羧基端，獲得一個新的復合物CPE-M，該復合物對能分泌PSA的細胞具有毒性作用，而對不分泌PSA的細胞幾乎無毒性，這為克服CPE治療前列腺癌的毒副作用提供了新的思路。
3.5 C-CPE與腫瘤治療
因為Claudin-3,-4同樣表達于肺、胃、小腸等正常組織如中，故CPE對正常組織也具有一定毒性，且CPE作為食物中毒的毒力因子和促炎因子，容易引起各種毒副作用，再加上CPE相關的食物傳播疾病非常廣發，許多人體內產生了針對CPE的抗體，雖然并沒有證明這種抗體對CPE具有中和作用，但CPE已經被證明至少擁有一個中和抗原表位。這些都限制了CPE的臨床使用。因此，為克服這些缺點，研究者[42]把CPE的N端毒性區域去掉，獲得C端CPE即C-CPE，C-CPE雖然不能導致細胞死亡，但具有良好的靶向性和較小的抗原特性，且與Claudin-3、-4結合后能破壞緊密連接，提高細胞旁通透性，為化療藥物進入細胞提供了新的思路。
一些研究者將C-CPE用作化療藥物傳遞工具，取得較好的結果。Yuan等[8]用C-CPE與TNF-α結合，獲得CPE-TNF，證實C-CPE-TNF在TNF含量較單獨TNF低5倍情況下，對高表達Claudin-3、-4的卵巢癌細胞毒性大6.7倍左右，提示C-CPE-TNF可增加TNF療效并降低TNF的副反應；Saeki等[9]用C-CPE融合從綠膿桿菌中提取出的蛋白合成抑制因子（PSIF）獲得C-CPE-PSIF，并用于處理乳腺癌細胞株和乳腺癌小鼠模型瘤內注射，顯示了C-CPE-PSIF對乳腺癌生長的顯著抑制作用，且未引起明顯的副作用。Kakutani等[43]發現，雖然20 μg/mL的白喉毒素（DAT）對過表達Claudin-4的L細胞無毒性，但利用白喉毒素A片段和C-CPE融合獲得DAT-C-CPE，卻在1 μg/mL時能殺傷L細胞，且DAT-C-CPE僅對過表達Claudin-4的細胞具有毒性，而對過表達Claudin-1、-2及-5的細胞無毒性，且用C-CPE預處理細胞后能能降低DAT-C-CPE毒性，這證明融合蛋白DAT-C-CPE的羧基端的確對Claudin-4具有靶向性。Gao等[44]報道了C-CPE還能增強紫杉醇和卡鉑對乳腺癌細胞的毒性作用，在體內模型中，C-CPE和紫杉醇聯合用藥比單藥效果好1.5倍左右；Li等[45]利用熒光染料CF-570標記C-CPE及變異C-CPE （用酪氨酸和亮氨酸分別替換第306和第315位點的丙氨酸），分別處理過表達Claudin-1、-2、-3、-4、-5的L細胞，證明了C-CPE對Claudin-3、-4的靶向作用以及第306及319位點的丙氨酸對C-CPE的靶向性的重要作用。
4 結語
總的說來，CPE在某些惡性腫瘤治療的研究中取得一定的進展，但因其毒性作用限制了其臨床試驗。在去除其毒性區域后獲得的C-CPE具有低毒性及很好的靶向作用，為臨床治療腫瘤提供了新的靶向工具。但是因其受體Claudins蛋白在部分正常組織中仍有一定表達，這就使得C-CPE的靶向藥物仍存在一定毒副作用。如何更好地保護正常組織及找到一個新的能與其結合的化療藥物成為了新的挑戰。