引用本文： 黃伯儒, 趙海平, 胡文秀. 髓鞘堿性蛋白、TNF-α和IL-6在實驗性大鼠胰性腦病中的水平變化及相關性研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(7): 816-821. doi: 10.7507/1007-9424.20150211 復制
胰性腦病（pancIeatic encephalopathy，PE）是重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）患者的嚴重并發癥。SAP患者表現有定向力障礙、煩躁不安、激動伴妄想、嗜睡等異常精神狀態的癥候群并將其定義為PE [1-3]。PE的病死率高，臨床報道逐漸增多，國內外對其關注度也有所提高,查閱國內2004～2014年文獻，對文獻報道病例進行統計，SAP合并PE患者243例，其中經治療無效死亡103例，病死率為42.4%。而此前國內學者[4]檢索1994 年以來SAP合并PE患者文獻，匯總國內文獻報道的PE患者 108 例，結果發現，PE發病率占同期SAP的9%～20%，平均為10.6%，病死率達 40.00%～66.67%。說明PE的發生率并不低。通過兩次病例統計發現，近年來PE的病死率無明顯變化，依然是高病死率，究其原因：①近年我們對PE的研究主要集中在發病機理的研究，而沒有進一步去研究PE的診斷及治療機制；②在動物實驗方面沒有為臨床提供足夠的依據。因此我們需要在熟知PE發病機理的基礎上，通過動物實驗試著去找到治療途徑，最終降低PE的病死率，為廣大患者帶來光明。
隨著大鼠PE模型建立的逐漸成熟，以及對PE發病機理研究的逐漸深入[5-7]，我們得知髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)是構成神經髓鞘的主要蛋白質，當MBP暴露或釋放至腦脊液中時，可引起免疫應答，刺激機體產生抗MBP抗體，刺激單核細胞產生TNF-α和IL-6，導致PE的發生發展[8-11]。如何利用這些因子的水平變化準確地診斷及治療PE，降低發病率及病死率，為臨床提供準確的實驗依據，是我們現在應重點研究的問題。
本研究將在大鼠PE模型上，同過分析病情發展與MBP、TNF-α和IL-6含量變化之間的相關性，旨在為PE的臨床診斷及治療提供新思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
5%牛磺膽酸鈉，美國SIGMA公司；一次性BD胰島素注射器，美國BD公司；大鼠MBP、TNF-α和IL-6 ELISA檢測試劑盒，美國Diagnostic Systems Lab-oratories公司；TP-B展片機、HP-B烤片機及組織包埋機，天津久圣醫療電子儀器有限公司；Leica RM2016切片機、LEICA EG 1150H蠟缸及LEICA EG 1150C冷卻臺，Leica公司；XS-212 002684顯微鏡，江南顯微鏡廠；HPX-9082 ME數顯電熱培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。
1.2 實驗動物及分組
健康清潔級SD大鼠40只，購自北京大學動物實驗中心，雌雄各半，體質量（260±40）g，購回后適應性喂養1周，應用拆信封法隨機分為SO組10只和PE組30只。PE組按照完全隨機化原則再分成造模后1 d、3 d及7 d 3個亞組。
1.3 PE動物模型制備
手術器械消毒，操作過程嚴格無菌，實驗大鼠術前禁食24 h，自由飲水。采用10%水合氯醛3.3 mL/kg腹腔注射麻醉。待麻醉滿意后將大鼠固定于手術臺，腹部術區備皮，常規碘伏消毒鋪巾，取上腹正中切口入腹，顯露十二指腸，辨認胰腺、膽管系統及肝門部膽管。于肝門部辨認肝門部膽總管，用小動脈夾暫時阻閉，于乳頭開口內下的腸壁上用一次性BD胰島素注射器以針頭與腸管壁成10o角刺入十二指腸壁內，經乳頭部插入胰膽管內，封閉胰膽管十二指腸開口端，以0.3 mL/min的速度勻速向胰膽管內注入5%牛磺膽酸鈉2 mL/kg。注射完畢后，去除夾閉的動脈夾，檢查見無明顯出血即漏膽后關腹。大鼠蘇醒后禁食，可飲水，分組進行飼養。SO組大鼠同法經十二指腸乳頭逆行胰膽管穿刺注射生理鹽水2 mL/kg，速度為0.3 mL/min。
SO組大鼠于造模后第1 d用10%水合氯醛（3.3ml/kg）腹腔注射麻醉后，經心臟右心房取血，同時左心房推注35%的甲醛水溶液20 mL。采用微量進樣器經硬脊膜穿刺抽取大鼠腦脊液，取完后處死大鼠，取腦組織及胰腺組織。PE組大鼠分別在造模后1 d、3 d及7 d用同法采取血液、腦脊液、腦組織及胰腺組織。
1.4 檢測指標及方法
1.4.1 一般項目觀察
造模成功后開始觀察大鼠呼吸、進食量、活動量、神經反射以及意識狀態。
1.4.2 血清MBP、TNF-α及IL-6水平測定
SO組大鼠于術后1 d和PE組大鼠分別于造模后1 d、3 d及7 d采靜脈血2 mL。用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清MBP、TNF-α及IL-6水平。
1.4.3 腦脊液MBP、TNF-α及IL-6水平測定
SO組大鼠于術后1 d抽取腦脊液標本400 μL和PE組大鼠分別于造模后1 d、3 d及7d抽取腦脊液標本400 μL，采用ELISA法檢測腦脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平。
1.4.4 腦組織含水量測定
將取得的大鼠腦組織用電子天平直接稱濕重，然后放在80 ℃烤箱中24 h烤干，再測大鼠腦組織的干重。腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。
1.4.5 腦組織及胰腺組織病理學觀察
取大鼠全部腦組織及胰腺組織行常規石蠟包埋、切片、HE染色,光鏡下觀察。另外，在光鏡下觀察20個腦微血管斷面，并計數20個斷面內聚集和附壁的白細胞總數，取其均數。
1.5 統計學方法
采用SPSS l3.0統計軟件。實驗數據用均數±標準差（
2 結果
2.1 大鼠一般情況
SO組大鼠麻醉清醒后（術后約25 min）即開始進食，活動無明顯減少。PE組大鼠麻醉蘇醒時間明顯延長（術后約40 min），造模后第2天，一般情況差，表現為進食減少，少動，弓背，精神萎靡，煩渴，腹脹明顯,但至造模后第7天，上述癥狀無明顯加重。
2.2 腦組織含水量檢測結果
結果見表 1。由表 1可見，造模后1 d、3 d及7 d PE組大鼠腦組織含水量均明顯高于SO組（P<0.05），但PE組造模后各時相間腦組織含水量比較其差異則無統計學意義（P>0.05）。
2.3 血清MBP、TNF-α和IL-6水平檢測結果
結果見表 1。由表 1可見，PE組大鼠造模后各時相血清MBP、TNF-α及IL-6水平均明顯高于SO組（P<0.05）；PE組大鼠造模后隨著時間的延長，血清MBP、TNF-α及IL-6水平均逐漸升高，經單因素方差分析顯示，其差異均有統計學意義（P<0.05）。進一步行兩兩比較，MBP在造模后3個時相間比較其差異均有統計學意義（P<0.05），而TNF-α和IL-6水平在造模后3 d及7 d高于造模后1 d（P<0.05），但造模后3 d與7 d比較其差異則無統計學意義（P>0.05）。
表1
2組大鼠腦組織含水量和血清MBP、TNF-α及IL-6水平檢測結果（2.4 腦脊液MBP、TNF-α和IL-6水平檢測結果
結果見表 2。由表 2可見，PE組大鼠造模后各時相腦脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平均明顯高于SO組（P<0.05）；PE組大鼠造模后隨著時間延長，腦脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平均逐漸升高，經單因素方差分析，其差異均有統計學意義（P<0.05）。進一步行兩兩比較，MBP在造模后7 d明顯高于造模后1 d及3 d（P<0.05），而造模后1 d及3 d間比較差異無統計學意義（P>0.05）；TNF-α在造模后7 d明顯高于造模后1 d（P<0.05），而造模后3 d與1 d比較和7 d與3 d比較其差異均無統計學意義（P>0.05）；IL-6在造模后7 d明顯高于造模后1 d及3 d（P<0.05），而造模后1 d及3 d間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
表2
2組大鼠腦脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平檢測結果（2.5 腦組織病理學改變
SO組大鼠可見散在的神經元細胞輕度水腫，腦組織內未見炎性細胞聚集，腦組織的微血管內有少數的白細胞附壁。PE組大鼠神經元細胞水腫明顯，在術后1 d即出現，隨著時間的延長，神經元細胞水腫加重，呈氣球樣變（圖 1）；腦組織中炎性細胞增生和聚集于術后1 d即開始出現，隨著時間的延長，炎性細胞數目明顯增多（圖 2）；小血管內皮細胞出現腫脹，微血管內白細胞發生聚集及附壁，其數目也隨著時間的延長而增加（圖 3）。
圖1
示PE組神經元細胞，可見明顯水腫，呈氣球樣變（HE ×200） ? ?圖 2 示PE組，見腦組織炎性細胞浸潤，表現為炎細胞聚集（HE ×200） ? ?圖 3 示PE組的腦組織微血管，黑箭示炎性細胞的附壁和聚集（HE ×200） ? ?圖 4 示PE組大鼠胰腺整體外觀，胰腺有明顯的出血壞死 ? ?圖 5 示PE組大鼠大體解剖，胰腺可見出血、水腫及滲出，胰腺周圍及腸系膜上可見散在鈣化灶 ? ?圖 6 示胰腺組織的病理改變，見胰腺小葉結構破壞，腺泡空泡變性,有大量炎性細胞浸潤（HE ×200）
2.6 胰腺組織病理學變化
SO組大鼠胰腺色澤正常，無肥厚，鏡下腺泡及小葉機構正常。PE組大鼠胰腺腺體外觀增大，肥厚，呈紅紫色（圖 4），可見腺體及周圍腸系膜上有散在皂化斑（圖 5）。鏡下可見腺泡嚴重破壞，血管消化，小葉結構模糊不清，壞死灶外有炎性區圍繞（圖 6）。
3 討論
SAP病情危重,變化復雜,早期以胰腺出血壞死為主,晚期多合并胰腺臟器的損傷。當出現中樞神經系統表現時被認為是PE [1, 12-15]。現在尚無特異性檢查方法和診斷標準，主要根據急性胰腺炎及其臨床表現進行診斷。就臨床表現我們應該首先慎重排除類似疾病：①Wernicke腦病。該病多發生在急性胰腺炎確診后2～3周，由于長時間禁食和高分解代謝，出現記憶力下降，定向力障礙等神經系統改變，但是無局灶性定位體征，并且在給予維生素B1后癥狀可好轉。而PE的發生多集中在SAP發生后2周內，補充維生素B1無明顯好轉。②急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。ARDS多發生在SAP確診后1周內，與PE的發病時間比較接近，同PE一樣伴有意識障礙，氧分壓較低可通過血氧檢測及時發現，通過機械通氣糾正低氧血癥后，癥狀可好轉。③電解質紊亂。由于急性胰腺炎的治療需要長期禁食，并且在急性期機體神經內分泌激素分泌水平出現異常，很容易出現低鈉、低鈣血癥，臨床可表現為嗜睡、淡漠、無力等，容易和PE混淆，但是在糾正電解質紊亂后腦功能障礙則可緩解。④低血糖。當重癥胰腺炎并發低血糖時，患者會出現意識障礙、嗜睡等中樞神經系統癥狀，及時給予高糖可糾正。⑤當患者有腦出血或腦梗塞時，可出現煩躁、譫妄等神經癥狀，CT和MRI可確診，比較容易和PE鑒別。通過臨床表現我們可以診斷PE的發生，但這是一個很復雜的過程，PE的發展速度較快，預后較差，這就要求我們在PE的診斷上要尋找新思路、新方法，使診斷能更快，這樣才能降低中樞神經系統的損傷。為對PE發病機理進行進一步研究，本研究采用逆行胰膽管穿刺注射5%牛磺膽酸鈉的方法誘導建立大鼠PE模型，檢測在PE發生發展中關鍵免疫因子的水平，分析其與疾病的相關性，旨在為臨床診治PE提供一種新的手段。
3.1 MBP對PE的影響
在MBP介導脫髓鞘病變時存在免疫忽視，自身抗原的能量效應能致淋巴細胞克隆清除或克隆忽視，是經抗原轉基因小鼠證實的。小鼠的實驗性變態反應性腦脊髓炎（EAE）就是由對自身MBP的多肽特異應答Th1細胞被活化所致的一種典型的中樞神經系統損傷[16-17]。在實驗性對MBP特異性識別的TCR轉基因小鼠體內，大部分T淋巴細胞均表達轉基因的MBP特異性T淋巴細胞抗原受體（TCR），但不引起EAE，其原因是外周組織MBP的表達量很低，只有在中樞神經系統中MBP表達量才高，但是該處是免疫隔離部位，初始T淋巴細胞不能進入[18]。這些免疫忽視的自身應答性T淋巴細胞，會因感染的病原體與自身抗原的分子模擬作用，使抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）活化，高表達B7等輔助刺激分子，提供第二信號，誘導免疫應答，產生效應T淋巴細胞，傷害相應自身組織細胞。隨感染的控制及消失，APC不再活化，這種自身應答細胞又恢復到靜止的免疫忽視狀態[19-20]。
SAP發病時，胰腺出現出血壞死，誘導其產生大量脂酶，其中可溶性磷脂酶A2（soluble phospholipase A2，S-PLA2）是胰腺的產物。PLA2被蛋白酶、離子激活后，催化斷裂卵磷脂的第2位脂鍵，使胰液中的卵磷脂和腦磷脂其轉變為溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine）和溶血性腦磷脂（lysocephalin），使細胞膜分解，具有高度的細胞毒性和嗜神經性。當破壞了腦細胞的功能后引起腦組織損傷。它可以影響細胞膜的通透性，破壞血腦脊液的屏障。此時中樞神經系統MBP的免疫忽視狀態被打破。在APC表面，同時表達MHC-ⅡAg、MBP等抗原的表位，而在T淋巴細胞中有MBP抗原致敏T淋巴細胞，T淋巴細胞對其進行雙識別后，自身抗原肽段MHC-Ⅱ類抗原復合物刺激CD4+ Th1細胞分化為致敏CD4+ Thl細胞，當它們與特異抗原再次結合后可釋放多種細胞因子，介導細胞免疫，在PE中樞神經系統的脫髓鞘破壞中起主要作用[21-23]。T淋巴細胞增殖與干擾素-γ（IFN-γ）的量相互作用，Thl決定了每個亞群的免疫效應功能,還調控各亞群的形成及擴增，IFN-γ反作用于Th1,促使其進一步分化，產生更多的Th1細胞[24]。此外，特異性T淋巴細胞克隆增殖并形成記憶性T淋巴細胞，當再次遇到同一抗原時將引起記憶性T淋巴細胞的激活進行免疫應答[25-27]，這樣就形成了“瀑布”樣級聯反應，加重PE的發展。
3.2 TNF-α對PE的影響
TNF-α是一種單核因子，生物活性占TNF總活性的70%～80%，主要由單核細胞和巨噬細胞產生，在活化的巨噬細胞內以膜結合型存在，并多以旁分泌或自分泌的方式釋放，脂多糖是誘導其產生的強效刺激劑[24, 28]。TNF-α參與機體免疫應答和炎性反應，是血管源性腦水腫的觸發因素，并參與神經元的凋亡。其介導SAP腦損傷的機理主要是：①TNF-α對毛細血管有直接損傷作用,導致微小動脈痙攣，毛細血管通透性增加，使血腦屏障大量開放，抗原抗體結合機會增加，加重PE腦組織的損傷。②TNF-α可損傷內皮細胞，上調金屬蛋白酶（MMP）的表達，使基底膜上蛋白水解，進一步增加血腦屏障的通透性。③在TNF-α作用下，血小板活化因子合成表達，Ⅷ因子釋放，抑制抗凝功能，形成凝血前活性狀態，加重PE腦缺血損傷。④激活中性粒細胞，增加白細胞-內皮細胞黏附分子的表達，增加白細胞黏附到血管壁并隨之進入腦組織，刺激釋放有效的血管激活因子，導致血管收縮和舒張，降低血容量，增加BBB的通透性，加重PE癥狀。⑤TNF-α與增強毛細血管通透性的細胞介質形成“瀑布”樣級聯反應。⑥TNF-α介導髓鞘的炎性損傷，也可直接對髓鞘產生毒性破壞作用。本研究也進一步證明，在建模成功后的24 h，出現TNF-α的明顯增高，此期間腦組織的損傷也達高峰期。因此，降低TNF-α含量，抑制它與其他因子的聯級反應，可以減輕腦組織的損傷，降低PE發病率及死亡率。
3.3 IL-6對PE的影響
IL-6是腦損傷炎癥反應中一個重要的炎性細胞因子，它的產生途徑主要有兩種：①直接產生。多種有核細胞都可以直接產生IL-6，如B淋巴細胞、T淋巴細胞、內皮細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞等。②誘導產生，部分TNF-α和IL-1能誘導IL-6的合成[29-31]。在正常情況下，血液和腦脊液中IL-6的表達很低，但是在炎癥或損傷時其表達顯著增加。IL-6在中樞神經系統中的生理功能很復雜，主要表現在兩個方面，即介導炎癥和促進神經變性。PE發病時其損傷機理主要是：①可以促進細胞間黏附因子（ICAM-1）的表達，而ICAM-1是中性粒細胞黏附所必需的，使炎性細胞黏附與聚集，加重腦組織損傷。②IL-6激活MMP，導致血腦屏障的破壞，通透性增加。③IL-6刺激內皮細胞合成內皮素，促進血小板生成素活性與C反應蛋白的增加，使血液凝固性增加，加重腦損傷。④IL-6可誘導和調劑急性時相反應（acute phase reaction，APR），改變血管通透性及急性時相蛋白，介導PE的發生發展。
本實驗中，PE大鼠模型建立后，血清及腦脊液中MBP、TNF-α和IL-6水平在造模后1 d即明顯升高，并且隨著時間的延長一直維持在很高的水平，同時在不同時間點各因子有其增高的趨勢，說明在PE發病的7 d內各因子對腦組織的損害一直在起作用，它們相互之間既可能存在協同作用，又有彼此不同的損傷高峰，而腦組織損害也逐漸加強，表現為白細胞附壁數目增由和神經纖維脫髓鞘改變的加重。
綜上所述，在PE大鼠模型中，MBP、TNF-α和IL-6參與了大鼠PE腦組織損害的發生、發展，MBP、TNF-α和IL-6水平的增高與腦組織的病理損害相平行；在疾病的發生早期可以對它們的含量進行檢測，以診斷PE的發生及其嚴重程度，并及時給予治療以降低疾病的病死率。
胰性腦病（pancIeatic encephalopathy，PE）是重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）患者的嚴重并發癥。SAP患者表現有定向力障礙、煩躁不安、激動伴妄想、嗜睡等異常精神狀態的癥候群并將其定義為PE [1-3]。PE的病死率高，臨床報道逐漸增多，國內外對其關注度也有所提高,查閱國內2004～2014年文獻，對文獻報道病例進行統計，SAP合并PE患者243例，其中經治療無效死亡103例，病死率為42.4%。而此前國內學者[4]檢索1994 年以來SAP合并PE患者文獻，匯總國內文獻報道的PE患者 108 例，結果發現，PE發病率占同期SAP的9%～20%，平均為10.6%，病死率達 40.00%～66.67%。說明PE的發生率并不低。通過兩次病例統計發現，近年來PE的病死率無明顯變化，依然是高病死率，究其原因：①近年我們對PE的研究主要集中在發病機理的研究，而沒有進一步去研究PE的診斷及治療機制；②在動物實驗方面沒有為臨床提供足夠的依據。因此我們需要在熟知PE發病機理的基礎上，通過動物實驗試著去找到治療途徑，最終降低PE的病死率，為廣大患者帶來光明。
隨著大鼠PE模型建立的逐漸成熟，以及對PE發病機理研究的逐漸深入[5-7]，我們得知髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)是構成神經髓鞘的主要蛋白質，當MBP暴露或釋放至腦脊液中時，可引起免疫應答，刺激機體產生抗MBP抗體，刺激單核細胞產生TNF-α和IL-6，導致PE的發生發展[8-11]。如何利用這些因子的水平變化準確地診斷及治療PE，降低發病率及病死率，為臨床提供準確的實驗依據，是我們現在應重點研究的問題。
本研究將在大鼠PE模型上，同過分析病情發展與MBP、TNF-α和IL-6含量變化之間的相關性，旨在為PE的臨床診斷及治療提供新思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
5%牛磺膽酸鈉，美國SIGMA公司；一次性BD胰島素注射器，美國BD公司；大鼠MBP、TNF-α和IL-6 ELISA檢測試劑盒，美國Diagnostic Systems Lab-oratories公司；TP-B展片機、HP-B烤片機及組織包埋機，天津久圣醫療電子儀器有限公司；Leica RM2016切片機、LEICA EG 1150H蠟缸及LEICA EG 1150C冷卻臺，Leica公司；XS-212 002684顯微鏡，江南顯微鏡廠；HPX-9082 ME數顯電熱培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。
1.2 實驗動物及分組
健康清潔級SD大鼠40只，購自北京大學動物實驗中心，雌雄各半，體質量（260±40）g，購回后適應性喂養1周，應用拆信封法隨機分為SO組10只和PE組30只。PE組按照完全隨機化原則再分成造模后1 d、3 d及7 d 3個亞組。
1.3 PE動物模型制備
手術器械消毒，操作過程嚴格無菌，實驗大鼠術前禁食24 h，自由飲水。采用10%水合氯醛3.3 mL/kg腹腔注射麻醉。待麻醉滿意后將大鼠固定于手術臺，腹部術區備皮，常規碘伏消毒鋪巾，取上腹正中切口入腹，顯露十二指腸，辨認胰腺、膽管系統及肝門部膽管。于肝門部辨認肝門部膽總管，用小動脈夾暫時阻閉，于乳頭開口內下的腸壁上用一次性BD胰島素注射器以針頭與腸管壁成10o角刺入十二指腸壁內，經乳頭部插入胰膽管內，封閉胰膽管十二指腸開口端，以0.3 mL/min的速度勻速向胰膽管內注入5%牛磺膽酸鈉2 mL/kg。注射完畢后，去除夾閉的動脈夾，檢查見無明顯出血即漏膽后關腹。大鼠蘇醒后禁食，可飲水，分組進行飼養。SO組大鼠同法經十二指腸乳頭逆行胰膽管穿刺注射生理鹽水2 mL/kg，速度為0.3 mL/min。
SO組大鼠于造模后第1 d用10%水合氯醛（3.3ml/kg）腹腔注射麻醉后，經心臟右心房取血，同時左心房推注35%的甲醛水溶液20 mL。采用微量進樣器經硬脊膜穿刺抽取大鼠腦脊液，取完后處死大鼠，取腦組織及胰腺組織。PE組大鼠分別在造模后1 d、3 d及7 d用同法采取血液、腦脊液、腦組織及胰腺組織。
1.4 檢測指標及方法
1.4.1 一般項目觀察
造模成功后開始觀察大鼠呼吸、進食量、活動量、神經反射以及意識狀態。
1.4.2 血清MBP、TNF-α及IL-6水平測定
SO組大鼠于術后1 d和PE組大鼠分別于造模后1 d、3 d及7 d采靜脈血2 mL。用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清MBP、TNF-α及IL-6水平。
1.4.3 腦脊液MBP、TNF-α及IL-6水平測定
SO組大鼠于術后1 d抽取腦脊液標本400 μL和PE組大鼠分別于造模后1 d、3 d及7d抽取腦脊液標本400 μL，采用ELISA法檢測腦脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平。
1.4.4 腦組織含水量測定
將取得的大鼠腦組織用電子天平直接稱濕重，然后放在80 ℃烤箱中24 h烤干，再測大鼠腦組織的干重。腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。
1.4.5 腦組織及胰腺組織病理學觀察
取大鼠全部腦組織及胰腺組織行常規石蠟包埋、切片、HE染色,光鏡下觀察。另外，在光鏡下觀察20個腦微血管斷面，并計數20個斷面內聚集和附壁的白細胞總數，取其均數。
1.5 統計學方法
采用SPSS l3.0統計軟件。實驗數據用均數±標準差（
2 結果
2.1 大鼠一般情況
SO組大鼠麻醉清醒后（術后約25 min）即開始進食，活動無明顯減少。PE組大鼠麻醉蘇醒時間明顯延長（術后約40 min），造模后第2天，一般情況差，表現為進食減少，少動，弓背，精神萎靡，煩渴，腹脹明顯,但至造模后第7天，上述癥狀無明顯加重。
2.2 腦組織含水量檢測結果
結果見表 1。由表 1可見，造模后1 d、3 d及7 d PE組大鼠腦組織含水量均明顯高于SO組（P<0.05），但PE組造模后各時相間腦組織含水量比較其差異則無統計學意義（P>0.05）。
2.3 血清MBP、TNF-α和IL-6水平檢測結果
結果見表 1。由表 1可見，PE組大鼠造模后各時相血清MBP、TNF-α及IL-6水平均明顯高于SO組（P<0.05）；PE組大鼠造模后隨著時間的延長，血清MBP、TNF-α及IL-6水平均逐漸升高，經單因素方差分析顯示，其差異均有統計學意義（P<0.05）。進一步行兩兩比較，MBP在造模后3個時相間比較其差異均有統計學意義（P<0.05），而TNF-α和IL-6水平在造模后3 d及7 d高于造模后1 d（P<0.05），但造模后3 d與7 d比較其差異則無統計學意義（P>0.05）。
表1
2組大鼠腦組織含水量和血清MBP、TNF-α及IL-6水平檢測結果（2.4 腦脊液MBP、TNF-α和IL-6水平檢測結果
結果見表 2。由表 2可見，PE組大鼠造模后各時相腦脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平均明顯高于SO組（P<0.05）；PE組大鼠造模后隨著時間延長，腦脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平均逐漸升高，經單因素方差分析，其差異均有統計學意義（P<0.05）。進一步行兩兩比較，MBP在造模后7 d明顯高于造模后1 d及3 d（P<0.05），而造模后1 d及3 d間比較差異無統計學意義（P>0.05）；TNF-α在造模后7 d明顯高于造模后1 d（P<0.05），而造模后3 d與1 d比較和7 d與3 d比較其差異均無統計學意義（P>0.05）；IL-6在造模后7 d明顯高于造模后1 d及3 d（P<0.05），而造模后1 d及3 d間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
表2
2組大鼠腦脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平檢測結果（2.5 腦組織病理學改變
SO組大鼠可見散在的神經元細胞輕度水腫，腦組織內未見炎性細胞聚集，腦組織的微血管內有少數的白細胞附壁。PE組大鼠神經元細胞水腫明顯，在術后1 d即出現，隨著時間的延長，神經元細胞水腫加重，呈氣球樣變（圖 1）；腦組織中炎性細胞增生和聚集于術后1 d即開始出現，隨著時間的延長，炎性細胞數目明顯增多（圖 2）；小血管內皮細胞出現腫脹，微血管內白細胞發生聚集及附壁，其數目也隨著時間的延長而增加（圖 3）。
圖1
示PE組神經元細胞，可見明顯水腫，呈氣球樣變（HE ×200） ? ?圖 2 示PE組，見腦組織炎性細胞浸潤，表現為炎細胞聚集（HE ×200） ? ?圖 3 示PE組的腦組織微血管，黑箭示炎性細胞的附壁和聚集（HE ×200） ? ?圖 4 示PE組大鼠胰腺整體外觀，胰腺有明顯的出血壞死 ? ?圖 5 示PE組大鼠大體解剖，胰腺可見出血、水腫及滲出，胰腺周圍及腸系膜上可見散在鈣化灶 ? ?圖 6 示胰腺組織的病理改變，見胰腺小葉結構破壞，腺泡空泡變性,有大量炎性細胞浸潤（HE ×200）
2.6 胰腺組織病理學變化
SO組大鼠胰腺色澤正常，無肥厚，鏡下腺泡及小葉機構正常。PE組大鼠胰腺腺體外觀增大，肥厚，呈紅紫色（圖 4），可見腺體及周圍腸系膜上有散在皂化斑（圖 5）。鏡下可見腺泡嚴重破壞，血管消化，小葉結構模糊不清，壞死灶外有炎性區圍繞（圖 6）。
3 討論
SAP病情危重,變化復雜,早期以胰腺出血壞死為主,晚期多合并胰腺臟器的損傷。當出現中樞神經系統表現時被認為是PE [1, 12-15]。現在尚無特異性檢查方法和診斷標準，主要根據急性胰腺炎及其臨床表現進行診斷。就臨床表現我們應該首先慎重排除類似疾病：①Wernicke腦病。該病多發生在急性胰腺炎確診后2～3周，由于長時間禁食和高分解代謝，出現記憶力下降，定向力障礙等神經系統改變，但是無局灶性定位體征，并且在給予維生素B1后癥狀可好轉。而PE的發生多集中在SAP發生后2周內，補充維生素B1無明顯好轉。②急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。ARDS多發生在SAP確診后1周內，與PE的發病時間比較接近，同PE一樣伴有意識障礙，氧分壓較低可通過血氧檢測及時發現，通過機械通氣糾正低氧血癥后，癥狀可好轉。③電解質紊亂。由于急性胰腺炎的治療需要長期禁食，并且在急性期機體神經內分泌激素分泌水平出現異常，很容易出現低鈉、低鈣血癥，臨床可表現為嗜睡、淡漠、無力等，容易和PE混淆，但是在糾正電解質紊亂后腦功能障礙則可緩解。④低血糖。當重癥胰腺炎并發低血糖時，患者會出現意識障礙、嗜睡等中樞神經系統癥狀，及時給予高糖可糾正。⑤當患者有腦出血或腦梗塞時，可出現煩躁、譫妄等神經癥狀，CT和MRI可確診，比較容易和PE鑒別。通過臨床表現我們可以診斷PE的發生，但這是一個很復雜的過程，PE的發展速度較快，預后較差，這就要求我們在PE的診斷上要尋找新思路、新方法，使診斷能更快，這樣才能降低中樞神經系統的損傷。為對PE發病機理進行進一步研究，本研究采用逆行胰膽管穿刺注射5%牛磺膽酸鈉的方法誘導建立大鼠PE模型，檢測在PE發生發展中關鍵免疫因子的水平，分析其與疾病的相關性，旨在為臨床診治PE提供一種新的手段。
3.1 MBP對PE的影響
在MBP介導脫髓鞘病變時存在免疫忽視，自身抗原的能量效應能致淋巴細胞克隆清除或克隆忽視，是經抗原轉基因小鼠證實的。小鼠的實驗性變態反應性腦脊髓炎（EAE）就是由對自身MBP的多肽特異應答Th1細胞被活化所致的一種典型的中樞神經系統損傷[16-17]。在實驗性對MBP特異性識別的TCR轉基因小鼠體內，大部分T淋巴細胞均表達轉基因的MBP特異性T淋巴細胞抗原受體（TCR），但不引起EAE，其原因是外周組織MBP的表達量很低，只有在中樞神經系統中MBP表達量才高，但是該處是免疫隔離部位，初始T淋巴細胞不能進入[18]。這些免疫忽視的自身應答性T淋巴細胞，會因感染的病原體與自身抗原的分子模擬作用，使抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）活化，高表達B7等輔助刺激分子，提供第二信號，誘導免疫應答，產生效應T淋巴細胞，傷害相應自身組織細胞。隨感染的控制及消失，APC不再活化，這種自身應答細胞又恢復到靜止的免疫忽視狀態[19-20]。
SAP發病時，胰腺出現出血壞死，誘導其產生大量脂酶，其中可溶性磷脂酶A2（soluble phospholipase A2，S-PLA2）是胰腺的產物。PLA2被蛋白酶、離子激活后，催化斷裂卵磷脂的第2位脂鍵，使胰液中的卵磷脂和腦磷脂其轉變為溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine）和溶血性腦磷脂（lysocephalin），使細胞膜分解，具有高度的細胞毒性和嗜神經性。當破壞了腦細胞的功能后引起腦組織損傷。它可以影響細胞膜的通透性，破壞血腦脊液的屏障。此時中樞神經系統MBP的免疫忽視狀態被打破。在APC表面，同時表達MHC-ⅡAg、MBP等抗原的表位，而在T淋巴細胞中有MBP抗原致敏T淋巴細胞，T淋巴細胞對其進行雙識別后，自身抗原肽段MHC-Ⅱ類抗原復合物刺激CD4+ Th1細胞分化為致敏CD4+ Thl細胞，當它們與特異抗原再次結合后可釋放多種細胞因子，介導細胞免疫，在PE中樞神經系統的脫髓鞘破壞中起主要作用[21-23]。T淋巴細胞增殖與干擾素-γ（IFN-γ）的量相互作用，Thl決定了每個亞群的免疫效應功能,還調控各亞群的形成及擴增，IFN-γ反作用于Th1,促使其進一步分化，產生更多的Th1細胞[24]。此外，特異性T淋巴細胞克隆增殖并形成記憶性T淋巴細胞，當再次遇到同一抗原時將引起記憶性T淋巴細胞的激活進行免疫應答[25-27]，這樣就形成了“瀑布”樣級聯反應，加重PE的發展。
3.2 TNF-α對PE的影響
TNF-α是一種單核因子，生物活性占TNF總活性的70%～80%，主要由單核細胞和巨噬細胞產生，在活化的巨噬細胞內以膜結合型存在，并多以旁分泌或自分泌的方式釋放，脂多糖是誘導其產生的強效刺激劑[24, 28]。TNF-α參與機體免疫應答和炎性反應，是血管源性腦水腫的觸發因素，并參與神經元的凋亡。其介導SAP腦損傷的機理主要是：①TNF-α對毛細血管有直接損傷作用,導致微小動脈痙攣，毛細血管通透性增加，使血腦屏障大量開放，抗原抗體結合機會增加，加重PE腦組織的損傷。②TNF-α可損傷內皮細胞，上調金屬蛋白酶（MMP）的表達，使基底膜上蛋白水解，進一步增加血腦屏障的通透性。③在TNF-α作用下，血小板活化因子合成表達，Ⅷ因子釋放，抑制抗凝功能，形成凝血前活性狀態，加重PE腦缺血損傷。④激活中性粒細胞，增加白細胞-內皮細胞黏附分子的表達，增加白細胞黏附到血管壁并隨之進入腦組織，刺激釋放有效的血管激活因子，導致血管收縮和舒張，降低血容量，增加BBB的通透性，加重PE癥狀。⑤TNF-α與增強毛細血管通透性的細胞介質形成“瀑布”樣級聯反應。⑥TNF-α介導髓鞘的炎性損傷，也可直接對髓鞘產生毒性破壞作用。本研究也進一步證明，在建模成功后的24 h，出現TNF-α的明顯增高，此期間腦組織的損傷也達高峰期。因此，降低TNF-α含量，抑制它與其他因子的聯級反應，可以減輕腦組織的損傷，降低PE發病率及死亡率。
3.3 IL-6對PE的影響
IL-6是腦損傷炎癥反應中一個重要的炎性細胞因子，它的產生途徑主要有兩種：①直接產生。多種有核細胞都可以直接產生IL-6，如B淋巴細胞、T淋巴細胞、內皮細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞等。②誘導產生，部分TNF-α和IL-1能誘導IL-6的合成[29-31]。在正常情況下，血液和腦脊液中IL-6的表達很低，但是在炎癥或損傷時其表達顯著增加。IL-6在中樞神經系統中的生理功能很復雜，主要表現在兩個方面，即介導炎癥和促進神經變性。PE發病時其損傷機理主要是：①可以促進細胞間黏附因子（ICAM-1）的表達，而ICAM-1是中性粒細胞黏附所必需的，使炎性細胞黏附與聚集，加重腦組織損傷。②IL-6激活MMP，導致血腦屏障的破壞，通透性增加。③IL-6刺激內皮細胞合成內皮素，促進血小板生成素活性與C反應蛋白的增加，使血液凝固性增加，加重腦損傷。④IL-6可誘導和調劑急性時相反應（acute phase reaction，APR），改變血管通透性及急性時相蛋白，介導PE的發生發展。
本實驗中，PE大鼠模型建立后，血清及腦脊液中MBP、TNF-α和IL-6水平在造模后1 d即明顯升高，并且隨著時間的延長一直維持在很高的水平，同時在不同時間點各因子有其增高的趨勢，說明在PE發病的7 d內各因子對腦組織的損害一直在起作用，它們相互之間既可能存在協同作用，又有彼此不同的損傷高峰，而腦組織損害也逐漸加強，表現為白細胞附壁數目增由和神經纖維脫髓鞘改變的加重。
綜上所述，在PE大鼠模型中，MBP、TNF-α和IL-6參與了大鼠PE腦組織損害的發生、發展，MBP、TNF-α和IL-6水平的增高與腦組織的病理損害相平行；在疾病的發生早期可以對它們的含量進行檢測，以診斷PE的發生及其嚴重程度，并及時給予治療以降低疾病的病死率。
