引用本文： 王剛, 鐘紅珊. 控制性灌注血必凈注射液對兔后肢缺血再灌注損傷的保護作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(5): 560-564. doi: 10.7507/1007-9424.20150149 復制
下肢缺血性疾病有較高的發病率和死亡率，并且臨床費用較大。雖然在過去的幾十年里，針對于它的治療在外科及藥理學方面取得了巨大的進展，但整體預后往往令人不甚滿意，各種原因導致的死亡率仍然超過25%，同時幸存者面臨的截肢風險約為20% [1]。隨著近些年介入診療技術突飛猛進的發展，使安全且快速恢復下肢血流成為可能，也為臨床工作指明了新的方向，這極大地推動了臨床對下肢缺血性疾病的治療。雖然快速恢復缺血肢體血流灌注尤為重要，但它會導致缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷不僅影響缺血肢體的存活及功能，而且還會累及遠器官組織，嚴重時會引起人體多器官功能衰竭而死亡[2-3]。研究[4]表明，骨骼肌可在長時間缺血后依然能夠保持結構和功能的完整性，這提示當處理下肢缺血性疾病時，防治缺血再灌注損傷顯得尤為關鍵。血必凈是由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸等多種中藥提取的制劑，目前在臨床上主要用于感染（膿毒癥）、嚴重創傷、燒傷等引起的多器官功能障礙綜合征的器官功能受損期及衰竭早期患者，臨床治療效果良好[5-6]。本實驗通過制作兔后肢缺血再灌注損傷模型，觀察各組血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的變化，以及后肢CT灌注參數的變化，探討控制性灌注血必凈注射液是否對肢體缺血再灌注損傷有保護作用，并為臨床通過灌注血必凈防治肢體缺血后再灌注損傷提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
健康成年大耳白兔30只，平均體質量2.0～2.5 kg，雌雄不限，均由中國醫科大學實驗中心動物部提供。將30只白兔應用隨機數字表完全隨機化分為3組，分別為血必凈灌注組（n=10）、鹽水對照組（n=10）及假手術組（n=10）。
1.2 藥物
血必凈注射液購自天津紅日藥業股份有限公司，國藥準字Z2004003，規格10 mL/支。
1.3 造模與給藥
實驗前兔禁食12 h，自由飲水。腹腔注射戊巴比妥30 mg/kg麻醉，麻醉滿意后從左側頸動脈引入4 F球囊至腎下主動脈，阻斷血管，制成雙后肢缺血模型（圖 1）。阻斷血管90 min后，經球囊控制性灌注血必凈30 min后撤出球囊，使后肢血運恢復（圖 2），制成雙后肢缺血再灌注損傷模型。缺血時間共2 h，再灌注時間為4 h。血必凈灌注組控制性灌注方法：首先將血必凈按每公斤體質量抽取4 mL注射液，用生理鹽水配至10 mL，使用注射泵持續30 min泵入。鹽水對照組則使用相同方法造模，同樣使用控制性灌注的方法，灌注液為生理鹽水（4 mL/kg）。假手術組僅成功完成頸動脈穿刺，不進行后面的操作，即不予缺血及再灌注處理。
圖1
4 F球囊阻斷腎下主動脈，造成雙后肢缺血??圖 2??2 h后撤出球囊，雙后肢血運恢復
1.4 檢測指標
1.4.1 血清SOD及MDA檢測方法
于術前10 min及再灌注4 h后取動脈血測定SOD、MDA值，采用碧云天公司試劑盒在美國Gene公司自動酶標儀上測定。
1.4.2 CT灌注影像學評價方法
各組兔采用東芝640 CT掃描，于術前30 min及再灌注4 h后行CT灌注掃描，得到每組每只兔后肢灌注參數的平均值，計算術后或再灌注后與術前血流量比值（ratio of blood flow，rBF）和血容量比值（ratio of blood volume，rBV），并得到各灌注參數的偽彩圖。以每只家兔術前數據作為基線，術后或再灌注后灌注參數恢復情況以百分數形式表示。
1.5 統計學方法
統計分析軟件采用SPSS 16.0，各組數據采用均數±標準差（
2 結果
2.1 術前及術后或再灌注后4 h時血清中SOD活性及MDA含量
結果見圖 3。①組內對比：假手術組術前及術后血清中SOD活性及MDA含量未見明顯變化（P > 0.05）；鹽水對照組再灌注后血清中SOD活性較術前略升高（P > 0.05），MDA較術前明顯升高（P < 0.01）；血必凈灌注組再灌注后血清中SOD活性較術前明顯升高（P < 0.01），MDA較術前明顯降低（P < 0.01）。②組間對比：與假手術組比較，鹽水對照組及血必凈灌注組再灌注后血清中SOD活性提高（P < 0.01），MDA水平血必凈灌注組明顯降低（P < 0.01），鹽水對照組明顯升高（P < 0.01）；與鹽水對照組比較，血必凈灌注組灌注后血清中SOD活性明顯提高（P < 0.01），MDA水平明顯降低（P < 0.01）。
圖3
術前、術后或再灌注后4 h時血清SOD和MDA值。3A：SOD；3B：MDA。與同一組內術前比較，* P < 0.01。與假手術組比較，△P < 0.01；與鹽水對照組比較，# P < 0.01
2.2 CT灌注結果
各組實驗動物術前及術后或再灌注后的BV、BF偽彩圖見圖 4～7。與假手術組比較，鹽水對照組及血必凈灌注組的rBF及rBV均明顯下降（P < 0.05）；與鹽水對照組比較，血必凈灌注組rBF及rBV均明顯升高（P < 0.05），見圖 8。提示血必凈灌注可有效改善后肢灌注量。
圖4
各組術前BF偽彩圖。4A：假手術組；4B：鹽水對照組；4C：血必凈灌注組??圖 5??各組術后或再灌注后4 h時BF偽彩圖。5A：假手術組；5B：鹽水對照組；5C：血必凈灌注組??圖 6??各組術前BV偽彩圖。6A：假手術組；6B：鹽水對照組；6C：血必凈灌注組??圖 7??各組術后或再灌注后4 h時BV偽彩圖。7A：假手術組；7B：鹽水對照組；7C：血必凈灌注組
圖8
各組術后或再灌注后4 h時rBF和rBV的變化。與假手術組比較，* P < 0.05；與鹽水對照組比較，△P < 0.05
3 討論
1985年，McCord [7]提出缺血再灌注損傷的概念后，其產生的機制一直都存在爭議。1992年，Menger等[8]將缺血再灌注損傷的機制分成兩種，分別是無復流損傷（no-reflow）與復流波動損傷（reflow-paradox）。
已有研究[9-10]表明，缺血時間的長短，對于缺血再灌注損傷的具體類型的確定起到決定性作用。引起下肢缺血的原因，主要有動脈血栓栓塞及原位血栓形成。血栓栓塞所致的下肢缺血通常是完全性急性缺血，由于無側支循環建立，這種缺血的完全再通率反而較高[11-12]。相反，由動脈粥樣硬化引起的原位血栓形成所致的下肢缺血，通常是慢性的不完全性缺血，往往形成大量側支循環建立，但完全再通率相對較低。研究[9]表明，骨骼肌可在長時間缺血后，依然能夠保持結構和功能的完整性，這重要提示當處理下肢缺血性疾病時，防治缺血再灌注損傷顯得尤為關鍵。隨著再灌注的開始，一系列損傷將會接連出現[13-14]：①白細胞及血小板的活化與黏附；②炎性物質的產生；③鈣離子內流；④細胞膜離子泵的破壞；⑤氧自由基的產生；⑥細胞死亡。目前對于下肢缺血再灌注損傷的防治策略主要包括[15-16]：缺血預處理、缺血后處理、控制性灌注等方式，其使用條件及效果多有不同，但在臨床中以控制性灌注較為容易實現。
1969年，McCord等[17]首先揭示了SOD的生物學作用。目前為止，SOD是生物體內被發現的能夠清除自由基的首要物質，它不僅能快速地將超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧分子，而且在清除氧自由基、防止氧自由基破壞細胞的結構和功能、保護細胞免受氧化損傷等方面起到非常關鍵的作用。SOD在生物體內的活性高低與細胞的衰老及死亡有一定的相關性，活性越高，代表機體受到自由基的損傷越輕。此外，氧自由基對細胞的損害主要是通過脂質過氧化，其代謝的主要產物是MDA，其含量的高低直接能夠反映出氧自由基的代謝以及脂質過氧化對機體造成損傷的程度[18-19]。
血必凈注射液作為一種中藥靜脈制劑，是以古方血府逐瘀湯為基礎精煉而出。血必凈不僅具有能有效控制炎癥介質、改善凝血功能等功能[20-21]，而且還有抑制心肌細胞鈣超載、減輕心肌損傷等作用[22-23]。有研究[24]表明，血必凈的主要成份川芎、丹參等具有清除氧自由基的功能。張良等[25]通過對兔肢體缺血再灌注損傷的研究，發現控制性灌注血必凈注射液除了可以調節肢體缺血再灌注損傷后機體凝血功能，明顯減輕微循環障礙，降低毛細血管通透性，還可有效減輕肌組織細胞再灌注損傷，抑制氧自由基的產生，減少脂質過氧化物的形成，從而對肢體缺血再灌注損傷起到一定的保護作用。
本研究結果顯示，假手術組術前及術后血清中SOD、MDA未見明顯變化，鹽水對照組再灌注后血清中SOD較術前略升高，MDA較術前明顯升高（P < 0.01），而血必凈灌注組再灌注后血清中SOD較術前明顯升高（P < 0.01），MDA較術前明顯減低（P < 0.01）；血必凈灌注組與假手術組比較，灌注后血清中SOD活性提高，MDA水平降低；與鹽水對照組比較，血必凈灌注組血清中SOD活性明顯提高（P < 0.01），MDA水平顯著減低（P < 0.01），以上結果提示血必凈對缺血再灌注損傷有一定的保護和預防作用，同時它在清除氧自由基及減少脂質過氧化作用方面有非常顯著的作用。此外，鹽水對照組及血必凈灌注組灌注量較假手術組均有明顯下降，相對于鹽水對照組，血必凈灌注組rBF及rBV明顯升高，證明血必凈能有效改善后肢灌注量（P < 0.05），提示控制性灌注血必凈能有效改善后肢灌注量，這也為臨床藥物應用上提供了一定的參考依據。
下肢缺血性疾病有較高的發病率和死亡率，并且臨床費用較大。雖然在過去的幾十年里，針對于它的治療在外科及藥理學方面取得了巨大的進展，但整體預后往往令人不甚滿意，各種原因導致的死亡率仍然超過25%，同時幸存者面臨的截肢風險約為20% [1]。隨著近些年介入診療技術突飛猛進的發展，使安全且快速恢復下肢血流成為可能，也為臨床工作指明了新的方向，這極大地推動了臨床對下肢缺血性疾病的治療。雖然快速恢復缺血肢體血流灌注尤為重要，但它會導致缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷不僅影響缺血肢體的存活及功能，而且還會累及遠器官組織，嚴重時會引起人體多器官功能衰竭而死亡[2-3]。研究[4]表明，骨骼肌可在長時間缺血后依然能夠保持結構和功能的完整性，這提示當處理下肢缺血性疾病時，防治缺血再灌注損傷顯得尤為關鍵。血必凈是由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸等多種中藥提取的制劑，目前在臨床上主要用于感染（膿毒癥）、嚴重創傷、燒傷等引起的多器官功能障礙綜合征的器官功能受損期及衰竭早期患者，臨床治療效果良好[5-6]。本實驗通過制作兔后肢缺血再灌注損傷模型，觀察各組血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的變化，以及后肢CT灌注參數的變化，探討控制性灌注血必凈注射液是否對肢體缺血再灌注損傷有保護作用，并為臨床通過灌注血必凈防治肢體缺血后再灌注損傷提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
健康成年大耳白兔30只，平均體質量2.0～2.5 kg，雌雄不限，均由中國醫科大學實驗中心動物部提供。將30只白兔應用隨機數字表完全隨機化分為3組，分別為血必凈灌注組（n=10）、鹽水對照組（n=10）及假手術組（n=10）。
1.2 藥物
血必凈注射液購自天津紅日藥業股份有限公司，國藥準字Z2004003，規格10 mL/支。
1.3 造模與給藥
實驗前兔禁食12 h，自由飲水。腹腔注射戊巴比妥30 mg/kg麻醉，麻醉滿意后從左側頸動脈引入4 F球囊至腎下主動脈，阻斷血管，制成雙后肢缺血模型（圖 1）。阻斷血管90 min后，經球囊控制性灌注血必凈30 min后撤出球囊，使后肢血運恢復（圖 2），制成雙后肢缺血再灌注損傷模型。缺血時間共2 h，再灌注時間為4 h。血必凈灌注組控制性灌注方法：首先將血必凈按每公斤體質量抽取4 mL注射液，用生理鹽水配至10 mL，使用注射泵持續30 min泵入。鹽水對照組則使用相同方法造模，同樣使用控制性灌注的方法，灌注液為生理鹽水（4 mL/kg）。假手術組僅成功完成頸動脈穿刺，不進行后面的操作，即不予缺血及再灌注處理。
圖1
4 F球囊阻斷腎下主動脈，造成雙后肢缺血??圖 2??2 h后撤出球囊，雙后肢血運恢復
1.4 檢測指標
1.4.1 血清SOD及MDA檢測方法
于術前10 min及再灌注4 h后取動脈血測定SOD、MDA值，采用碧云天公司試劑盒在美國Gene公司自動酶標儀上測定。
1.4.2 CT灌注影像學評價方法
各組兔采用東芝640 CT掃描，于術前30 min及再灌注4 h后行CT灌注掃描，得到每組每只兔后肢灌注參數的平均值，計算術后或再灌注后與術前血流量比值（ratio of blood flow，rBF）和血容量比值（ratio of blood volume，rBV），并得到各灌注參數的偽彩圖。以每只家兔術前數據作為基線，術后或再灌注后灌注參數恢復情況以百分數形式表示。
1.5 統計學方法
統計分析軟件采用SPSS 16.0，各組數據采用均數±標準差（
2 結果
2.1 術前及術后或再灌注后4 h時血清中SOD活性及MDA含量
結果見圖 3。①組內對比：假手術組術前及術后血清中SOD活性及MDA含量未見明顯變化（P > 0.05）；鹽水對照組再灌注后血清中SOD活性較術前略升高（P > 0.05），MDA較術前明顯升高（P < 0.01）；血必凈灌注組再灌注后血清中SOD活性較術前明顯升高（P < 0.01），MDA較術前明顯降低（P < 0.01）。②組間對比：與假手術組比較，鹽水對照組及血必凈灌注組再灌注后血清中SOD活性提高（P < 0.01），MDA水平血必凈灌注組明顯降低（P < 0.01），鹽水對照組明顯升高（P < 0.01）；與鹽水對照組比較，血必凈灌注組灌注后血清中SOD活性明顯提高（P < 0.01），MDA水平明顯降低（P < 0.01）。
圖3
術前、術后或再灌注后4 h時血清SOD和MDA值。3A：SOD；3B：MDA。與同一組內術前比較，* P < 0.01。與假手術組比較，△P < 0.01；與鹽水對照組比較，# P < 0.01
2.2 CT灌注結果
各組實驗動物術前及術后或再灌注后的BV、BF偽彩圖見圖 4～7。與假手術組比較，鹽水對照組及血必凈灌注組的rBF及rBV均明顯下降（P < 0.05）；與鹽水對照組比較，血必凈灌注組rBF及rBV均明顯升高（P < 0.05），見圖 8。提示血必凈灌注可有效改善后肢灌注量。
圖4
各組術前BF偽彩圖。4A：假手術組；4B：鹽水對照組；4C：血必凈灌注組??圖 5??各組術后或再灌注后4 h時BF偽彩圖。5A：假手術組；5B：鹽水對照組；5C：血必凈灌注組??圖 6??各組術前BV偽彩圖。6A：假手術組；6B：鹽水對照組；6C：血必凈灌注組??圖 7??各組術后或再灌注后4 h時BV偽彩圖。7A：假手術組；7B：鹽水對照組；7C：血必凈灌注組
圖8
各組術后或再灌注后4 h時rBF和rBV的變化。與假手術組比較，* P < 0.05；與鹽水對照組比較，△P < 0.05
3 討論
1985年，McCord [7]提出缺血再灌注損傷的概念后，其產生的機制一直都存在爭議。1992年，Menger等[8]將缺血再灌注損傷的機制分成兩種，分別是無復流損傷（no-reflow）與復流波動損傷（reflow-paradox）。
已有研究[9-10]表明，缺血時間的長短，對于缺血再灌注損傷的具體類型的確定起到決定性作用。引起下肢缺血的原因，主要有動脈血栓栓塞及原位血栓形成。血栓栓塞所致的下肢缺血通常是完全性急性缺血，由于無側支循環建立，這種缺血的完全再通率反而較高[11-12]。相反，由動脈粥樣硬化引起的原位血栓形成所致的下肢缺血，通常是慢性的不完全性缺血，往往形成大量側支循環建立，但完全再通率相對較低。研究[9]表明，骨骼肌可在長時間缺血后，依然能夠保持結構和功能的完整性，這重要提示當處理下肢缺血性疾病時，防治缺血再灌注損傷顯得尤為關鍵。隨著再灌注的開始，一系列損傷將會接連出現[13-14]：①白細胞及血小板的活化與黏附；②炎性物質的產生；③鈣離子內流；④細胞膜離子泵的破壞；⑤氧自由基的產生；⑥細胞死亡。目前對于下肢缺血再灌注損傷的防治策略主要包括[15-16]：缺血預處理、缺血后處理、控制性灌注等方式，其使用條件及效果多有不同，但在臨床中以控制性灌注較為容易實現。
1969年，McCord等[17]首先揭示了SOD的生物學作用。目前為止，SOD是生物體內被發現的能夠清除自由基的首要物質，它不僅能快速地將超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧分子，而且在清除氧自由基、防止氧自由基破壞細胞的結構和功能、保護細胞免受氧化損傷等方面起到非常關鍵的作用。SOD在生物體內的活性高低與細胞的衰老及死亡有一定的相關性，活性越高，代表機體受到自由基的損傷越輕。此外，氧自由基對細胞的損害主要是通過脂質過氧化，其代謝的主要產物是MDA，其含量的高低直接能夠反映出氧自由基的代謝以及脂質過氧化對機體造成損傷的程度[18-19]。
血必凈注射液作為一種中藥靜脈制劑，是以古方血府逐瘀湯為基礎精煉而出。血必凈不僅具有能有效控制炎癥介質、改善凝血功能等功能[20-21]，而且還有抑制心肌細胞鈣超載、減輕心肌損傷等作用[22-23]。有研究[24]表明，血必凈的主要成份川芎、丹參等具有清除氧自由基的功能。張良等[25]通過對兔肢體缺血再灌注損傷的研究，發現控制性灌注血必凈注射液除了可以調節肢體缺血再灌注損傷后機體凝血功能，明顯減輕微循環障礙，降低毛細血管通透性，還可有效減輕肌組織細胞再灌注損傷，抑制氧自由基的產生，減少脂質過氧化物的形成，從而對肢體缺血再灌注損傷起到一定的保護作用。
本研究結果顯示，假手術組術前及術后血清中SOD、MDA未見明顯變化，鹽水對照組再灌注后血清中SOD較術前略升高，MDA較術前明顯升高（P < 0.01），而血必凈灌注組再灌注后血清中SOD較術前明顯升高（P < 0.01），MDA較術前明顯減低（P < 0.01）；血必凈灌注組與假手術組比較，灌注后血清中SOD活性提高，MDA水平降低；與鹽水對照組比較，血必凈灌注組血清中SOD活性明顯提高（P < 0.01），MDA水平顯著減低（P < 0.01），以上結果提示血必凈對缺血再灌注損傷有一定的保護和預防作用，同時它在清除氧自由基及減少脂質過氧化作用方面有非常顯著的作用。此外，鹽水對照組及血必凈灌注組灌注量較假手術組均有明顯下降，相對于鹽水對照組，血必凈灌注組rBF及rBV明顯升高，證明血必凈能有效改善后肢灌注量（P < 0.05），提示控制性灌注血必凈能有效改善后肢灌注量，這也為臨床藥物應用上提供了一定的參考依據。
