引用本文： 閻立昆, 張欣, 張潯, 王軍, 萬一, 蘇春, 姚建鋒, 毛智軍. 黏細菌代謝產物NX52和NX83對結直腸癌細胞增殖的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(5): 549-554. doi: 10.7507/1007-9424.20150146 復制
結直腸癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一[1-2]。目前，結直腸癌晚期或術后治療以化療為主，但所應用的化療藥物及方案的總體療效并不理想，其主要原因是化療過程中結直腸癌細胞的多藥耐藥現象導致化療失敗[3-5]。黏細菌是一類具有多細胞行為的革蘭陰性細菌[6-7]，能夠產生豐富的次級代謝產物，具有種類多、結構新、作用機制新穎多樣的特性，被公認為是繼放線菌之后的又一個重要的藥源微生物新類群[7-9]。秦巴山區作為我國最大的自然資源保護區之一，其微生物資源在全國乃至全世界都是獨一無二的，其中蘊含的黏細菌類型更是多種多樣，因此，從中篩選代謝產物尋找抗腫瘤藥物具有獨特的優勢和巨大的潛力。前期本研究團隊建立了秦巴山區黏細菌代謝產物庫，并篩選獲得一系列抗真菌代謝產物，其中來源于珊瑚狀珊瑚球菌和變綠色黏球菌的代謝產物NX52和NX83具有很好的抗真菌作用。本研究通過檢測人結直腸癌細胞HT-29、SW480和SW1463的細胞增殖抑制和細胞凋亡來探討黏細菌代謝產物體外抗結直腸癌活性，驗證我們篩選模型的合理性，為進一步開發和研究分離抗腫瘤化合物奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 試劑與材料
人結腸癌細胞HT-29來自中國科學院細胞庫，結腸癌細胞株SW480和直腸癌細胞株SW1463來自美國菌種保存中心；兩種黏細菌代謝產物NX52和NX83分別來源于珊瑚狀珊瑚球菌和變綠色黏球菌的發酵粗提物，由陜西省微生物研究所建立的秦巴山區黏細菌菌株庫及其代謝產物庫提供；噻唑藍溴化四唑（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國Merck公司；酶聯免疫檢測儀購自美國Bi-TEK公司，流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 人結直腸癌細胞培養
將腫瘤細胞接種于RPMI 1640培養液中（含10%胎牛血清），置于37℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中，1～2 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。
1.2.2 細胞形態學觀察
當96孔板中細胞貼壁生長80%時，吸出培養液，加入含上述不同濃度（0.1 mg/mL、1.0 mg/mL和10.0 mg/mL）代謝產物粗提物的培養液，置于37℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中分別培養24 h、48 h和72 h后，PBS沖洗兩遍，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化及增殖情況。
1.2.3 MTT法檢測細胞增殖抑制
以1×105/mL的濃度分別接種HT-29、SW480、SW1463細胞于96孔板，每孔加入100μL，待細胞貼壁80%后小心吸出培養液，加入終濃度為0.1 mg/mL、1.0 mg/mL和10.0 mg/mL的黏細菌代謝產物粗提物（NX52或NX83），陰性對照組細胞不加黏細菌代謝產物NX52或NX83，空白對照組無細胞，只加培養液。分別培養24 h、48 h和72 h后加入MTT檢測吸光度（A）值，每組設4個復孔，重復實驗3次。計算細胞增殖抑制率，計算公式為：增殖抑制率（%）=（1-處理組A值/陰性對照組A值）×100%。
1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡
將直腸癌細胞SW1463接種于6孔培養板，依據MTT實驗結果：高濃度代謝產物對于篩選腫瘤細胞的增殖抑制率效果甚微，因而選取具有實驗意義的濃度分別為0.1 mg/mL和1.0 mg/mL的黏細菌代謝產物NX83進行實驗，同時設立不加代謝產物的陰性對照組細胞。待細胞貼壁80%后分別加入不同濃度（0.1 mg/mL和1.0 mg/mL）的黏細菌代謝產物粗提物NX83，繼續培養48 h后轉移培養液并加入胰酶，顯微鏡下觀察細胞開始收縮時輕輕吹打細胞，培養液重懸細胞密度約1×106/mL，取0.5 mL細胞懸液加入10μL培養基結合試劑，加入1.25μL Annexin V-FITC，室溫避光反應15 min，室溫1 000×g離心5 min，去除培養基，將細胞用0.5 mL 1×結合緩沖液輕輕重懸，加入10μL碘化丙啶，冰上避光保存，立即用流式細胞儀檢測分析，計算細胞凋亡率。
1.3 統計學方法
實驗所有數據應用SPSS 19.0軟件處理，所有數據用均數±標準差（
2 結果
2.1 倒置顯微鏡下結直腸癌細胞的形態學變化
在倒置顯微鏡下觀察結直腸癌細胞形態學變化結果見圖 1～3。加藥處理后48 h時，陰性對照組細胞呈梭行、多邊形或類圓形，貼壁生長良好；發酵粗提物處理過的結直腸癌可見細胞變圓，細胞間隙增大，細胞膜皺縮、不連續，邊界模糊不清，細胞漿內出現空泡，部分細胞腫脹破裂、脫落，漂浮于培養液中。從圖中可見，黏細菌發酵粗提物對細胞株HT-29、SW1463和SW480均有抑制作用，隨著濃度的增高和作用時間的延長，貼壁細胞數量顯著減少。
圖1
各濃度代謝產物粗提物作用HT-29結腸癌細胞48 h后細胞形態變化結果（??×100）。1A：NX52陰性對照；1B：NX52 0.1 mg/mL；1C：NX52 1.0 mg/m；1D：NX52 10.0 mg/mL；1E：NX83陰性對照；1F：NX83 0.1 mg/mL；1G：NX83 1.0 mg/mL；1H：NX83 10.0 mg/mL??圖 2??各濃度代謝產物粗提物作用SW1463細胞48 h后細胞形態變化結果（??×100）。2A：NX52陰性對照；2B：NX52 0.1 mg/mL；2C：NX52 1.0 mg/mL；2D：NX52 10.0 mg/mL；2E：NX83陰性對照；2F：NX83 0.1 mg/mL；2G：NX83 1.0 mg/mL；2H：NX83 10.0 mg/mL??圖 3??各濃度代謝產物粗提物作用SW480細胞48 h后細胞形態變化結果（??×100）。3A：NX52陰性對照；3B：NX52 0.1 mg/mL；3C：NX52 1.0 mg/mL；3D：NX52 10.0 mg/mL；3E：NX83陰性對照；3F：NX83 0.1 mg/mL；3G：NX83 1.0 mg/mL；3H：NX83 10.0 mg/mL
2.2 MTT法檢測不同黏細菌代謝產物粗提物對人結直腸癌細胞增殖抑制結果
2.2.1 HT-29細胞
結果見表 1。從表 1可見：①相同濃度的同一黏細菌代謝產物（NX52或NX83），隨著作用時間的延長，對HT-29細胞的增殖抑制率逐漸升高（P < 0.05）；②同一黏細菌代謝產物（NX52或NX83）在相同時間，隨藥物濃度增加，HT-29細胞的增殖抑制率逐漸升高（P < 0.05）；③黏細菌代謝產物NX83在相同濃度作用相同時間時，對HT-29細胞的增殖抑制率均分別明顯高于NX52（P < 0.05）。
表1
兩種代謝產物對HT-29細胞的增殖抑制率影響（n=3，%，2.2.2 SW1463和SW480細胞
結果見表 2。從表 2可見：①相同濃度的同一黏細菌代謝產物（NX52或NX83），隨著作用時間的延長，對SW1463和SW480細胞的增殖抑制率呈上升趨勢；②同一黏細菌代謝產物（NX52或NX83）在相同時間，隨藥物濃度增加，對SW1463或SW480細胞的增殖抑制率顯著增高（P < 0.05）；③黏細菌代謝產物NX83在相同濃度作用相同時間時，對SW1463或SW480細胞的增殖抑制率均分別明顯高于NX52（P < 0.05）；④兩種黏細菌代謝產物NX83和NX52在相同濃度作用相同時間時對SW1463細胞的增殖抑制率均分別明顯高于對SW480細胞的增殖抑制率（P < 0.05）。
表2
兩種代謝產物粗提物對SW1463細胞及SW480細胞的增殖抑制率影響（n=3，%，2.3 流式細胞術檢測不同濃度代謝產物NX83作用于直腸癌SW1463細胞48 h后對細胞凋亡率的影響
與陰性對照組相比，黏細菌不同濃度（0.1 mg/mL及1.0 mg/mL）發酵粗提物NX83作用48 h后，直腸癌細胞SW1463細胞凋亡率明顯增高（圖 6），進一步證明黏細菌發酵粗提物可以抑制結直腸癌細胞的增殖。流式細胞術結果顯示，濃度0.1 mg/mL組細胞凋亡率為（20.98±1.29）%，1.0 mg/mL組細胞凋亡率為（32.84±1.93）%，均明顯高于陰性對照組的細胞凋亡率〔（7.95±1.53）%〕，差異有統計學意義（P < 0.01）。
圖6
NX83作用SW1463細胞48 h后細胞凋亡情況。隨著發酵粗提物濃度的增高，早期凋亡及晚期凋亡/壞死細胞逐漸增加。6A：1.0 mg/mL組；6B：0.1 mg/mL組；6C：陰性對照組
3 討論
隨著腫瘤細胞耐藥日趨嚴重，人們對找到一種新的抗腫瘤藥物的渴望也日益迫切[10]，而微生物代謝產物中提取抗腫瘤抗生素是目前研究的熱點。國外已經建立了若干專門從事微生物代謝產物篩選研究的公司以滿足新藥研究的需要，基本上各個公司都擁有特別的篩選代謝產物的模型以及高效的測定程序，并且研制開發了多種型號的適應高通量篩選的工作站，使國外發達國家制藥企業對新藥研發的壟斷地位進一步強化[2, 11-12]。因此，加大、加快中國在這一領域的基礎研究不僅可以更好地利用我國的微生物資源，也能為我國在制藥領域自主研發做好基礎工作。
我省秦巴山區作為我國最大的動植物保護區，是世界公認的物種多樣性最為豐富的地區之一，其蘊含的豐富的微生物資源是我們研究及利用的一大寶藏。但目前其針對性研究尚沒有完全開展，特別是篩選具有抗腫瘤活性的黏細菌。由于黏細菌種類繁多，代謝產物復雜，被認為是“社會性的細菌”[6, 13]，因而建立高效的篩選模型和程序已十分必要。
黏細菌及其次級代謝產物主要有以下幾個特點[8, 14-16]：①產生的化合物種類多；②作用機制獨特多樣，如抑制電子傳遞、破壞細胞骨架、抑制核酸聚合酶、抑制真菌的乙酰輔酶A羧化酶等；③作用范圍廣泛，包括細菌、真菌、動物（包括人類）細胞等；④單一菌株具有復雜的次級代謝產物合成譜，同一菌株可能同時產生2個或多個化學上無關聯的化合物，或者多個有相同基本化學結構的衍生物；⑤次級代謝產物多為聚酮類、非核糖體肽類或二者雜合類化合物[17-19]，如S.cellulosum產生的埃博霉素具有與紫杉醇類似的促微管聚合活性，對多重抗藥和紫杉醇耐受腫瘤細胞有強大毒性，因其具有簡單的化學結構、良好的水溶性、較小的副作用以及來源于微生物發酵，被認為是紫杉醇的更新換代產品及更好的抗癌藥物[20-21]。
鑒于黏細菌代謝產物在抗腫瘤機制上與抗真菌機制具有相似性[22]，本研究在前期研究中通過互動篩選方法，把具有抗真菌活性的黏細胞代謝產物作為抗腫瘤的潛在目標產物，旨在降低篩選成本，縮短篩選周期。通過本實驗對這一篩選流程加以驗證。
此次實驗中的兩種代謝產物NX52和NX83分別來源于珊瑚狀珊瑚球菌和變綠色黏球菌的發酵粗提物中，由陜西省微生物研究所建立的較大規模秦巴山區黏細菌菌株庫及其代謝產物庫提供。前期我們的研究發現，代謝產物NX52和NX83不僅具有較好的抗真菌、抗細菌活性，而且還具有很好的抗腫瘤活性[23-24]。
本實驗中，以多種能體外培養的穩定傳代的人結直腸癌細胞為模型，采用MTT比色法檢測不同濃度的兩種黏細菌代謝產物（NX52和NX83）對不同腫瘤細胞增殖的影響，結果表明，兩種代謝產物NX52及NX83均對人結直腸癌細胞HT-29、SW480和SW1463的細胞增殖有抑制作用（P < 0.05），且存在劑量效應、時間效應的依賴方式，而代謝產物NX83對結直腸癌細胞的增殖抑制作用更為顯著（P < 0.05）；流式細胞術結果顯示，NX83處理組細胞凋亡率顯著高于陰性對照組細胞凋亡率（P < 0.01），隨著發酵粗提物濃度的增高，早期凋亡及晚期凋亡/壞死細胞逐漸增加，進一步說明了NX83可通過誘導細胞凋亡表現出更為顯著的抗癌生物活性。
本次實驗證實通過互動篩選把抗真菌的黏細菌代謝產物作為抗腫瘤的代謝產物，通過腫瘤細胞培養對代謝產物做進一步驗證是一種快捷簡便、行之有效的方法，為今后菌株庫和代謝產物庫的全面篩選打下良好的基礎。本研究在后期將對5-FU誘導產生的耐藥株進行代謝產物協同實驗，以期發現黏細菌代謝產物是否具有逆轉腫瘤耐藥的作用，并對逆轉機制加以研究。本實驗也可進一步分析其次級代謝產物的化學本質，分離出單體物質進行抑菌或抗腫瘤藥物的開發研究，為黏細菌生物資源的有效開發利用進一步奠定基礎。
結直腸癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一[1-2]。目前，結直腸癌晚期或術后治療以化療為主，但所應用的化療藥物及方案的總體療效并不理想，其主要原因是化療過程中結直腸癌細胞的多藥耐藥現象導致化療失敗[3-5]。黏細菌是一類具有多細胞行為的革蘭陰性細菌[6-7]，能夠產生豐富的次級代謝產物，具有種類多、結構新、作用機制新穎多樣的特性，被公認為是繼放線菌之后的又一個重要的藥源微生物新類群[7-9]。秦巴山區作為我國最大的自然資源保護區之一，其微生物資源在全國乃至全世界都是獨一無二的，其中蘊含的黏細菌類型更是多種多樣，因此，從中篩選代謝產物尋找抗腫瘤藥物具有獨特的優勢和巨大的潛力。前期本研究團隊建立了秦巴山區黏細菌代謝產物庫，并篩選獲得一系列抗真菌代謝產物，其中來源于珊瑚狀珊瑚球菌和變綠色黏球菌的代謝產物NX52和NX83具有很好的抗真菌作用。本研究通過檢測人結直腸癌細胞HT-29、SW480和SW1463的細胞增殖抑制和細胞凋亡來探討黏細菌代謝產物體外抗結直腸癌活性，驗證我們篩選模型的合理性，為進一步開發和研究分離抗腫瘤化合物奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 試劑與材料
人結腸癌細胞HT-29來自中國科學院細胞庫，結腸癌細胞株SW480和直腸癌細胞株SW1463來自美國菌種保存中心；兩種黏細菌代謝產物NX52和NX83分別來源于珊瑚狀珊瑚球菌和變綠色黏球菌的發酵粗提物，由陜西省微生物研究所建立的秦巴山區黏細菌菌株庫及其代謝產物庫提供；噻唑藍溴化四唑（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國Merck公司；酶聯免疫檢測儀購自美國Bi-TEK公司，流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 人結直腸癌細胞培養
將腫瘤細胞接種于RPMI 1640培養液中（含10%胎牛血清），置于37℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中，1～2 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。
1.2.2 細胞形態學觀察
當96孔板中細胞貼壁生長80%時，吸出培養液，加入含上述不同濃度（0.1 mg/mL、1.0 mg/mL和10.0 mg/mL）代謝產物粗提物的培養液，置于37℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中分別培養24 h、48 h和72 h后，PBS沖洗兩遍，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化及增殖情況。
1.2.3 MTT法檢測細胞增殖抑制
以1×105/mL的濃度分別接種HT-29、SW480、SW1463細胞于96孔板，每孔加入100μL，待細胞貼壁80%后小心吸出培養液，加入終濃度為0.1 mg/mL、1.0 mg/mL和10.0 mg/mL的黏細菌代謝產物粗提物（NX52或NX83），陰性對照組細胞不加黏細菌代謝產物NX52或NX83，空白對照組無細胞，只加培養液。分別培養24 h、48 h和72 h后加入MTT檢測吸光度（A）值，每組設4個復孔，重復實驗3次。計算細胞增殖抑制率，計算公式為：增殖抑制率（%）=（1-處理組A值/陰性對照組A值）×100%。
1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡
將直腸癌細胞SW1463接種于6孔培養板，依據MTT實驗結果：高濃度代謝產物對于篩選腫瘤細胞的增殖抑制率效果甚微，因而選取具有實驗意義的濃度分別為0.1 mg/mL和1.0 mg/mL的黏細菌代謝產物NX83進行實驗，同時設立不加代謝產物的陰性對照組細胞。待細胞貼壁80%后分別加入不同濃度（0.1 mg/mL和1.0 mg/mL）的黏細菌代謝產物粗提物NX83，繼續培養48 h后轉移培養液并加入胰酶，顯微鏡下觀察細胞開始收縮時輕輕吹打細胞，培養液重懸細胞密度約1×106/mL，取0.5 mL細胞懸液加入10μL培養基結合試劑，加入1.25μL Annexin V-FITC，室溫避光反應15 min，室溫1 000×g離心5 min，去除培養基，將細胞用0.5 mL 1×結合緩沖液輕輕重懸，加入10μL碘化丙啶，冰上避光保存，立即用流式細胞儀檢測分析，計算細胞凋亡率。
1.3 統計學方法
實驗所有數據應用SPSS 19.0軟件處理，所有數據用均數±標準差（
2 結果
2.1 倒置顯微鏡下結直腸癌細胞的形態學變化
在倒置顯微鏡下觀察結直腸癌細胞形態學變化結果見圖 1～3。加藥處理后48 h時，陰性對照組細胞呈梭行、多邊形或類圓形，貼壁生長良好；發酵粗提物處理過的結直腸癌可見細胞變圓，細胞間隙增大，細胞膜皺縮、不連續，邊界模糊不清，細胞漿內出現空泡，部分細胞腫脹破裂、脫落，漂浮于培養液中。從圖中可見，黏細菌發酵粗提物對細胞株HT-29、SW1463和SW480均有抑制作用，隨著濃度的增高和作用時間的延長，貼壁細胞數量顯著減少。
圖1
各濃度代謝產物粗提物作用HT-29結腸癌細胞48 h后細胞形態變化結果（??×100）。1A：NX52陰性對照；1B：NX52 0.1 mg/mL；1C：NX52 1.0 mg/m；1D：NX52 10.0 mg/mL；1E：NX83陰性對照；1F：NX83 0.1 mg/mL；1G：NX83 1.0 mg/mL；1H：NX83 10.0 mg/mL??圖 2??各濃度代謝產物粗提物作用SW1463細胞48 h后細胞形態變化結果（??×100）。2A：NX52陰性對照；2B：NX52 0.1 mg/mL；2C：NX52 1.0 mg/mL；2D：NX52 10.0 mg/mL；2E：NX83陰性對照；2F：NX83 0.1 mg/mL；2G：NX83 1.0 mg/mL；2H：NX83 10.0 mg/mL??圖 3??各濃度代謝產物粗提物作用SW480細胞48 h后細胞形態變化結果（??×100）。3A：NX52陰性對照；3B：NX52 0.1 mg/mL；3C：NX52 1.0 mg/mL；3D：NX52 10.0 mg/mL；3E：NX83陰性對照；3F：NX83 0.1 mg/mL；3G：NX83 1.0 mg/mL；3H：NX83 10.0 mg/mL
2.2 MTT法檢測不同黏細菌代謝產物粗提物對人結直腸癌細胞增殖抑制結果
2.2.1 HT-29細胞
結果見表 1。從表 1可見：①相同濃度的同一黏細菌代謝產物（NX52或NX83），隨著作用時間的延長，對HT-29細胞的增殖抑制率逐漸升高（P < 0.05）；②同一黏細菌代謝產物（NX52或NX83）在相同時間，隨藥物濃度增加，HT-29細胞的增殖抑制率逐漸升高（P < 0.05）；③黏細菌代謝產物NX83在相同濃度作用相同時間時，對HT-29細胞的增殖抑制率均分別明顯高于NX52（P < 0.05）。
表1
兩種代謝產物對HT-29細胞的增殖抑制率影響（n=3，%，2.2.2 SW1463和SW480細胞
結果見表 2。從表 2可見：①相同濃度的同一黏細菌代謝產物（NX52或NX83），隨著作用時間的延長，對SW1463和SW480細胞的增殖抑制率呈上升趨勢；②同一黏細菌代謝產物（NX52或NX83）在相同時間，隨藥物濃度增加，對SW1463或SW480細胞的增殖抑制率顯著增高（P < 0.05）；③黏細菌代謝產物NX83在相同濃度作用相同時間時，對SW1463或SW480細胞的增殖抑制率均分別明顯高于NX52（P < 0.05）；④兩種黏細菌代謝產物NX83和NX52在相同濃度作用相同時間時對SW1463細胞的增殖抑制率均分別明顯高于對SW480細胞的增殖抑制率（P < 0.05）。
表2
兩種代謝產物粗提物對SW1463細胞及SW480細胞的增殖抑制率影響（n=3，%，2.3 流式細胞術檢測不同濃度代謝產物NX83作用于直腸癌SW1463細胞48 h后對細胞凋亡率的影響
與陰性對照組相比，黏細菌不同濃度（0.1 mg/mL及1.0 mg/mL）發酵粗提物NX83作用48 h后，直腸癌細胞SW1463細胞凋亡率明顯增高（圖 6），進一步證明黏細菌發酵粗提物可以抑制結直腸癌細胞的增殖。流式細胞術結果顯示，濃度0.1 mg/mL組細胞凋亡率為（20.98±1.29）%，1.0 mg/mL組細胞凋亡率為（32.84±1.93）%，均明顯高于陰性對照組的細胞凋亡率〔（7.95±1.53）%〕，差異有統計學意義（P < 0.01）。
圖6
NX83作用SW1463細胞48 h后細胞凋亡情況。隨著發酵粗提物濃度的增高，早期凋亡及晚期凋亡/壞死細胞逐漸增加。6A：1.0 mg/mL組；6B：0.1 mg/mL組；6C：陰性對照組
3 討論
隨著腫瘤細胞耐藥日趨嚴重，人們對找到一種新的抗腫瘤藥物的渴望也日益迫切[10]，而微生物代謝產物中提取抗腫瘤抗生素是目前研究的熱點。國外已經建立了若干專門從事微生物代謝產物篩選研究的公司以滿足新藥研究的需要，基本上各個公司都擁有特別的篩選代謝產物的模型以及高效的測定程序，并且研制開發了多種型號的適應高通量篩選的工作站，使國外發達國家制藥企業對新藥研發的壟斷地位進一步強化[2, 11-12]。因此，加大、加快中國在這一領域的基礎研究不僅可以更好地利用我國的微生物資源，也能為我國在制藥領域自主研發做好基礎工作。
我省秦巴山區作為我國最大的動植物保護區，是世界公認的物種多樣性最為豐富的地區之一，其蘊含的豐富的微生物資源是我們研究及利用的一大寶藏。但目前其針對性研究尚沒有完全開展，特別是篩選具有抗腫瘤活性的黏細菌。由于黏細菌種類繁多，代謝產物復雜，被認為是“社會性的細菌”[6, 13]，因而建立高效的篩選模型和程序已十分必要。
黏細菌及其次級代謝產物主要有以下幾個特點[8, 14-16]：①產生的化合物種類多；②作用機制獨特多樣，如抑制電子傳遞、破壞細胞骨架、抑制核酸聚合酶、抑制真菌的乙酰輔酶A羧化酶等；③作用范圍廣泛，包括細菌、真菌、動物（包括人類）細胞等；④單一菌株具有復雜的次級代謝產物合成譜，同一菌株可能同時產生2個或多個化學上無關聯的化合物，或者多個有相同基本化學結構的衍生物；⑤次級代謝產物多為聚酮類、非核糖體肽類或二者雜合類化合物[17-19]，如S.cellulosum產生的埃博霉素具有與紫杉醇類似的促微管聚合活性，對多重抗藥和紫杉醇耐受腫瘤細胞有強大毒性，因其具有簡單的化學結構、良好的水溶性、較小的副作用以及來源于微生物發酵，被認為是紫杉醇的更新換代產品及更好的抗癌藥物[20-21]。
鑒于黏細菌代謝產物在抗腫瘤機制上與抗真菌機制具有相似性[22]，本研究在前期研究中通過互動篩選方法，把具有抗真菌活性的黏細胞代謝產物作為抗腫瘤的潛在目標產物，旨在降低篩選成本，縮短篩選周期。通過本實驗對這一篩選流程加以驗證。
此次實驗中的兩種代謝產物NX52和NX83分別來源于珊瑚狀珊瑚球菌和變綠色黏球菌的發酵粗提物中，由陜西省微生物研究所建立的較大規模秦巴山區黏細菌菌株庫及其代謝產物庫提供。前期我們的研究發現，代謝產物NX52和NX83不僅具有較好的抗真菌、抗細菌活性，而且還具有很好的抗腫瘤活性[23-24]。
本實驗中，以多種能體外培養的穩定傳代的人結直腸癌細胞為模型，采用MTT比色法檢測不同濃度的兩種黏細菌代謝產物（NX52和NX83）對不同腫瘤細胞增殖的影響，結果表明，兩種代謝產物NX52及NX83均對人結直腸癌細胞HT-29、SW480和SW1463的細胞增殖有抑制作用（P < 0.05），且存在劑量效應、時間效應的依賴方式，而代謝產物NX83對結直腸癌細胞的增殖抑制作用更為顯著（P < 0.05）；流式細胞術結果顯示，NX83處理組細胞凋亡率顯著高于陰性對照組細胞凋亡率（P < 0.01），隨著發酵粗提物濃度的增高，早期凋亡及晚期凋亡/壞死細胞逐漸增加，進一步說明了NX83可通過誘導細胞凋亡表現出更為顯著的抗癌生物活性。
本次實驗證實通過互動篩選把抗真菌的黏細菌代謝產物作為抗腫瘤的代謝產物，通過腫瘤細胞培養對代謝產物做進一步驗證是一種快捷簡便、行之有效的方法，為今后菌株庫和代謝產物庫的全面篩選打下良好的基礎。本研究在后期將對5-FU誘導產生的耐藥株進行代謝產物協同實驗，以期發現黏細菌代謝產物是否具有逆轉腫瘤耐藥的作用，并對逆轉機制加以研究。本實驗也可進一步分析其次級代謝產物的化學本質，分離出單體物質進行抑菌或抗腫瘤藥物的開發研究，為黏細菌生物資源的有效開發利用進一步奠定基礎。
