引用本文： 李淵, 馬家馳, 李一平, 房偉, 郭慶金. PTEN siRNA對結腸癌細胞增殖和侵襲的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(5): 544-548. doi: 10.7507/1007-9424.20150145 復制
結直腸癌作為最常見的惡性腫瘤之一，在全世界男性的發病率排名第3位，病死率第4位；女性的發病率排名第2位，病死率第3位[1]。近年來，包括中國在內的許多國家或地區結腸癌發病率呈上升的趨勢[2-3]。結腸癌術后大約40%的患者在5年內出現復發和轉移[4]。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN），又稱為MMAC1/TEP1基因，位于人類染色體10q23，具有9個外顯子。PTEN是近年來發現的重要抑癌基因，它的失活、缺失與人類十幾種癌的發生和轉移相關[5]。前期我們的研究[6-7]顯示，PTEN的表達與結腸癌的肝轉移能力密切相關，并通過IGF1-PI3K-Akt信號途徑調節結腸癌的轉移。但目前對PTEN基因的沉默影響結直腸癌細胞生物學功能的研究比較少。本研究應用短基因干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術沉默PTEN基因后觀察結腸癌細胞生物學特性的變化，從而在功能上了解PTEN基因在腫瘤發生和進展中的分子生物學作用，為結直腸癌的防治和基因治療提供新的策略和理論依據。
1 材料與方法
1.1 細胞及主要材料
結腸癌細胞株（HT-29、WiDr、CaCo-2及Colo320）均購自金斯瑞生物科技公司。PTEN siRNA，上海吉瑪生物工程公司；Lipofectamine2000TM，Invitrogen公司；PTEN siRNA序列：上游5'-AACCCACCACAGC-UAGAACTT-3'，下游5'-AAGUUCUAGCUGUGGUG-GGTT3'。Control siRNA序列：上游5'-UUCUCCG-AACGUGUCACGUTT-3'，下游5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
HT-29和Colo320用RPMI 1640培養液進行培養；WiDr、CaCo-2用DMEM進行培養，培養液中含10%熱滅活胎牛血清(FBS)，存放于37℃、含5% CO2空氣的培養箱中培養。
1.2.2 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測PTEN mRNA在結腸癌細胞株中的表達
依據Gene Bank報道的基因序列，運用Prime 5.0軟件設計一對引物，由大連寶生物公司合成。采用大連寶生物公司研制的RNA OUT試劑盒提取細胞中的總RNA，用1%甲醛瓊脂糖凝膠進行電泳檢測RNA的完整性；然后用DNA/RNA Calculator測定總RNA濃度。RT-PCR反應體系依據制造商提供的說明，PTEN引物序列和RT-PCR反應條件見表 1。取PCR擴增產物2.0μL與緩沖液混勻后電泳上樣，以DL2000作為maker在1%的瓊脂糖凝膠（含核酸染料0.5μg/mL）中電泳30 min，用凝膠成像系統觀察并保存。擴增條件為：42℃條件下30 min進行逆轉錄；94℃變性3 min，1個循環：94℃變性30 s，62℃退火45 s，68℃延伸1 min，共35個循環，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳和染色用溴化乙錠，蒸餾水為陰性對照，β-肌動蛋白（β-actin）作為陽性對照。
表1
引物序列及PCR條件
1.2.3 Western blot檢測PTEN蛋白的表達
Cell-Lysis buffer裂解細胞。加入20 mg/L蛋白酶抑制劑，離心1 h（4℃，13 000 r/min，r=7.7 cm），收集上清液，Brad-ford法測定蛋白濃度，取30μg樣品蛋白質與適量IPG膠條溶液混合均勻。10% SDS-PAGE膠電泳2 h，至嗅酚藍接近凝膠底線。采用半干轉印技術（參照設備說明書操作）將雙向電泳后的制備膠上的蛋白質轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBS-T沖洗膜3次（10 min/次）。對將轉有蛋白的PVDF膜取出，標記方向和蛋白分子量標準印記，然后浸入含有一抗的封閉液中，置于搖擺機室溫下孵育2 h，用TBST緩沖液洗膜3次，每次15 min，將PVDF膜浸入含有辣根過氧化酶標記的二抗的孵育液中4℃過夜，再以TBST洗膜3次，每次10 min。干燥1～2 min。用ECL化學發光試劑盒將PVDF膜進行膠片曝光顯影定影，流水沖洗后干燥并照相保存。
1.2.4 細胞轉染
將1×105/mL結腸癌細胞接種到12孔的培養板，37℃、5% CO2條件下培養24 h，待細胞貼壁生長至80%密度時進行轉染。按每孔取50μmol/L的siRNA液2μL，溶于100μL無血清、無抗生素、無核酶的RPMI 1640和DMEM培養液中混勻，按每孔Lipofectamine2000TM液5μL，溶于100μL無血清、無抗生素、無核酶的RPMI 1640和DMEM培養液中混勻，室溫靜置5 min，混合后再室溫靜置20 min。棄去12孔板中的培養液，用無血清RPMI 1640或DMEM培養液洗滌細胞2次，每孔換新鮮的上述培養液2 mL，再將上述的混合液加入每孔細胞中，混勻后置培養箱中，37℃培養。轉染后6 h，更換為含10% FBS的無抗生素、無核酶的RPMI 1640或DMEM培養液，轉染后的細胞用于后續實驗。
1.2.5 細胞增殖實驗
WST-1細胞增殖實驗檢測PTEN siRNA對結腸癌細胞增殖的影響。取對數生長期的PTEN siRNA、Control siRNA及未轉染的結腸癌細胞株HT-29、WiDr、CaCo-2、Colo320細胞置于每孔5×103個/100μL加入96孔的培養板上過夜，使細胞貼壁。更換培養液再培養48 h或72 h后，每孔加入100μL的CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent后置于37℃的孵育箱中4 h后，酶標儀上測定波長490 nm吸光度值。
1.2.6 細胞侵襲實驗
將Martigel膠按40μL/孔均勻地鋪在孔徑8μm的transwell小室無聚碳酸脂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）多孔濾膜內表面上，在外表面均勻地涂抹10μL/5μg纖維連接蛋白，使之干燥形成一個基底屏障層；成膠30 min后置紫外燈下照射過夜，實驗前30 min再次成膠；培養細胞達80%飽和度時，消化、計數，取2.0×104/mL癌細胞接種到成膠帶膜的小室內，并將小室置于24孔transwell板內，再培養8 h后取出，用棉簽頭擦掉未濾過的細胞，PBS洗3次，甲醇固定5 min，Diff-Quick液染色。結果判定：在光鏡下（×20）每個濾膜分別計數5個視野的穿膜細胞數，計算平均每個視野的細胞數。
1.3 統計學方法
使用SAS 7.0軟件進行統計學分析，結果以均數±標準差（
2 結果
2.1 PTEN mRNA在結腸癌細胞株中的表達
RT-PCR結果顯示，PTEN mRNA在4種結腸癌細胞株中均有表達，見圖 1。
圖1
PTEN mRNA在結腸癌細胞株中的表達
2.2 Western blot法測定PTEN蛋白在結腸癌細胞株中的表達
與RT-PCR實驗結果相同，Western blot結果顯示，PTEN蛋白在Colo320、CaCo-2、HT-29及WiDr這4種結腸癌細胞株中均有表達，見圖 2。
圖2
PTEN蛋白在結腸癌細胞株中的表達
2.3 PTEN siRNA對結腸癌細胞PTEN蛋白表達的影響
結腸癌細胞導入PTEN siRNA后，即PTEN基因沉默后，相對于Control siRNA和β-actin，4種結腸癌細胞中PTEN蛋白的表達明顯被抑制，該結果提示PTEN siRNA設計及轉染細胞都是成功的，見圖 3A。Image對圖像進行半定量分析結果顯示，與未轉染組、Control siRNA組相比，PTEN siRNA組4種結腸癌細胞中PTEN的蛋白表達明顯被抑制（P < 0.01），見圖 3B。
圖3
PTEN siRNA對結腸癌細胞表達PTEN的影響。3A：定性結果。3B：半定量結果。與未轉染組和Control siRNA組比較，* P < 0.01
2.4 PTEN siRNA對結腸癌細胞增殖的影響
導入PTEN siRNA和Control siRNA后結腸癌細胞再經72 h的培養，結果顯示，PTEN基因沉默后，與未轉染組和Control siRNA組比較，PTEN siRNA組癌細胞自身的增殖能力明顯增強（P < 0.01），見圖 4。
圖4
PTEN siRNA對結腸癌細胞增殖能力的影響。與未轉染組和Control siRNA組比較，* P < 0.01
2.5 PTEN siRNA對結腸癌細胞侵襲能力的影響
結腸癌細胞轉染PTEN siRNA和control siRNA后，為了排除細胞增生對侵襲實驗的影響，細胞培養時間8 h，結果顯示，PTEN基因沉默后，分別與未轉染組和Control siRNA組相比較，PTEN siRNA組結腸癌細胞的侵襲能力明顯增強（P < 0.01），見圖 5。
圖5
PTEN siRNA對結腸癌細胞侵襲能力的影響。與未轉染組和Control siRNA組比較，* P < 0.01
3 討論
復發和轉移是結腸癌預后不良的主要原因，結腸癌的轉移是一個多因素、多步驟、多階段性的選擇過程，包含著循環腫瘤細胞與靶器官間復雜的相互作用，特異的器官微環境決定著腫瘤細胞自身增殖、侵襲及血管形成，這種“被選擇”腫瘤細胞的特征性、靶器官微環境的特異性以及循環腫瘤細胞向靶器官遷移方式的規律性成為揭示腫瘤轉移特征的關鍵[8]。在結腸癌的進展和轉移中抑癌基因的失活是一個關鍵因素[9]。
PTEN基因是近年來在人體中發現的主要腫瘤抑制基因，也是人體腫瘤中最常發生突變的基因之一，發生種系突變可導致產生腫瘤易感綜合征[10-11]。PTEN基因胚系突變發現于Cowden和Bannayan-Riley-Ruvalcaba綜合征、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和前列腺癌組織中。近年來，越來越多的證據表明，PTEN作為抑癌基因，主要通過調控細胞的信號傳導途徑與其他抑癌基因協同發揮抑癌作用。細胞的信號傳導是溝通細胞內外以及細胞之間聯系的橋梁，控制著細胞內幾乎所有的生命活動。信號傳導過程的異常將會導致機體的調節紊亂，影響細胞生長、分化和代謝而造成機體疾病。PTEN的抑癌作用主要通過PTEN/PI3K/Akt、PTEN/FAK/P130cas、PTEN/ERK、p53/MDM2、FRAP/mTOR等信號傳導途徑調控[12-18]。PTEN蛋白的表達與血管內皮生長因子（VEGF）的表達呈負相關，VEGF通過促進腫瘤血管的生成而滿足腫瘤的營養需要，而PTEN可通過下調VEGF的表達發揮抑制腫瘤的作用。此外，基底膜的完整性是腫瘤的浸潤與轉移的關鍵環節[13, 19]。MMP-9通過破壞基底膜的完整性而促進腫瘤的轉移，而PTEN可通過NF-?B和AP-1基因下調MMP-9的表達，從而最終對腫瘤起到抑制作用[20-21]。PTEN通過調控這些信號傳導途徑在協調細胞周期進展、抑制癌細胞增殖和轉移、控制細胞黏附、細胞凋亡等方面發揮著重要作用[12]。在癌癥的發生、發展中，PTEN的表達與抑癌基因p16、nm23、p73野生型p53基因、p27b等基因的表達有協同作用，共同抑制腫瘤的發生與發展過程；而與survivin、突變型p53、ERK2等基因表達呈負相關關系[22-24]。本研究結果顯示，PTEN mRNA及蛋白在4種結腸癌細胞中都有表達，這是后續研究沉默PTEN基因的基礎。
RNA干擾技術的靶基因沉默方法已被廣泛運用于基礎研究和臨床研究中，無論是分裂期的細胞還是間歇期的細胞，都能被RNA干擾抑制，且毒副作用較小，因此RNA干擾成為了基礎科研以及基因治療的重要工具之一[25]。本研究運用RNA干擾技術在體外沉默PTEN后檢測了結腸癌細胞生物學功能的改變，Western blot結果提示，結腸癌細胞轉染PTEN siRNA后抑制了PTEN蛋白表達，表明沉默靶基因的效果顯著，這一結果為檢測結腸癌細胞自身生物學活性的改變提供了基礎；侵襲實驗檢測顯示，轉染PTEN siRNA組的結腸癌細胞增殖及侵襲能力與Control siRNA組及未轉染組比較明顯增強（P < 0.01），這表明PTEN在體外有效抑制結腸癌細胞的增殖和生長，并顯著降低其侵襲能力，PTEN的缺失使結腸癌細胞的轉移能力增強。PTEN在哺乳動物組織動態平衡的正調節與負調節中起核心作用，PTEN基因表達上調后，可促進癌細胞凋亡[26-27]，這與我們的研究也是相一致的。聯合應用野生型PTEN基因轉染和5-氟尿嘧啶對癌細胞可獲得協同的細胞毒性作用[28]。PTEN基因與西妥昔單抗抗腫瘤活性中具有潛在的協同作用[29]。另一方面，特異性地強化PTEN的活性可能成為治療結腸癌的有效途徑。
目前發現多種機制可以調節PTEN的功能，但是其詳細的上游調節分子和調節機制還不是非常清楚。未來對PTEN基因調控機制的深入研究，必將會為腫瘤和代謝性疾病的分子診斷、基因治療以及預后判斷方面提供新方法、新途徑。本研究應用siRNA技術，轉染PTEN siRNA到結腸癌細胞核中，構建的特異性siRNA質粒沉默PTEN后結腸癌細胞的增殖和侵襲能力明顯增強，結合我們的前期研究[6-7]，PTEN主要通過抑制癌細胞的增殖、侵襲和新生血管抑制結腸癌的轉移，由此預測PTEN抑癌基因在結腸癌中的失活可能是不全性的失活，PTEN功能的復活是今后腫瘤學研究的難點和熱點，強化PTEN的作用或應用野生型的PTEN基因可作為治療結腸癌轉移的一個基因靶點。
結直腸癌作為最常見的惡性腫瘤之一，在全世界男性的發病率排名第3位，病死率第4位；女性的發病率排名第2位，病死率第3位[1]。近年來，包括中國在內的許多國家或地區結腸癌發病率呈上升的趨勢[2-3]。結腸癌術后大約40%的患者在5年內出現復發和轉移[4]。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN），又稱為MMAC1/TEP1基因，位于人類染色體10q23，具有9個外顯子。PTEN是近年來發現的重要抑癌基因，它的失活、缺失與人類十幾種癌的發生和轉移相關[5]。前期我們的研究[6-7]顯示，PTEN的表達與結腸癌的肝轉移能力密切相關，并通過IGF1-PI3K-Akt信號途徑調節結腸癌的轉移。但目前對PTEN基因的沉默影響結直腸癌細胞生物學功能的研究比較少。本研究應用短基因干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術沉默PTEN基因后觀察結腸癌細胞生物學特性的變化，從而在功能上了解PTEN基因在腫瘤發生和進展中的分子生物學作用，為結直腸癌的防治和基因治療提供新的策略和理論依據。
1 材料與方法
1.1 細胞及主要材料
結腸癌細胞株（HT-29、WiDr、CaCo-2及Colo320）均購自金斯瑞生物科技公司。PTEN siRNA，上海吉瑪生物工程公司；Lipofectamine2000TM，Invitrogen公司；PTEN siRNA序列：上游5'-AACCCACCACAGC-UAGAACTT-3'，下游5'-AAGUUCUAGCUGUGGUG-GGTT3'。Control siRNA序列：上游5'-UUCUCCG-AACGUGUCACGUTT-3'，下游5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
HT-29和Colo320用RPMI 1640培養液進行培養；WiDr、CaCo-2用DMEM進行培養，培養液中含10%熱滅活胎牛血清(FBS)，存放于37℃、含5% CO2空氣的培養箱中培養。
1.2.2 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測PTEN mRNA在結腸癌細胞株中的表達
依據Gene Bank報道的基因序列，運用Prime 5.0軟件設計一對引物，由大連寶生物公司合成。采用大連寶生物公司研制的RNA OUT試劑盒提取細胞中的總RNA，用1%甲醛瓊脂糖凝膠進行電泳檢測RNA的完整性；然后用DNA/RNA Calculator測定總RNA濃度。RT-PCR反應體系依據制造商提供的說明，PTEN引物序列和RT-PCR反應條件見表 1。取PCR擴增產物2.0μL與緩沖液混勻后電泳上樣，以DL2000作為maker在1%的瓊脂糖凝膠（含核酸染料0.5μg/mL）中電泳30 min，用凝膠成像系統觀察并保存。擴增條件為：42℃條件下30 min進行逆轉錄；94℃變性3 min，1個循環：94℃變性30 s，62℃退火45 s，68℃延伸1 min，共35個循環，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳和染色用溴化乙錠，蒸餾水為陰性對照，β-肌動蛋白（β-actin）作為陽性對照。
表1
引物序列及PCR條件
1.2.3 Western blot檢測PTEN蛋白的表達
Cell-Lysis buffer裂解細胞。加入20 mg/L蛋白酶抑制劑，離心1 h（4℃，13 000 r/min，r=7.7 cm），收集上清液，Brad-ford法測定蛋白濃度，取30μg樣品蛋白質與適量IPG膠條溶液混合均勻。10% SDS-PAGE膠電泳2 h，至嗅酚藍接近凝膠底線。采用半干轉印技術（參照設備說明書操作）將雙向電泳后的制備膠上的蛋白質轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBS-T沖洗膜3次（10 min/次）。對將轉有蛋白的PVDF膜取出，標記方向和蛋白分子量標準印記，然后浸入含有一抗的封閉液中，置于搖擺機室溫下孵育2 h，用TBST緩沖液洗膜3次，每次15 min，將PVDF膜浸入含有辣根過氧化酶標記的二抗的孵育液中4℃過夜，再以TBST洗膜3次，每次10 min。干燥1～2 min。用ECL化學發光試劑盒將PVDF膜進行膠片曝光顯影定影，流水沖洗后干燥并照相保存。
1.2.4 細胞轉染
將1×105/mL結腸癌細胞接種到12孔的培養板，37℃、5% CO2條件下培養24 h，待細胞貼壁生長至80%密度時進行轉染。按每孔取50μmol/L的siRNA液2μL，溶于100μL無血清、無抗生素、無核酶的RPMI 1640和DMEM培養液中混勻，按每孔Lipofectamine2000TM液5μL，溶于100μL無血清、無抗生素、無核酶的RPMI 1640和DMEM培養液中混勻，室溫靜置5 min，混合后再室溫靜置20 min。棄去12孔板中的培養液，用無血清RPMI 1640或DMEM培養液洗滌細胞2次，每孔換新鮮的上述培養液2 mL，再將上述的混合液加入每孔細胞中，混勻后置培養箱中，37℃培養。轉染后6 h，更換為含10% FBS的無抗生素、無核酶的RPMI 1640或DMEM培養液，轉染后的細胞用于后續實驗。
1.2.5 細胞增殖實驗
WST-1細胞增殖實驗檢測PTEN siRNA對結腸癌細胞增殖的影響。取對數生長期的PTEN siRNA、Control siRNA及未轉染的結腸癌細胞株HT-29、WiDr、CaCo-2、Colo320細胞置于每孔5×103個/100μL加入96孔的培養板上過夜，使細胞貼壁。更換培養液再培養48 h或72 h后，每孔加入100μL的CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent后置于37℃的孵育箱中4 h后，酶標儀上測定波長490 nm吸光度值。
1.2.6 細胞侵襲實驗
將Martigel膠按40μL/孔均勻地鋪在孔徑8μm的transwell小室無聚碳酸脂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）多孔濾膜內表面上，在外表面均勻地涂抹10μL/5μg纖維連接蛋白，使之干燥形成一個基底屏障層；成膠30 min后置紫外燈下照射過夜，實驗前30 min再次成膠；培養細胞達80%飽和度時，消化、計數，取2.0×104/mL癌細胞接種到成膠帶膜的小室內，并將小室置于24孔transwell板內，再培養8 h后取出，用棉簽頭擦掉未濾過的細胞，PBS洗3次，甲醇固定5 min，Diff-Quick液染色。結果判定：在光鏡下（×20）每個濾膜分別計數5個視野的穿膜細胞數，計算平均每個視野的細胞數。
1.3 統計學方法
使用SAS 7.0軟件進行統計學分析，結果以均數±標準差（
2 結果
2.1 PTEN mRNA在結腸癌細胞株中的表達
RT-PCR結果顯示，PTEN mRNA在4種結腸癌細胞株中均有表達，見圖 1。
圖1
PTEN mRNA在結腸癌細胞株中的表達
2.2 Western blot法測定PTEN蛋白在結腸癌細胞株中的表達
與RT-PCR實驗結果相同，Western blot結果顯示，PTEN蛋白在Colo320、CaCo-2、HT-29及WiDr這4種結腸癌細胞株中均有表達，見圖 2。
圖2
PTEN蛋白在結腸癌細胞株中的表達
2.3 PTEN siRNA對結腸癌細胞PTEN蛋白表達的影響
結腸癌細胞導入PTEN siRNA后，即PTEN基因沉默后，相對于Control siRNA和β-actin，4種結腸癌細胞中PTEN蛋白的表達明顯被抑制，該結果提示PTEN siRNA設計及轉染細胞都是成功的，見圖 3A。Image對圖像進行半定量分析結果顯示，與未轉染組、Control siRNA組相比，PTEN siRNA組4種結腸癌細胞中PTEN的蛋白表達明顯被抑制（P < 0.01），見圖 3B。
圖3
PTEN siRNA對結腸癌細胞表達PTEN的影響。3A：定性結果。3B：半定量結果。與未轉染組和Control siRNA組比較，* P < 0.01
2.4 PTEN siRNA對結腸癌細胞增殖的影響
導入PTEN siRNA和Control siRNA后結腸癌細胞再經72 h的培養，結果顯示，PTEN基因沉默后，與未轉染組和Control siRNA組比較，PTEN siRNA組癌細胞自身的增殖能力明顯增強（P < 0.01），見圖 4。
圖4
PTEN siRNA對結腸癌細胞增殖能力的影響。與未轉染組和Control siRNA組比較，* P < 0.01
2.5 PTEN siRNA對結腸癌細胞侵襲能力的影響
結腸癌細胞轉染PTEN siRNA和control siRNA后，為了排除細胞增生對侵襲實驗的影響，細胞培養時間8 h，結果顯示，PTEN基因沉默后，分別與未轉染組和Control siRNA組相比較，PTEN siRNA組結腸癌細胞的侵襲能力明顯增強（P < 0.01），見圖 5。
圖5
PTEN siRNA對結腸癌細胞侵襲能力的影響。與未轉染組和Control siRNA組比較，* P < 0.01
3 討論
復發和轉移是結腸癌預后不良的主要原因，結腸癌的轉移是一個多因素、多步驟、多階段性的選擇過程，包含著循環腫瘤細胞與靶器官間復雜的相互作用，特異的器官微環境決定著腫瘤細胞自身增殖、侵襲及血管形成，這種“被選擇”腫瘤細胞的特征性、靶器官微環境的特異性以及循環腫瘤細胞向靶器官遷移方式的規律性成為揭示腫瘤轉移特征的關鍵[8]。在結腸癌的進展和轉移中抑癌基因的失活是一個關鍵因素[9]。
PTEN基因是近年來在人體中發現的主要腫瘤抑制基因，也是人體腫瘤中最常發生突變的基因之一，發生種系突變可導致產生腫瘤易感綜合征[10-11]。PTEN基因胚系突變發現于Cowden和Bannayan-Riley-Ruvalcaba綜合征、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和前列腺癌組織中。近年來，越來越多的證據表明，PTEN作為抑癌基因，主要通過調控細胞的信號傳導途徑與其他抑癌基因協同發揮抑癌作用。細胞的信號傳導是溝通細胞內外以及細胞之間聯系的橋梁，控制著細胞內幾乎所有的生命活動。信號傳導過程的異常將會導致機體的調節紊亂，影響細胞生長、分化和代謝而造成機體疾病。PTEN的抑癌作用主要通過PTEN/PI3K/Akt、PTEN/FAK/P130cas、PTEN/ERK、p53/MDM2、FRAP/mTOR等信號傳導途徑調控[12-18]。PTEN蛋白的表達與血管內皮生長因子（VEGF）的表達呈負相關，VEGF通過促進腫瘤血管的生成而滿足腫瘤的營養需要，而PTEN可通過下調VEGF的表達發揮抑制腫瘤的作用。此外，基底膜的完整性是腫瘤的浸潤與轉移的關鍵環節[13, 19]。MMP-9通過破壞基底膜的完整性而促進腫瘤的轉移，而PTEN可通過NF-?B和AP-1基因下調MMP-9的表達，從而最終對腫瘤起到抑制作用[20-21]。PTEN通過調控這些信號傳導途徑在協調細胞周期進展、抑制癌細胞增殖和轉移、控制細胞黏附、細胞凋亡等方面發揮著重要作用[12]。在癌癥的發生、發展中，PTEN的表達與抑癌基因p16、nm23、p73野生型p53基因、p27b等基因的表達有協同作用，共同抑制腫瘤的發生與發展過程；而與survivin、突變型p53、ERK2等基因表達呈負相關關系[22-24]。本研究結果顯示，PTEN mRNA及蛋白在4種結腸癌細胞中都有表達，這是后續研究沉默PTEN基因的基礎。
RNA干擾技術的靶基因沉默方法已被廣泛運用于基礎研究和臨床研究中，無論是分裂期的細胞還是間歇期的細胞，都能被RNA干擾抑制，且毒副作用較小，因此RNA干擾成為了基礎科研以及基因治療的重要工具之一[25]。本研究運用RNA干擾技術在體外沉默PTEN后檢測了結腸癌細胞生物學功能的改變，Western blot結果提示，結腸癌細胞轉染PTEN siRNA后抑制了PTEN蛋白表達，表明沉默靶基因的效果顯著，這一結果為檢測結腸癌細胞自身生物學活性的改變提供了基礎；侵襲實驗檢測顯示，轉染PTEN siRNA組的結腸癌細胞增殖及侵襲能力與Control siRNA組及未轉染組比較明顯增強（P < 0.01），這表明PTEN在體外有效抑制結腸癌細胞的增殖和生長，并顯著降低其侵襲能力，PTEN的缺失使結腸癌細胞的轉移能力增強。PTEN在哺乳動物組織動態平衡的正調節與負調節中起核心作用，PTEN基因表達上調后，可促進癌細胞凋亡[26-27]，這與我們的研究也是相一致的。聯合應用野生型PTEN基因轉染和5-氟尿嘧啶對癌細胞可獲得協同的細胞毒性作用[28]。PTEN基因與西妥昔單抗抗腫瘤活性中具有潛在的協同作用[29]。另一方面，特異性地強化PTEN的活性可能成為治療結腸癌的有效途徑。
目前發現多種機制可以調節PTEN的功能，但是其詳細的上游調節分子和調節機制還不是非常清楚。未來對PTEN基因調控機制的深入研究，必將會為腫瘤和代謝性疾病的分子診斷、基因治療以及預后判斷方面提供新方法、新途徑。本研究應用siRNA技術，轉染PTEN siRNA到結腸癌細胞核中，構建的特異性siRNA質粒沉默PTEN后結腸癌細胞的增殖和侵襲能力明顯增強，結合我們的前期研究[6-7]，PTEN主要通過抑制癌細胞的增殖、侵襲和新生血管抑制結腸癌的轉移，由此預測PTEN抑癌基因在結腸癌中的失活可能是不全性的失活，PTEN功能的復活是今后腫瘤學研究的難點和熱點，強化PTEN的作用或應用野生型的PTEN基因可作為治療結腸癌轉移的一個基因靶點。
