引用本文： 袁慶, 李波, 姜世平, 羅蘭云, 李耿, 趙強, 張利勇. γ-射線對細粒棘球蚴原頭節在小鼠體內生長的抑制作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(2): 139-143. doi: 10.7507/1007-9424.20150039 復制
棘球蚴病即包蟲病，是一種危害嚴重的人獸共患寄生蟲病。細粒棘球蚴原頭節是人類包蟲病發病的一個中心環節，由于目前沒有藥物能有效殺滅原頭節[1-5]，因此它是影響手術治療預后的重要因素[6-8]，尤其在利用腹腔鏡治療肝包蟲病的過程中，由于忌憚術中棘球蚴囊液外溢所造成的原頭節種植，往往對棘球蚴的大小和位置有較多的限制。鑒于此，本研究結合先前γ-射線體外照射殺滅細粒棘球蚴原頭節的實驗結果[9]，利用不同劑量的γ-射線對細粒棘球蚴原頭節進行照射，并將照射后的原頭節種植于小白鼠腹腔，模擬經γ-射線照射后的細粒棘球蚴原頭節隨囊液外溢種植于腹腔的情況，觀察其差異，為腹腔鏡治療肝包蟲病術前γ-射線照射以抑制囊液外溢造成腹腔種植探索一種方法。
1 材料與方法
1.1 主要材料
1.1.1 細粒棘球蚴原頭節
細粒棘球蚴原頭節在四川省人民醫院于肝包蟲病手術中采集，術中采取外囊完整切除術，將標本置于4℃以下冰盒中低溫保存送入實驗室。將采集到的肝包蟲囊腫置于超凈工作臺上用75%的乙醇消毒表面后，用50 mL注射器穿刺抽取囊液，抽取時采取反復吹打的方式，確保依附于內囊壁的原頭節完全被采集。抽凈囊液后剪開囊壁，用生理鹽水沖洗內囊表面，將沖洗液與囊液一同收集備用。用離心機以3 000 r/min離心5 min后得到黃白色囊砂，倒去上清液后用沖洗液（含青霉素1 500 U/mL，含鏈霉素1 000 U/mL的生理鹽水）沖洗3次。向囊砂內滴加20%胰蛋白酶溶液1 mL，靜置20 min以融化其中的組織碎屑，然后再次用沖洗液沖洗、離心、去除上清液[10]。將最終獲得的原頭節備用。
1.1.2 主要試劑
RPMI-1640培養液、胎牛血清、青-鏈霉素溶液、美藍溶液及胰蛋白酶溶液，均為賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司。包蟲抗體檢測試劑盒，廣州健侖生物科技有限公司。GENMED石蠟切片組織茜素紅鈣染色試劑盒，上海杰美基因醫藥科技有限公司。
1.1.3 主要儀器
BX50倒置顯微鏡，日本Olympus公司。ALLEGR-64型臺式離心機，美國Beckman公司。37℃CO2培養箱，賽默飛世爾科技有限公司。SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司。GWXJ80型鈷-60遠距離治療機，中國核動力研究設計院設備制造。電子天平FA2004、1004，大連醫療儀器有限公司。光學顯微鏡照相系統，瀘州醫學院附屬醫院病理教研室。
1.1.4 實驗動物
清潔級，雌性，昆明小白鼠，6周齡，體質量（20±4）g，由瀘州醫學院動物實驗室提供。
1.2 方法
1.2.1 原頭節的孵育
向收集原頭節的試管內滴加10 mL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養液后將其搖勻，取0.2 mL溶液滴在玻片上置于倒置顯微鏡下以計數，反復5次，求其平均數。再向所取的溶液中滴加20%美藍溶液，觀察原頭節的存活情況（活的原頭節不會被染色，死亡的原頭節會被染成藍色），要求原頭節的存活率大于90%。最后經計算，將原頭節以2 000個/mL的密度培養于含20%胎牛血清的RPMI-1640培養液中（2 000個/mL適宜原頭節的生長發育）[11]。此后置于37℃CO2培養箱中進行培養。
1.2.2 γ-射線照射
待原頭節培養至出現外翻現象時（原頭節外翻說明其對周圍環境逐漸適應）開始進行γ-射線照射[12]。實驗時將含原頭節的培養液平均分為5個組，其中1組作為對照組，另外4組作為實驗組，置于鈷-60治療儀下進行照射，借鑒前一階段實驗的結果[9]，將照射劑量控制在低-中劑量范圍內（分別為10 Gy、20 Gy、40 Gy、80 Gy），以免發生原頭節在照射后因為急速死亡而導致的種植無效。
1.2.3 接種及分組
在照射結束后，將原頭節接種給禁食1 d后的小白鼠，接種時將雌性小白鼠75只按隨機數字表法均分為5組，每組15只，采取腹腔穿刺接種的方式。穿刺點統一定在左側下腹腹股溝處向右側上腹穿刺，注射原頭節培養液，每只小白鼠接種原頭節1 mL[13]，接種結束后12 h恢復進食。
1.2.4 檢測小白鼠包蟲病感染情況
在小白鼠種植原頭節4個月后，行心臟采血進行包蟲抗體檢測。為觀察檢測過程中是否有假陽性情況出現，另取10只未接種原頭節小白鼠的血液一同進行檢測。取血后將血液置于離心管中以3 000 r/min離心，取其中的血清備用。取出所需量的反應板條，每孔加樣本稀釋液2滴，再分別加入待檢的血清樣本10μL，混勻。同時設陰性組2孔，陽性及空白對照各1孔，陰性、陽性對照與待檢樣本同步處理，空白對照孔加入樣本稀釋液2滴。37℃避光反應30 min后甩去孔內液體，每孔加洗滌液1滴，立即用蒸餾水注滿，靜置30 s后甩去，再直接用蒸餾水洗滌4次，甩去，拍干。除空白對照孔外其余每孔加酶結合物2滴，37℃避光反應30 min后甩去孔內液體，如上洗滌，拍干。加底物和顯色劑各1滴，混勻，37℃下避光顯色10 min。加終止液1滴，混勻，終止反應，以空白對照調零，用酶標儀于450 nm（620 nm作參比波長）讀取吸光度值，按照試劑盒要求，陰性對照組吸光度值應小于0.15而陽性對照組吸光度值應大于0.50則說明操作無誤，實驗有效。隨后按照臨界值（COV）=陰性對照平均吸光度值×3.1求得COV，以該值對比各實驗組吸光度值，吸光度值≥COV時，判為細粒棘球蚴IgG抗體陽性，吸光度值< COV時，判為細粒棘球蚴IgG抗體陰性。
1.2.5 觀察棘球蚴發生及發育情況
在包蟲抗體結果證明接種小白鼠全部感染包蟲病后，將小鼠剖腹觀察。取出腹腔內囊腫，剪去囊腫外機體組織，以清潔干燥紗布擦干后進行稱重。分析各組的抑囊率，抑囊率=（1-實驗組囊腫平均重量/對照組囊腫平均重量）×100%；棘球蚴發生率，棘球蚴發生率=各組棘球蚴發生數/各組樣本總數×100%，并最終對各項數據進行分析，對比各照射劑量與效果之間的關系。
1.2.6 HE染色
按照HE染色切片制作要求進行。
1.2.7 切片茜素紅鈣染色
按照切片茜素紅鈣染色要求進行。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件包及SAS數據分析軟件對數據進行分析。計量資料比較采用秩和檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗（由于需要做兩兩比較，檢驗水準α’=0.005）；計數資料比較采用趨勢χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 模型建立結果
原頭節經過γ-射線照射后種植于小鼠腹腔，小鼠生存狀況良好，未出現死亡，在種植后第3個月時個別小鼠可在腹壁下捫及質地柔軟的小包塊。
2.2 小鼠血清抗體檢測結果
按試劑盒說明進行完操作后，將所取得的結果逐一分析：首先觀察陰性對照組吸光度值< 0.15，陽性對照組吸光度值> 0.50，說明實驗有效；求得本次檢測的COV=0.431 282 85。經對比發現，接種了原頭節的小白鼠血清檢測均呈陽性反應，而未接種原頭節的小白鼠血清檢測均呈陰性反應。
2.3 肉眼觀察囊腫形態結果
抽血結束后立即將小白鼠托頸椎處死，剖腹觀察見對照組所有的小鼠及實驗組部分小鼠腹腔內有囊腫形成，囊腫多生長于腹壁、腸系膜上（圖 1）。經過對比觀察發現，對照組小白鼠腹腔內囊腫體積偏大，與周圍組織粘連輕，囊腫形態呈圓形，顏色呈白色、淡黃色或透明，囊壁有彈性，內有清亮囊液（圖 2）；實驗組小白鼠腹腔囊腫體積偏小，并與周圍組織有粘連，囊腫壁增厚，部分呈退化實變（圖 3），部分實驗組小鼠腹腔內未見有囊腫出現。
圖1
示對照組小鼠腹腔內可以看到呈圓形的棘球蚴(虛線圈內)??圖 2??示對照組棘球蚴體積偏大，囊壁透明，囊液清澈??圖 3??示實驗組棘球蚴體積偏小，囊壁實變，囊液渾濁。3A：40 Gy組；3B：80 Gy組??圖 4??示棘球蚴典型結構圖（HE×200）。可清晰見到生發層、角質層、纖維層等典型結構??圖 5??示實驗組棘球蚴囊壁情況。5A：示棘球蚴生發層細胞毛糙（HE×200）；5B：示棘球蚴生發層消失（HE×200）；5C：示棘球蚴生發層與角質層發生分離，形成空泡（HE×200）；5D：示棘球蚴角質層發生分離（HE×200）；5E：示棘球蚴角質層與纖維層發生分離形成空泡（HE×100）；5F：示棘球蚴纖維層與組織分離（HE×400）；5G：示棘球蚴內囊塌陷（HE×200）；5H：示棘球蚴角質層斷裂（HE×200）??圖 6??示棘球蚴染色結果。6A：示對照組棘球蚴染色均勻，未見鈣鹽沉著（茜素紅鈣染色×200）；6B：示10 Gy組棘球蚴角質層內側面1/3處有鈣鹽沉積現象（茜素紅鈣染色×200）；6C：示20 Gy組棘球蚴角質層全層均有鈣鹽沉積現象，同時角質層內側呈現出波浪（茜素紅鈣染色×400）；6D：示40 Gy組棘球蚴角質層全層均有鈣鹽沉積現象（茜素紅鈣染色×400）；6E：示80 Gy組棘球蚴角質層塌陷并形成鈣化灶（茜素紅鈣染色×400）；6F：示80 Gy組棘球蚴角質層斷裂染色情況（茜素紅鈣染色×200）
2.4 囊腫性質辨別
在觀察了對照組囊腫HE染色切片之后發現，囊腫壁結構均勻、清晰，可以觀察到生發層、角質層、纖維層，據此確認所發現囊腫為棘球蚴，但生發層并未發現有子囊及原頭節生成，見圖 4。
2.5 棘球蚴發生率比較
在實驗組，部分小白鼠腹腔內并未發現棘球蚴，對此進行分析發現，各組棘球蚴發生率隨劑量增加呈下降趨勢，經趨勢卡方檢驗，差異有統計學意義（χ2=7.82，P=0.005），見表 1。說明隨著照射劑量的增加，棘球蚴發生率會得到抑制。
表1
各組棘球蚴發生率結果
2.6 棘球蚴重量對比
對各組數據的正態性進行檢驗，結果發現，對照組、10 Gy組服從正態分布（P=0.644，P=0.751），而其余3組數據不服從正態分布（P=0.016，P=0.015，P=0.002），所以求其中位數（M）并進行秩和檢驗，經過檢驗后認為所有劑量組和對照組比較差異都有統計學意義（P < 0.001）；兩兩比較發現，只有80 G y組與10 Gy組間比較差異有統計學意義（P < 0.001）。見表 2。
表2
各組棘球蚴重量比較
2.7 棘球蚴抑囊率對比
鑒于各實驗組棘球蚴重量的分布類型，利用M求各組棘球蚴的平均重量及抑囊率，10 Gy、20 Gy、40 Gy、80 Gy各亞組的抑囊率分別為73.55%、87.92%、91.48%、99.61%，通過抑囊率分析可以初步看出，隨著γ-射線劑量的增加，抑囊率也會有所增加。
2.8 棘球蚴切片HE染色結果
在對比各組棘球蚴切片中生發層、角質層、纖維層后發現，對照組棘球蚴囊壁厚度均勻，生發層細胞分布完整、厚度一致，但未見有原頭蚴或生發囊出現，角質層走行良好，透明，纖維層組織致密，與角質層及組織緊密貼合（圖 3）。與之相比較發現，實驗組中棘球蚴的囊壁出現多種結構的損傷（圖 5）。
2.9 棘球蚴切片茜素紅鈣染色結果
棘球蚴切片經過茜素紅鈣染色后可見，對照組染色均勻，未發現有鈣染色現象；而實驗組切片中可見到角質層有間斷性鈣鹽沉著現象，且該現象隨著照射劑量的增加而明顯。見圖 6。
3 討論
γ-射線作為一種電離輻射，會引起DNA結構的損傷，可導致DNA結構和功能的改變和代謝變化。DNA的感染性、轉化活力、錄制、轉錄能力等均屬于DNA的生物學功能。DNA是細胞生長、發育、繁殖、遺傳的重要物質基礎，它蘊藏著豐富的遺傳信息，通過轉錄和翻譯，指導蛋白質和酶的生物合成，主宰著細胞的各種生理功能。
本研究中發現，經過γ-射線照射后的原頭節種植于小鼠后，對照組小鼠腹腔內均有棘球蚴形成，而實驗組中隨著照射劑量的增大，棘球蚴發生率逐漸降低，結果提示，在這一劑量范圍內γ-射線對原頭節細胞DNA造成的損傷是一種可修復的損傷。由于有修復因素的作用，致使在實驗組中仍會有棘球蚴形成。但隨著照射劑量的增加，原頭節細胞修復能力出現失代償，原頭節的發生率會逐漸降低，提示照射劑量與原頭節的發生率之間存在著量效關系。
分析各組棘球蚴重量可發現，在10～20 Gy范圍內，隨著γ-射線照射劑量增加，原頭節形成的棘球蚴重量會下降，結果提示，由于原頭節細胞DNA結構受損，造成其生物學功能的障礙，導致了棘球蚴發育的程度不同；但在20～80 Gy范圍內，γ-射線劑量的增加不再導致棘球蚴重量的變化，結合棘球蚴發生率的變化可以認為，不同劑量γ-射線照射原頭節的初期原頭節細胞DNA的損傷和機體免疫反應的共同影響會導致棘球蚴發生率出現差異，但是一旦原頭節形成了棘球蚴，那么機體的免疫反應不再對棘球蚴發生作用，這和Smyth等[14]的觀點相一致。
我們隨后的研究發現，照射后的原頭節雖然可以形成棘球蚴，但是γ-射線對其造成的影響仍然在持續作用，其作用的靶點很大程度上集中在所形成棘球蚴的生發層之上，生發層是形成角質層的物質基礎，而角質層又對生發層結構功能起著保護作用。我們可以看到通過HE染色后的棘球蚴，實驗組部分角質層出現了生長不均，與纖維層脫離、塌陷甚至是斷裂的現象，這說明原頭節經過照射后所形成的棘球蚴生發層正常生理功能遭到了破壞，以致發生上述變化。在進一步的茜素紅鈣染色觀察中我們發現，實驗組棘球蚴出現大量鈣化現象，這說明原頭節在γ-射線照射后所形成的棘球蚴被動地加快了壞死鈣化的進程。
綜上所述，我們認為，γ-射線不僅可以導致原頭節死亡[9]，而且可以和機體免疫功能共同作用降低其形成棘球蚴的幾率，其作用可以延續至所形成的棘球蚴，破壞所形成棘球蚴的生發層的正常生理功能，并且能加快所形成棘球蚴向壞死、鈣化轉歸的進程。γ-射線的這一作用如果能應用于包蟲病的腹腔鏡及其他術前治療，那么可以大大降低術后因原頭節種植所導致的復發，擴大手術適應證，這在目前沒有有效藥物殺滅原頭節的背景下有積極的作用。但如何在臨床治療中從10～80 Gy劑量范圍內選擇最適宜的照射劑量，是否采取分次照射，以及考慮到組織照射后所出現的急性炎癥、水腫[15]，照射后的手術時機等因素尚需進一步研究探討。
棘球蚴病即包蟲病，是一種危害嚴重的人獸共患寄生蟲病。細粒棘球蚴原頭節是人類包蟲病發病的一個中心環節，由于目前沒有藥物能有效殺滅原頭節[1-5]，因此它是影響手術治療預后的重要因素[6-8]，尤其在利用腹腔鏡治療肝包蟲病的過程中，由于忌憚術中棘球蚴囊液外溢所造成的原頭節種植，往往對棘球蚴的大小和位置有較多的限制。鑒于此，本研究結合先前γ-射線體外照射殺滅細粒棘球蚴原頭節的實驗結果[9]，利用不同劑量的γ-射線對細粒棘球蚴原頭節進行照射，并將照射后的原頭節種植于小白鼠腹腔，模擬經γ-射線照射后的細粒棘球蚴原頭節隨囊液外溢種植于腹腔的情況，觀察其差異，為腹腔鏡治療肝包蟲病術前γ-射線照射以抑制囊液外溢造成腹腔種植探索一種方法。
1 材料與方法
1.1 主要材料
1.1.1 細粒棘球蚴原頭節
細粒棘球蚴原頭節在四川省人民醫院于肝包蟲病手術中采集，術中采取外囊完整切除術，將標本置于4℃以下冰盒中低溫保存送入實驗室。將采集到的肝包蟲囊腫置于超凈工作臺上用75%的乙醇消毒表面后，用50 mL注射器穿刺抽取囊液，抽取時采取反復吹打的方式，確保依附于內囊壁的原頭節完全被采集。抽凈囊液后剪開囊壁，用生理鹽水沖洗內囊表面，將沖洗液與囊液一同收集備用。用離心機以3 000 r/min離心5 min后得到黃白色囊砂，倒去上清液后用沖洗液（含青霉素1 500 U/mL，含鏈霉素1 000 U/mL的生理鹽水）沖洗3次。向囊砂內滴加20%胰蛋白酶溶液1 mL，靜置20 min以融化其中的組織碎屑，然后再次用沖洗液沖洗、離心、去除上清液[10]。將最終獲得的原頭節備用。
1.1.2 主要試劑
RPMI-1640培養液、胎牛血清、青-鏈霉素溶液、美藍溶液及胰蛋白酶溶液，均為賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司。包蟲抗體檢測試劑盒，廣州健侖生物科技有限公司。GENMED石蠟切片組織茜素紅鈣染色試劑盒，上海杰美基因醫藥科技有限公司。
1.1.3 主要儀器
BX50倒置顯微鏡，日本Olympus公司。ALLEGR-64型臺式離心機，美國Beckman公司。37℃CO2培養箱，賽默飛世爾科技有限公司。SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司。GWXJ80型鈷-60遠距離治療機，中國核動力研究設計院設備制造。電子天平FA2004、1004，大連醫療儀器有限公司。光學顯微鏡照相系統，瀘州醫學院附屬醫院病理教研室。
1.1.4 實驗動物
清潔級，雌性，昆明小白鼠，6周齡，體質量（20±4）g，由瀘州醫學院動物實驗室提供。
1.2 方法
1.2.1 原頭節的孵育
向收集原頭節的試管內滴加10 mL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養液后將其搖勻，取0.2 mL溶液滴在玻片上置于倒置顯微鏡下以計數，反復5次，求其平均數。再向所取的溶液中滴加20%美藍溶液，觀察原頭節的存活情況（活的原頭節不會被染色，死亡的原頭節會被染成藍色），要求原頭節的存活率大于90%。最后經計算，將原頭節以2 000個/mL的密度培養于含20%胎牛血清的RPMI-1640培養液中（2 000個/mL適宜原頭節的生長發育）[11]。此后置于37℃CO2培養箱中進行培養。
1.2.2 γ-射線照射
待原頭節培養至出現外翻現象時（原頭節外翻說明其對周圍環境逐漸適應）開始進行γ-射線照射[12]。實驗時將含原頭節的培養液平均分為5個組，其中1組作為對照組，另外4組作為實驗組，置于鈷-60治療儀下進行照射，借鑒前一階段實驗的結果[9]，將照射劑量控制在低-中劑量范圍內（分別為10 Gy、20 Gy、40 Gy、80 Gy），以免發生原頭節在照射后因為急速死亡而導致的種植無效。
1.2.3 接種及分組
在照射結束后，將原頭節接種給禁食1 d后的小白鼠，接種時將雌性小白鼠75只按隨機數字表法均分為5組，每組15只，采取腹腔穿刺接種的方式。穿刺點統一定在左側下腹腹股溝處向右側上腹穿刺，注射原頭節培養液，每只小白鼠接種原頭節1 mL[13]，接種結束后12 h恢復進食。
1.2.4 檢測小白鼠包蟲病感染情況
在小白鼠種植原頭節4個月后，行心臟采血進行包蟲抗體檢測。為觀察檢測過程中是否有假陽性情況出現，另取10只未接種原頭節小白鼠的血液一同進行檢測。取血后將血液置于離心管中以3 000 r/min離心，取其中的血清備用。取出所需量的反應板條，每孔加樣本稀釋液2滴，再分別加入待檢的血清樣本10μL，混勻。同時設陰性組2孔，陽性及空白對照各1孔，陰性、陽性對照與待檢樣本同步處理，空白對照孔加入樣本稀釋液2滴。37℃避光反應30 min后甩去孔內液體，每孔加洗滌液1滴，立即用蒸餾水注滿，靜置30 s后甩去，再直接用蒸餾水洗滌4次，甩去，拍干。除空白對照孔外其余每孔加酶結合物2滴，37℃避光反應30 min后甩去孔內液體，如上洗滌，拍干。加底物和顯色劑各1滴，混勻，37℃下避光顯色10 min。加終止液1滴，混勻，終止反應，以空白對照調零，用酶標儀于450 nm（620 nm作參比波長）讀取吸光度值，按照試劑盒要求，陰性對照組吸光度值應小于0.15而陽性對照組吸光度值應大于0.50則說明操作無誤，實驗有效。隨后按照臨界值（COV）=陰性對照平均吸光度值×3.1求得COV，以該值對比各實驗組吸光度值，吸光度值≥COV時，判為細粒棘球蚴IgG抗體陽性，吸光度值< COV時，判為細粒棘球蚴IgG抗體陰性。
1.2.5 觀察棘球蚴發生及發育情況
在包蟲抗體結果證明接種小白鼠全部感染包蟲病后，將小鼠剖腹觀察。取出腹腔內囊腫，剪去囊腫外機體組織，以清潔干燥紗布擦干后進行稱重。分析各組的抑囊率，抑囊率=（1-實驗組囊腫平均重量/對照組囊腫平均重量）×100%；棘球蚴發生率，棘球蚴發生率=各組棘球蚴發生數/各組樣本總數×100%，并最終對各項數據進行分析，對比各照射劑量與效果之間的關系。
1.2.6 HE染色
按照HE染色切片制作要求進行。
1.2.7 切片茜素紅鈣染色
按照切片茜素紅鈣染色要求進行。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件包及SAS數據分析軟件對數據進行分析。計量資料比較采用秩和檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗（由于需要做兩兩比較，檢驗水準α’=0.005）；計數資料比較采用趨勢χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 模型建立結果
原頭節經過γ-射線照射后種植于小鼠腹腔，小鼠生存狀況良好，未出現死亡，在種植后第3個月時個別小鼠可在腹壁下捫及質地柔軟的小包塊。
2.2 小鼠血清抗體檢測結果
按試劑盒說明進行完操作后，將所取得的結果逐一分析：首先觀察陰性對照組吸光度值< 0.15，陽性對照組吸光度值> 0.50，說明實驗有效；求得本次檢測的COV=0.431 282 85。經對比發現，接種了原頭節的小白鼠血清檢測均呈陽性反應，而未接種原頭節的小白鼠血清檢測均呈陰性反應。
2.3 肉眼觀察囊腫形態結果
抽血結束后立即將小白鼠托頸椎處死，剖腹觀察見對照組所有的小鼠及實驗組部分小鼠腹腔內有囊腫形成，囊腫多生長于腹壁、腸系膜上（圖 1）。經過對比觀察發現，對照組小白鼠腹腔內囊腫體積偏大，與周圍組織粘連輕，囊腫形態呈圓形，顏色呈白色、淡黃色或透明，囊壁有彈性，內有清亮囊液（圖 2）；實驗組小白鼠腹腔囊腫體積偏小，并與周圍組織有粘連，囊腫壁增厚，部分呈退化實變（圖 3），部分實驗組小鼠腹腔內未見有囊腫出現。
圖1
示對照組小鼠腹腔內可以看到呈圓形的棘球蚴(虛線圈內)??圖 2??示對照組棘球蚴體積偏大，囊壁透明，囊液清澈??圖 3??示實驗組棘球蚴體積偏小，囊壁實變，囊液渾濁。3A：40 Gy組；3B：80 Gy組??圖 4??示棘球蚴典型結構圖（HE×200）。可清晰見到生發層、角質層、纖維層等典型結構??圖 5??示實驗組棘球蚴囊壁情況。5A：示棘球蚴生發層細胞毛糙（HE×200）；5B：示棘球蚴生發層消失（HE×200）；5C：示棘球蚴生發層與角質層發生分離，形成空泡（HE×200）；5D：示棘球蚴角質層發生分離（HE×200）；5E：示棘球蚴角質層與纖維層發生分離形成空泡（HE×100）；5F：示棘球蚴纖維層與組織分離（HE×400）；5G：示棘球蚴內囊塌陷（HE×200）；5H：示棘球蚴角質層斷裂（HE×200）??圖 6??示棘球蚴染色結果。6A：示對照組棘球蚴染色均勻，未見鈣鹽沉著（茜素紅鈣染色×200）；6B：示10 Gy組棘球蚴角質層內側面1/3處有鈣鹽沉積現象（茜素紅鈣染色×200）；6C：示20 Gy組棘球蚴角質層全層均有鈣鹽沉積現象，同時角質層內側呈現出波浪（茜素紅鈣染色×400）；6D：示40 Gy組棘球蚴角質層全層均有鈣鹽沉積現象（茜素紅鈣染色×400）；6E：示80 Gy組棘球蚴角質層塌陷并形成鈣化灶（茜素紅鈣染色×400）；6F：示80 Gy組棘球蚴角質層斷裂染色情況（茜素紅鈣染色×200）
2.4 囊腫性質辨別
在觀察了對照組囊腫HE染色切片之后發現，囊腫壁結構均勻、清晰，可以觀察到生發層、角質層、纖維層，據此確認所發現囊腫為棘球蚴，但生發層并未發現有子囊及原頭節生成，見圖 4。
2.5 棘球蚴發生率比較
在實驗組，部分小白鼠腹腔內并未發現棘球蚴，對此進行分析發現，各組棘球蚴發生率隨劑量增加呈下降趨勢，經趨勢卡方檢驗，差異有統計學意義（χ2=7.82，P=0.005），見表 1。說明隨著照射劑量的增加，棘球蚴發生率會得到抑制。
表1
各組棘球蚴發生率結果
2.6 棘球蚴重量對比
對各組數據的正態性進行檢驗，結果發現，對照組、10 Gy組服從正態分布（P=0.644，P=0.751），而其余3組數據不服從正態分布（P=0.016，P=0.015，P=0.002），所以求其中位數（M）并進行秩和檢驗，經過檢驗后認為所有劑量組和對照組比較差異都有統計學意義（P < 0.001）；兩兩比較發現，只有80 G y組與10 Gy組間比較差異有統計學意義（P < 0.001）。見表 2。
表2
各組棘球蚴重量比較
2.7 棘球蚴抑囊率對比
鑒于各實驗組棘球蚴重量的分布類型，利用M求各組棘球蚴的平均重量及抑囊率，10 Gy、20 Gy、40 Gy、80 Gy各亞組的抑囊率分別為73.55%、87.92%、91.48%、99.61%，通過抑囊率分析可以初步看出，隨著γ-射線劑量的增加，抑囊率也會有所增加。
2.8 棘球蚴切片HE染色結果
在對比各組棘球蚴切片中生發層、角質層、纖維層后發現，對照組棘球蚴囊壁厚度均勻，生發層細胞分布完整、厚度一致，但未見有原頭蚴或生發囊出現，角質層走行良好，透明，纖維層組織致密，與角質層及組織緊密貼合（圖 3）。與之相比較發現，實驗組中棘球蚴的囊壁出現多種結構的損傷（圖 5）。
2.9 棘球蚴切片茜素紅鈣染色結果
棘球蚴切片經過茜素紅鈣染色后可見，對照組染色均勻，未發現有鈣染色現象；而實驗組切片中可見到角質層有間斷性鈣鹽沉著現象，且該現象隨著照射劑量的增加而明顯。見圖 6。
3 討論
γ-射線作為一種電離輻射，會引起DNA結構的損傷，可導致DNA結構和功能的改變和代謝變化。DNA的感染性、轉化活力、錄制、轉錄能力等均屬于DNA的生物學功能。DNA是細胞生長、發育、繁殖、遺傳的重要物質基礎，它蘊藏著豐富的遺傳信息，通過轉錄和翻譯，指導蛋白質和酶的生物合成，主宰著細胞的各種生理功能。
本研究中發現，經過γ-射線照射后的原頭節種植于小鼠后，對照組小鼠腹腔內均有棘球蚴形成，而實驗組中隨著照射劑量的增大，棘球蚴發生率逐漸降低，結果提示，在這一劑量范圍內γ-射線對原頭節細胞DNA造成的損傷是一種可修復的損傷。由于有修復因素的作用，致使在實驗組中仍會有棘球蚴形成。但隨著照射劑量的增加，原頭節細胞修復能力出現失代償，原頭節的發生率會逐漸降低，提示照射劑量與原頭節的發生率之間存在著量效關系。
分析各組棘球蚴重量可發現，在10～20 Gy范圍內，隨著γ-射線照射劑量增加，原頭節形成的棘球蚴重量會下降，結果提示，由于原頭節細胞DNA結構受損，造成其生物學功能的障礙，導致了棘球蚴發育的程度不同；但在20～80 Gy范圍內，γ-射線劑量的增加不再導致棘球蚴重量的變化，結合棘球蚴發生率的變化可以認為，不同劑量γ-射線照射原頭節的初期原頭節細胞DNA的損傷和機體免疫反應的共同影響會導致棘球蚴發生率出現差異，但是一旦原頭節形成了棘球蚴，那么機體的免疫反應不再對棘球蚴發生作用，這和Smyth等[14]的觀點相一致。
我們隨后的研究發現，照射后的原頭節雖然可以形成棘球蚴，但是γ-射線對其造成的影響仍然在持續作用，其作用的靶點很大程度上集中在所形成棘球蚴的生發層之上，生發層是形成角質層的物質基礎，而角質層又對生發層結構功能起著保護作用。我們可以看到通過HE染色后的棘球蚴，實驗組部分角質層出現了生長不均，與纖維層脫離、塌陷甚至是斷裂的現象，這說明原頭節經過照射后所形成的棘球蚴生發層正常生理功能遭到了破壞，以致發生上述變化。在進一步的茜素紅鈣染色觀察中我們發現，實驗組棘球蚴出現大量鈣化現象，這說明原頭節在γ-射線照射后所形成的棘球蚴被動地加快了壞死鈣化的進程。
綜上所述，我們認為，γ-射線不僅可以導致原頭節死亡[9]，而且可以和機體免疫功能共同作用降低其形成棘球蚴的幾率，其作用可以延續至所形成的棘球蚴，破壞所形成棘球蚴的生發層的正常生理功能，并且能加快所形成棘球蚴向壞死、鈣化轉歸的進程。γ-射線的這一作用如果能應用于包蟲病的腹腔鏡及其他術前治療，那么可以大大降低術后因原頭節種植所導致的復發，擴大手術適應證，這在目前沒有有效藥物殺滅原頭節的背景下有積極的作用。但如何在臨床治療中從10～80 Gy劑量范圍內選擇最適宜的照射劑量，是否采取分次照射，以及考慮到組織照射后所出現的急性炎癥、水腫[15]，照射后的手術時機等因素尚需進一步研究探討。
