引用本文： 錢江, 韓佳, 陳鵬, 朱春麗, 楊銀. Twist與E-cadherin在結直腸癌中的表達及其意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(1): 114-116. doi: 10.7507/1007-9424.20150031 復制
上皮-間質轉化（EMT），其核心機理為誘導形成腫瘤浸潤和轉移的過程，上皮細胞通過失去極性并轉換為間充質表型[1]。ZEB1、SIP1、Twsit、E47等基因通過抑制E-cadherin蛋白表達的實驗證實了EMT存在[2]。Twist為在果蠅、鼠、人等生物體內的一種堿性螺旋-環-螺旋（basichelix loop helix, bHLH）轉錄因子，主要表達于胎盤、胚胎中胚層和成人的某些中胚層來源的未分化組織。研究證明，Twist在子宮內膜癌[3]、移行細胞癌[4]、肝癌[5]和胃癌[6]中異常表達，并對其侵襲和預后發揮重要作用。同時，Twsit基因在腫瘤發生發展過程中獨立誘導產生一系列的間充質標志物。本研究通過免疫組化方法檢測Twist和E-cadherin蛋白在結直腸癌組織中的表達，分析Twist和E-cadherin蛋白表達與結直腸癌臨床病理因素及其預后的關系。
1 資料和方法
1.1 臨床資料
選取2003年1月至2008年3月期間在筆者所在醫院接受手術治療的結直腸癌患者63例作為研究對象。其中男36例，女27例；年齡24～83歲，中位年齡64歲；全部病例均經病理學檢查證實診斷。63例中結腸癌38例，直腸癌25例；高中分化腺癌50例，低分化腺癌13例；有淋巴結轉移者18例，無淋巴結轉移者45例。另取其中21例的結直腸正常組織（取距腫瘤5 cm以遠的組織并經病理學檢查證實）作為對照。所有病例術前均未行放化療及免疫治療。所有標本均經過甲醛固定，石蠟包埋，4μm厚連續切片，行常規HE染色。63例患者無住院期間死亡。門診隨訪日期從患者術后第1天開始，隨訪至2013年1月31日止，隨訪時間6～60個月，平均隨訪42個月；失訪5例。
1.2 方法
1.2.1 試劑
鼠抗人Twist多克隆抗體（Abcam, 美國）, 鼠抗人E-cadherin單克隆抗體（Abcam，美國），即用型SABC免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。
1.2.2 直腸癌組織中Twis及E-cadherin蛋白表達檢測
采用免疫組織化學法。取石蠟切片脫蠟至水；滴加一抗的組織切片用EDTA緩沖液高壓熱修復10 min，修復后的切片在緩沖液中冷卻后，滴加過氧化物酶阻斷溶液；用50 mL正常山羊血清封閉，然后滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜；滴加二抗，滴加鏈霉菌抗生物素過氧化物酶溶液；DAB顯色；用PBS代替一抗作陰性對照。
1.2.3 結果判定
通過染色程度和染色細胞的百分比進行判定評分。染色陽性信號以細胞核和細胞質著色為標準，呈棕黃色顆粒，細胞染色強度呈棕黃色者為陽性細胞。按切片中陽性細胞比例分別記0～4分：在每5個高倍鏡檢視野下，切片中陽性細胞數≤5%記為0分；6%～25%記為1分；26%～50%記為2分；51%～75%記為3分，> 75%記為4分。按染色深淺分別記為0～3分，染色深度以多數細胞為準：無陽性細胞為0分；黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。最終以陽性細胞的百分率得分與免疫染色強度得分的乘積作為免疫反應的最后得分，根據這兩項指標的總積分將結果分成4級：0分為（-）；1～2分為（+）；3～4分為（++）；5～12分為（+++）。其中（-）和（+）為低表達，（++）和（+++）為高表達。
1.3 統計學方法
以SPSS 17.0統計軟件包進行統計學分析。對結果資料行χ2檢驗，用Kaplan-Meier法計算生存率，行log-rank檢驗，直線相關分析，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Twsit和E-cadherin蛋白在不同組織中的表達結果
Twsit和E-cadherin蛋白在結直腸癌組織和正常結直腸黏膜組織中的表達結果見圖 1～圖 4。Twsit蛋白表達于結直腸癌組織的細胞質中，其表達陽性率為66.7%（42/63），在正常結直腸黏膜組織的表達陽性率為14.2%（3/21），明顯低于前者（P < 0.01）。正常結直腸黏膜組織中E-cadherin蛋白表達定位于上皮細胞膜，其表達陽性率為81.0%（17/21），而在結直腸癌組織中E-cadherin蛋白的表達呈現不同程度缺失，其表達陽性率為20.6%（13/63），P < 0.01。
圖1
Twsit在結直腸癌組織中表達(免疫組化SP×200)??圖 2Twsit在正常結腸黏膜中表達(免疫組化SP×200)??圖 3E-cadherin在結直腸癌組織中表達(免疫組化SP×200)??圖 4 E-cadherin在結腸黏膜中表達(免疫組化SP×200)
2.2 結直腸癌組織中Twsit和E-cadherin蛋白表達與其臨床病理特征的關系
結直腸癌組織中Twsit及E-cadherin蛋白的表達均與腫瘤部位及患者性別和年齡無關（P > 0.05），而與腫瘤的分化程度以及T、N和M分期有關（P < 0.05）。見表 1。
表1
結直腸癌組織中Twsit和E-cadherin蛋白表達與其臨床病理特征的關系
2.3 結直腸癌組織中Twsit和E-cadherin蛋白表達的相關性
結直腸癌組織中Twsit蛋白表達陽性者42例中，E-cadherin蛋白表達陽性10例（23.8%），表達陰性32例（76.2%）；Twsit蛋白表達陰性者21例中，E-cadherin蛋白表達陽性3例（14.3%），表達陰性18例（85.7%），二者的表達呈負相關關系（r=-0.215，P=0.039）。
2.4 生存分析
根據本組患者的隨訪結果顯示，Twsit蛋白表達陽性者的生存率明顯低于Twsit表達陰性者（P < 0.05），見圖 5；E-cadherin蛋白表達陰性者的生存率明顯低于E-cadherin表達陽性者（P < 0.05），見圖 6。
圖5
Twsit蛋白表達患者的生存曲線??圖 6E-cadherin蛋白表達患者的生存曲線
3 討論
結直腸癌是全球第3大常見惡性腫瘤[7]。因正常結腸上皮細胞的過度異常增殖，以及形成腺瘤性息肉，進而發展成為惡性腫瘤[8]。
本組病例結果表明，Twist蛋白在結直腸癌組織中的表達陽性率較高（66.7%）。Twist是一種高度保守的堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子，并介導軸和模型形成[9]。研究[10]表明，Twist誘導產生的上皮-間質轉化（EMT）在高轉移乳腺癌細胞中，對促進腫瘤細胞的侵襲起到了關鍵作用。Twist在惡性腫瘤中的調控機理仍不清楚。Fackler等[11]的研究表明，在乳腺癌組織中，Twist基因在浸潤性小葉癌啟動子甲基化比浸潤性導管癌少，因此在浸潤性小葉癌中Twist基因的表達較高。Mehrota等[12]研究證實，Twist基因啟動子超甲基在轉移灶中比原發性乳腺癌病灶表達多。因此，有必要對Twist基因如何促進甲基化并影響臨床療效做進一步研究。Twist是一種可能通過EMT途徑在腫瘤細胞中具有浸潤表型的原癌基因。Yang等[13]研究表明，Twist是HIF-1的下游基因，在EMT和誘導產生轉移表型中缺氧以及HIF-1的過表達起了關鍵作用。他們提出了缺氧或HIF-1通過直接激活Twist表達進而誘導形成EMT，這可能是一個早期步驟，是造成缺氧誘導腫瘤進展和轉移的重要機理。
在子宮內膜癌[3]和肝細胞癌[5]中，E-cadherin表達顯著降低，E-cadherin表達的缺失是EMT形成的一個關鍵組成部分。抑制E-cadherin表達涉及通過啟動子的E-box沉默E-cadherin轉錄因子，Twist在人乳腺上皮細胞中的過表達可抑制E-cadherin蛋白啟動子活性。APC抑癌基因是腫瘤發生的關鍵，含有啟動子E-box基序。
本組資料結果顯示，結直腸癌組織中Twist蛋白及E-cadherin蛋白的表達均與腫瘤的浸潤深度有關；生存分析顯示，Twsit蛋白表達陽性患者的生存率明顯低于表達陰性患者（P < 0.05），E-cadherin蛋白表達陰性患者的生存率也明顯低于表達陽性患者（P < 0.05）。
綜上所述，Twsit和E-cadherin二者與結直腸癌的發生發展等生物學行為密切相關，其具體機理有待于進一步研究。在結直腸癌的發生與Twsit表達上調有密切關系；Twist和E-cadherin蛋白表達呈負相關，提示在EMT過程中可能通過抑制E-cadherin表達來實現，可發作為結直腸癌患者預后的新指標，并成為潛在的治療靶點。
上皮-間質轉化（EMT），其核心機理為誘導形成腫瘤浸潤和轉移的過程，上皮細胞通過失去極性并轉換為間充質表型[1]。ZEB1、SIP1、Twsit、E47等基因通過抑制E-cadherin蛋白表達的實驗證實了EMT存在[2]。Twist為在果蠅、鼠、人等生物體內的一種堿性螺旋-環-螺旋（basichelix loop helix, bHLH）轉錄因子，主要表達于胎盤、胚胎中胚層和成人的某些中胚層來源的未分化組織。研究證明，Twist在子宮內膜癌[3]、移行細胞癌[4]、肝癌[5]和胃癌[6]中異常表達，并對其侵襲和預后發揮重要作用。同時，Twsit基因在腫瘤發生發展過程中獨立誘導產生一系列的間充質標志物。本研究通過免疫組化方法檢測Twist和E-cadherin蛋白在結直腸癌組織中的表達，分析Twist和E-cadherin蛋白表達與結直腸癌臨床病理因素及其預后的關系。
1 資料和方法
1.1 臨床資料
選取2003年1月至2008年3月期間在筆者所在醫院接受手術治療的結直腸癌患者63例作為研究對象。其中男36例，女27例；年齡24～83歲，中位年齡64歲；全部病例均經病理學檢查證實診斷。63例中結腸癌38例，直腸癌25例；高中分化腺癌50例，低分化腺癌13例；有淋巴結轉移者18例，無淋巴結轉移者45例。另取其中21例的結直腸正常組織（取距腫瘤5 cm以遠的組織并經病理學檢查證實）作為對照。所有病例術前均未行放化療及免疫治療。所有標本均經過甲醛固定，石蠟包埋，4μm厚連續切片，行常規HE染色。63例患者無住院期間死亡。門診隨訪日期從患者術后第1天開始，隨訪至2013年1月31日止，隨訪時間6～60個月，平均隨訪42個月；失訪5例。
1.2 方法
1.2.1 試劑
鼠抗人Twist多克隆抗體（Abcam, 美國）, 鼠抗人E-cadherin單克隆抗體（Abcam，美國），即用型SABC免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。
1.2.2 直腸癌組織中Twis及E-cadherin蛋白表達檢測
采用免疫組織化學法。取石蠟切片脫蠟至水；滴加一抗的組織切片用EDTA緩沖液高壓熱修復10 min，修復后的切片在緩沖液中冷卻后，滴加過氧化物酶阻斷溶液；用50 mL正常山羊血清封閉，然后滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜；滴加二抗，滴加鏈霉菌抗生物素過氧化物酶溶液；DAB顯色；用PBS代替一抗作陰性對照。
1.2.3 結果判定
通過染色程度和染色細胞的百分比進行判定評分。染色陽性信號以細胞核和細胞質著色為標準，呈棕黃色顆粒，細胞染色強度呈棕黃色者為陽性細胞。按切片中陽性細胞比例分別記0～4分：在每5個高倍鏡檢視野下，切片中陽性細胞數≤5%記為0分；6%～25%記為1分；26%～50%記為2分；51%～75%記為3分，> 75%記為4分。按染色深淺分別記為0～3分，染色深度以多數細胞為準：無陽性細胞為0分；黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。最終以陽性細胞的百分率得分與免疫染色強度得分的乘積作為免疫反應的最后得分，根據這兩項指標的總積分將結果分成4級：0分為（-）；1～2分為（+）；3～4分為（++）；5～12分為（+++）。其中（-）和（+）為低表達，（++）和（+++）為高表達。
1.3 統計學方法
以SPSS 17.0統計軟件包進行統計學分析。對結果資料行χ2檢驗，用Kaplan-Meier法計算生存率，行log-rank檢驗，直線相關分析，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 Twsit和E-cadherin蛋白在不同組織中的表達結果
Twsit和E-cadherin蛋白在結直腸癌組織和正常結直腸黏膜組織中的表達結果見圖 1～圖 4。Twsit蛋白表達于結直腸癌組織的細胞質中，其表達陽性率為66.7%（42/63），在正常結直腸黏膜組織的表達陽性率為14.2%（3/21），明顯低于前者（P < 0.01）。正常結直腸黏膜組織中E-cadherin蛋白表達定位于上皮細胞膜，其表達陽性率為81.0%（17/21），而在結直腸癌組織中E-cadherin蛋白的表達呈現不同程度缺失，其表達陽性率為20.6%（13/63），P < 0.01。
圖1
Twsit在結直腸癌組織中表達(免疫組化SP×200)??圖 2Twsit在正常結腸黏膜中表達(免疫組化SP×200)??圖 3E-cadherin在結直腸癌組織中表達(免疫組化SP×200)??圖 4 E-cadherin在結腸黏膜中表達(免疫組化SP×200)
2.2 結直腸癌組織中Twsit和E-cadherin蛋白表達與其臨床病理特征的關系
結直腸癌組織中Twsit及E-cadherin蛋白的表達均與腫瘤部位及患者性別和年齡無關（P > 0.05），而與腫瘤的分化程度以及T、N和M分期有關（P < 0.05）。見表 1。
表1
結直腸癌組織中Twsit和E-cadherin蛋白表達與其臨床病理特征的關系
2.3 結直腸癌組織中Twsit和E-cadherin蛋白表達的相關性
結直腸癌組織中Twsit蛋白表達陽性者42例中，E-cadherin蛋白表達陽性10例（23.8%），表達陰性32例（76.2%）；Twsit蛋白表達陰性者21例中，E-cadherin蛋白表達陽性3例（14.3%），表達陰性18例（85.7%），二者的表達呈負相關關系（r=-0.215，P=0.039）。
2.4 生存分析
根據本組患者的隨訪結果顯示，Twsit蛋白表達陽性者的生存率明顯低于Twsit表達陰性者（P < 0.05），見圖 5；E-cadherin蛋白表達陰性者的生存率明顯低于E-cadherin表達陽性者（P < 0.05），見圖 6。
圖5
Twsit蛋白表達患者的生存曲線??圖 6E-cadherin蛋白表達患者的生存曲線
3 討論
結直腸癌是全球第3大常見惡性腫瘤[7]。因正常結腸上皮細胞的過度異常增殖，以及形成腺瘤性息肉，進而發展成為惡性腫瘤[8]。
本組病例結果表明，Twist蛋白在結直腸癌組織中的表達陽性率較高（66.7%）。Twist是一種高度保守的堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子，并介導軸和模型形成[9]。研究[10]表明，Twist誘導產生的上皮-間質轉化（EMT）在高轉移乳腺癌細胞中，對促進腫瘤細胞的侵襲起到了關鍵作用。Twist在惡性腫瘤中的調控機理仍不清楚。Fackler等[11]的研究表明，在乳腺癌組織中，Twist基因在浸潤性小葉癌啟動子甲基化比浸潤性導管癌少，因此在浸潤性小葉癌中Twist基因的表達較高。Mehrota等[12]研究證實，Twist基因啟動子超甲基在轉移灶中比原發性乳腺癌病灶表達多。因此，有必要對Twist基因如何促進甲基化并影響臨床療效做進一步研究。Twist是一種可能通過EMT途徑在腫瘤細胞中具有浸潤表型的原癌基因。Yang等[13]研究表明，Twist是HIF-1的下游基因，在EMT和誘導產生轉移表型中缺氧以及HIF-1的過表達起了關鍵作用。他們提出了缺氧或HIF-1通過直接激活Twist表達進而誘導形成EMT，這可能是一個早期步驟，是造成缺氧誘導腫瘤進展和轉移的重要機理。
在子宮內膜癌[3]和肝細胞癌[5]中，E-cadherin表達顯著降低，E-cadherin表達的缺失是EMT形成的一個關鍵組成部分。抑制E-cadherin表達涉及通過啟動子的E-box沉默E-cadherin轉錄因子，Twist在人乳腺上皮細胞中的過表達可抑制E-cadherin蛋白啟動子活性。APC抑癌基因是腫瘤發生的關鍵，含有啟動子E-box基序。
本組資料結果顯示，結直腸癌組織中Twist蛋白及E-cadherin蛋白的表達均與腫瘤的浸潤深度有關；生存分析顯示，Twsit蛋白表達陽性患者的生存率明顯低于表達陰性患者（P < 0.05），E-cadherin蛋白表達陰性患者的生存率也明顯低于表達陽性患者（P < 0.05）。
綜上所述，Twsit和E-cadherin二者與結直腸癌的發生發展等生物學行為密切相關，其具體機理有待于進一步研究。在結直腸癌的發生與Twsit表達上調有密切關系；Twist和E-cadherin蛋白表達呈負相關，提示在EMT過程中可能通過抑制E-cadherin表達來實現，可發作為結直腸癌患者預后的新指標，并成為潛在的治療靶點。
