引用本文： 劉喬飛, 廖泉, 宗毅, 牛哲禹, 王夢一, 李媛, 盧朝輝, 趙玉沛. 免疫健全小鼠Panc02胰腺癌發展過程中免疫細胞群的動態變化. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(11): 1366-1371. doi: 10.7507/1007-9424.20140328 復制
胰腺癌惡性程度極高，發病率呈上升趨勢[1]。多種免疫細胞對胰腺癌的發生發展有重要影響[2-3]。在胰腺癌發生發展過程中，外周血及腫瘤組織中免疫細胞群的詳細動態變化趨勢尚不清楚。本研究通過皮下接種C57BL6/J小鼠同源Panc02胰腺癌細胞建立種植瘤模型。根據腫瘤大小將其分為T1～T4期，詳細了解各免疫細胞群的動態變化過程，為更深入研究胰腺癌的免疫調控過程提供一定的新線索。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
成年雄性C57BL6/J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，4～6周齡，體質量25～30 g。小鼠胰腺導管腺癌Panc02細胞株由本實驗室保種傳代。實驗動物飼養于SPF級環境。動物實驗均通過中國醫學科學院北京協和醫院動物倫理委員會審查。
1.2 試劑及抗體
抗小鼠單克隆或多克隆熒光標記抗體見表 1。
表1
實驗所用抗體
Table1.
List of antibodies
1.3 腫瘤模型建立及分期定義
將1×106個Panc02胰腺癌細胞接種于C57BL6/J小鼠腋下。游標卡尺測量并參考公式“腫瘤體積=1/2長徑×短徑×短徑”計算腫瘤體積。當皮下結節小于50 mm3時，很難明確其是腫瘤結節還是由于注射引起的炎性結節，故將腫瘤體積≥50 mm3定義為成瘤。當腫瘤體積≥1 500 mm3時，腫瘤生長緩慢且荷瘤小鼠開始死亡，將其定義為T4期；然后按腫瘤體積大小平均分期：50 mm3≤T1期＜500 mm3、500 mm3≤T2期＜1 000 mm3、1 000 mm3≤T3期＜1 500 mm3。選用4～6周齡C57BL6/J小鼠作為正常對照組。
1.4 流式細胞染色計數
毛細管經內眥取血后，紅細胞裂解液裂解紅細胞。獲取腫瘤組織后，機械研磨聯合胰蛋白酶消化的方法制備單細胞懸液。對組織和細胞行常規流式細胞染色方法染色。利用Accuri C6四通道流式細胞儀（BD，USA）檢測各種免疫細胞群熒光標記表面分子表達，包括炎細胞（CD45+）、粒細胞（CD11b+）、輔助T（Th）淋巴細胞（CD3+CD4+）、細胞毒性T淋巴細胞（CTL，CD3+CD8+）、B淋巴細胞（CD19+）、巨噬細胞（F4/80+）、樹突細胞（CD11c+）、自然殺傷（NK）細胞（NKp46+）及NKT細胞（CD3+NK1.1+）。
1.5 統計學方法
采用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software Inc.）軟件進行統計分析。數據采用均數±標準差（
2 結果
2.1 胰腺癌進展過程中外周血中免疫細胞群的動態變化趨勢
2.1.1 外周血中淋巴細胞逐漸減少
正常對照組外周血中淋巴細胞占所有CD45+炎細胞比例約為80%。①Th淋巴細胞比例呈逐漸減少趨勢。T1期較正常對照組明顯減少（P＜0.05）；T2期與T1期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期較正常對照組明顯減少（P＜0.05）；T3期明顯少于T2期及T1期（P＜0.05）；T4期明顯少于T3期（P＜0.05）。②CTL比例亦呈減少趨勢。T1期與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期與T1期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期明顯少于正常對照組（P＜0.05）；T3期明顯少于T2期及T1期（P＜0.05）；T4期與T3期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T4期明顯低于T2期（P＜0.05）。③B淋巴細胞比例亦呈減少趨勢，T1期與正常對照組差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期比T1期明顯減少（P＜0.05）；T3期明顯少于T2期及T1期（P＜0.05）；T4期明顯少于T3期（P＜0.05）。見表 2。
表2
外周血中免疫細胞群的動態變化（n=3，2.1.2 外周血中粒細胞逐漸增多
正常對照組外周血中粒細胞約為所有CD45+炎細胞的16%。隨著胰腺癌進展，粒細胞比例逐漸增多。T1期與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期明顯多于T1期（P＜0.05）；T3期明顯多于T2期（P＜0.05）；T4期明顯多于T3期（P＜0.05）。見表 2。
2.1.3 外周血中樹突細胞、巨噬細胞、NK細胞及NKT細胞先增多后減少
正常對照組外周血中樹突細胞、巨噬細胞及NK細胞比例約為所有CD45+炎細胞的5%～10%，NKT細胞僅為所有CD45+炎細胞的1%～2%。樹突細胞、巨噬細胞、NK細胞及NKT細胞在胰腺癌發展過程中均呈先增多后減少趨勢。①樹突細胞在T1期及T2期與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T1期（P＜0.05）；T4期明顯少于T3期（P＜0.05）。②巨噬細胞在T1期與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。T2期明顯多于正常對照組（P＜0.05）；T3期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T1期（P＜0.05）；T4期明顯少于T3期（P＜0.01）。③NK細胞在T1期與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T1期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期明顯多于正常對照組（P＜0.05）；T3期與T2期差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于正常對照組（P＜0.05）；T4期明顯少于T3期（P＜0.05）。④NKT細胞在T1期與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期明顯多于T1期（P＜0.05）；T3期與T2期、T1期及正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T4期明顯少于T3期及T2期（P＜0.05）。見表 2。
2.2 胰腺癌進展過程中腫瘤組織中免疫細胞群的動態變化趨勢
2.2.1 腫瘤組織中炎細胞總數逐漸增多
隨著胰腺癌進展，腫瘤組織中CD45+炎細胞總數呈逐漸增多趨勢。T1與T2期差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T2期（P＜0.05）；T4期明顯多于T3期（P＜0.05）。見表 3。
表3
腫瘤組織中免疫細胞群動態變化（n=3，2.2.2 腫瘤組織中淋巴細胞逐漸較少
隨著胰腺癌進展，腫瘤組織中T淋巴細胞占所有CD45+炎細胞比例呈減少趨勢。①Th淋巴細胞在T2期明顯少于T1期（P＜0.01）；T3期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯少于T1期（P＜0.01）；T4期與T3期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T4期明顯少于T1期（P＜0.01）。②CTL在T1期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯少于T2期（P＜0.01）；T4期與T3期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T4期與明顯少于T2期（P＜0.01）。④B淋巴細胞在腫瘤組織中的變化趨勢與外周血中不同，B淋巴細胞在腫瘤組織中占所有CD45+炎細胞比例小于10%，且在腫瘤發展過程中無明顯變化（P＞0.05）。見表 3。
2.2.3 腫瘤組織中粒細胞逐漸增多
T1期腫瘤組織中粒細胞約占CD45+炎細胞總數的30%。T4期腫瘤組織中粒細胞約占CD45+炎細胞總數的53%。在腫瘤發展過程中，粒細胞比例呈上升趨勢。T1期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T1期（P＜0.05）；T4期明顯多于T3期（P＜0.05）。見表 3。
2.2.4 腫瘤組織中樹突細胞及巨噬細胞逐漸增多
T1期腫瘤組織中樹突細胞約占所有炎細胞的6%，而巨噬細胞約為10%。隨著腫瘤進展，樹突細胞及巨噬細胞均呈增多趨勢。①樹突細胞在T1期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T1期（P＜0.05）；T4期明顯多于T3期（P＜0.05）。②巨噬細胞在T1期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T1期（P＜0.05）；T4期明顯多于T3期（P＜0.05）。見表 3。
2.2.5 腫瘤組織中NK細胞及NKT細胞先增多后減少
T1期胰腺癌組織中NK細胞及NKT細胞極少。隨著腫瘤進展，NK細胞及NKT細胞均逐漸增多，在T3期達到高峰，而在T4期又驟然減少。①NK細胞在T1期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T2期（P＜0.05）；T4期明顯少于T3期（P＜0.05）。②NKT細胞在T2期明顯多于T1期（P＜0.01）；T3期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T1期（P＜0.01）；T4期明顯少于T3期（P＜0.01）。見表 3。
3 討論
胰腺癌微環境中炎細胞扮演重要角色，故深入研究胰腺癌和免疫細胞群相互作用的動態關系具有重要意義[4]。目前尚缺乏對免疫健全小鼠胰腺癌發展過程中各免疫細胞群動態變化的詳細描述。
本研究利用C57BL6/J小鼠Panc02同源胰腺癌細胞株建立皮下種植瘤模型，詳細描述了各免疫細胞群的動態變化過程，在研究中發現，腫瘤組織中CD45+炎細胞總數與胰腺癌腫瘤負荷呈正向性。但也有文獻[5]報道，小細胞肺癌組織中CD45+炎細胞浸潤與腫瘤的分化級別有關，分化級別越高腫瘤組織中CD45+炎細胞越多，分化級別越低則CD45+炎細胞越少。尚無文獻報道CD45+炎細胞與胰腺癌分化級別的關系，而本研究也僅基于單株胰腺癌細胞系，故其臨床意義有待進一步證實。
腫瘤免疫主要以T淋巴細胞介導的細胞免疫為主，然而腫瘤細胞可以通過分泌如轉化生長因子-β、血管內皮生長因子、白細胞介素-10等細胞因子誘導產生局部及全身的免疫抑制效應，促進粒細胞異常增生，抑制T淋巴細胞的增殖與活化，最終逃過免疫監視，進而生長轉移[6-7]。已有文獻[8-12]報道，外周血粒細胞/淋巴細胞比值與胰腺癌、胃癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤預后相關，比值越高預后越差。本研究結果也發現，隨著胰腺癌進展外周血粒細胞比例逐漸增多，而Th淋巴細胞、CTL以及B淋巴細胞比例均逐漸減少。與外周血變化趨勢一致，隨著胰腺癌進展，腫瘤組織中粒細胞比例逐漸增多，Th淋巴細胞及CTL逐漸減少。但與外周血變化趨勢不同，腫瘤組織中B淋巴細胞占所有CD45+炎細胞比例小于10%，且并不隨腫瘤進展而變化。既往認為，腫瘤細胞缺乏刺激B淋巴細胞產生特異性抗體的能力，故B淋巴細胞在腫瘤免疫中的作用甚微。但近年來有文獻報道，腫瘤組織中浸潤的B淋巴細胞與腫瘤預后相關。Pavoli等[13]發現，腫瘤組織中浸潤的B淋巴細胞可產生針對乳腺癌的特異性抗體。Shi等[14]發現，腫瘤組織邊緣B淋巴細胞與肝癌預后呈正相關。Xu等[15]也發現，鼻咽癌患者外周血中B淋巴細胞比例下降提示預后不佳。本研究發現，隨著胰腺癌進展，外周血B淋巴細胞比例明顯下降，提示外周血B淋巴細胞與胰腺癌腫瘤負荷有一定的相關性。但隨著胰腺癌進展，腫瘤組織中B淋巴細胞比例并未有顯著變化，原因不明，有待進一步深入探討。
樹突細胞作為最重要的抗原呈遞細胞，在腫瘤免疫中發揮重要作用。樹突細胞疫苗可以提高胰腺癌的化療療效[16-17]。本研究發現，在胰腺癌發展中外周血樹突細胞比例增多，但在T4期其比例驟然下降，而在腫瘤組織中樹突細胞持續增多，提示胰腺癌可以刺激樹突細胞增殖以及誘導其向腫瘤組織中趨化。雖然腫瘤組織中樹突細胞持續增多，但我們以前的研究[18]發現，腫瘤組織中樹突細胞在腫瘤細胞的誘導下絕大多數處于無能狀態，并不能有效呈遞腫瘤抗原介導有效的抗腫瘤效應。
固有免疫細胞群增殖活化速度快，通常在腫瘤發生發展早期即可被激活，發揮抗腫瘤效應[19]。本研究結果也發現，在腫瘤發展過程中外周血巨噬細胞、NK細胞及NKT細胞比例迅速增多，但T4期胰腺癌中，由于腫瘤細胞誘導的嚴重的免疫抑制效應，外周血巨噬細胞、NK細胞及NKT細胞比例又迅速減少。與外周血變化一致，腫瘤組織中NK細胞及NKT細胞先反應性升高，后又驟然下降，而巨噬細胞在腫瘤組織中隨胰腺癌進展持續增多。在本研究中T4期胰腺癌組織中巨噬細胞比例甚至超過T淋巴細胞及B淋巴細胞比例總和。T4期外周血巨噬細胞驟然減少，而腫瘤組織中巨噬細胞持續增多，提示腫瘤組織對巨噬細胞具有較強的趨化能力。Deschênes-Simard等[20]也發現，胰腺癌組織中巨噬細胞越多，患者預后越差。近年的研究[21]發現，在腫瘤細胞誘導下巨噬細胞可以由經典的M1型向M2型轉變，促進腫瘤生長及轉移。NK細胞及NKT細胞也均可在腫瘤誘導下向不同的免疫抑制細胞亞群轉化，反而促進腫瘤生長轉移[22-23]。故有必要進一步探索不同免疫表型及功能的免疫細胞抑制亞群的動態變化過程。
綜上，小鼠胰腺癌進展過程中外周血及腫瘤組織中粒細胞持續增多，T淋巴細胞持續減少，外周血B淋巴細胞持續減少，提示胰腺癌誘導產生全身或局部的免疫抑制效應；而腫瘤組織中B淋巴細胞無明顯變化，提示腫瘤誘導的局部免疫抑制效應可能主要通過促進粒細胞增生及抑制T淋巴細胞實現；外周血及腫瘤組織NK及NKT細胞等固有免疫細胞在胰腺癌發展過程中快速增多，提示腫瘤發展早中期可以快速激活固有免疫系統，但由于終末期腫瘤誘發的強烈免疫抑制效應，該些細胞群又驟然減少；外周血樹突細胞及巨噬細胞在胰腺癌發展過程中迅速增多，提示胰腺癌發展早中期可激活抗原呈遞系統，而T4期胰腺癌外周血中樹突細胞及巨噬細胞又驟然減少，而在腫瘤組織中卻持續增多，提示晚期腫瘤在誘發免疫抑制效應時，對外周血中樹突細胞及巨噬細胞均有較強的趨化能力。腫瘤細胞可以誘導產生不同的腫瘤免疫抑制亞群，故進一步分析在胰腺癌發展過程中各免疫細胞抑制亞群表型及功能變化及機制對于更準確預測胰腺癌患者預后和發現新的治療靶點具有重要意義。
胰腺癌惡性程度極高，發病率呈上升趨勢[1]。多種免疫細胞對胰腺癌的發生發展有重要影響[2-3]。在胰腺癌發生發展過程中，外周血及腫瘤組織中免疫細胞群的詳細動態變化趨勢尚不清楚。本研究通過皮下接種C57BL6/J小鼠同源Panc02胰腺癌細胞建立種植瘤模型。根據腫瘤大小將其分為T1～T4期，詳細了解各免疫細胞群的動態變化過程，為更深入研究胰腺癌的免疫調控過程提供一定的新線索。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
成年雄性C57BL6/J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，4～6周齡，體質量25～30 g。小鼠胰腺導管腺癌Panc02細胞株由本實驗室保種傳代。實驗動物飼養于SPF級環境。動物實驗均通過中國醫學科學院北京協和醫院動物倫理委員會審查。
1.2 試劑及抗體
抗小鼠單克隆或多克隆熒光標記抗體見表 1。
表1
實驗所用抗體
Table1.
List of antibodies
1.3 腫瘤模型建立及分期定義
將1×106個Panc02胰腺癌細胞接種于C57BL6/J小鼠腋下。游標卡尺測量并參考公式“腫瘤體積=1/2長徑×短徑×短徑”計算腫瘤體積。當皮下結節小于50 mm3時，很難明確其是腫瘤結節還是由于注射引起的炎性結節，故將腫瘤體積≥50 mm3定義為成瘤。當腫瘤體積≥1 500 mm3時，腫瘤生長緩慢且荷瘤小鼠開始死亡，將其定義為T4期；然后按腫瘤體積大小平均分期：50 mm3≤T1期＜500 mm3、500 mm3≤T2期＜1 000 mm3、1 000 mm3≤T3期＜1 500 mm3。選用4～6周齡C57BL6/J小鼠作為正常對照組。
1.4 流式細胞染色計數
毛細管經內眥取血后，紅細胞裂解液裂解紅細胞。獲取腫瘤組織后，機械研磨聯合胰蛋白酶消化的方法制備單細胞懸液。對組織和細胞行常規流式細胞染色方法染色。利用Accuri C6四通道流式細胞儀（BD，USA）檢測各種免疫細胞群熒光標記表面分子表達，包括炎細胞（CD45+）、粒細胞（CD11b+）、輔助T（Th）淋巴細胞（CD3+CD4+）、細胞毒性T淋巴細胞（CTL，CD3+CD8+）、B淋巴細胞（CD19+）、巨噬細胞（F4/80+）、樹突細胞（CD11c+）、自然殺傷（NK）細胞（NKp46+）及NKT細胞（CD3+NK1.1+）。
1.5 統計學方法
采用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software Inc.）軟件進行統計分析。數據采用均數±標準差（
2 結果
2.1 胰腺癌進展過程中外周血中免疫細胞群的動態變化趨勢
2.1.1 外周血中淋巴細胞逐漸減少
正常對照組外周血中淋巴細胞占所有CD45+炎細胞比例約為80%。①Th淋巴細胞比例呈逐漸減少趨勢。T1期較正常對照組明顯減少（P＜0.05）；T2期與T1期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期較正常對照組明顯減少（P＜0.05）；T3期明顯少于T2期及T1期（P＜0.05）；T4期明顯少于T3期（P＜0.05）。②CTL比例亦呈減少趨勢。T1期與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期與T1期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期明顯少于正常對照組（P＜0.05）；T3期明顯少于T2期及T1期（P＜0.05）；T4期與T3期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T4期明顯低于T2期（P＜0.05）。③B淋巴細胞比例亦呈減少趨勢，T1期與正常對照組差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期比T1期明顯減少（P＜0.05）；T3期明顯少于T2期及T1期（P＜0.05）；T4期明顯少于T3期（P＜0.05）。見表 2。
表2
外周血中免疫細胞群的動態變化（n=3，2.1.2 外周血中粒細胞逐漸增多
正常對照組外周血中粒細胞約為所有CD45+炎細胞的16%。隨著胰腺癌進展，粒細胞比例逐漸增多。T1期與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期明顯多于T1期（P＜0.05）；T3期明顯多于T2期（P＜0.05）；T4期明顯多于T3期（P＜0.05）。見表 2。
2.1.3 外周血中樹突細胞、巨噬細胞、NK細胞及NKT細胞先增多后減少
正常對照組外周血中樹突細胞、巨噬細胞及NK細胞比例約為所有CD45+炎細胞的5%～10%，NKT細胞僅為所有CD45+炎細胞的1%～2%。樹突細胞、巨噬細胞、NK細胞及NKT細胞在胰腺癌發展過程中均呈先增多后減少趨勢。①樹突細胞在T1期及T2期與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T1期（P＜0.05）；T4期明顯少于T3期（P＜0.05）。②巨噬細胞在T1期與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。T2期明顯多于正常對照組（P＜0.05）；T3期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T1期（P＜0.05）；T4期明顯少于T3期（P＜0.01）。③NK細胞在T1期與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T1期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期明顯多于正常對照組（P＜0.05）；T3期與T2期差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于正常對照組（P＜0.05）；T4期明顯少于T3期（P＜0.05）。④NKT細胞在T1期與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T2期明顯多于T1期（P＜0.05）；T3期與T2期、T1期及正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T4期明顯少于T3期及T2期（P＜0.05）。見表 2。
2.2 胰腺癌進展過程中腫瘤組織中免疫細胞群的動態變化趨勢
2.2.1 腫瘤組織中炎細胞總數逐漸增多
隨著胰腺癌進展，腫瘤組織中CD45+炎細胞總數呈逐漸增多趨勢。T1與T2期差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T2期（P＜0.05）；T4期明顯多于T3期（P＜0.05）。見表 3。
表3
腫瘤組織中免疫細胞群動態變化（n=3，2.2.2 腫瘤組織中淋巴細胞逐漸較少
隨著胰腺癌進展，腫瘤組織中T淋巴細胞占所有CD45+炎細胞比例呈減少趨勢。①Th淋巴細胞在T2期明顯少于T1期（P＜0.01）；T3期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯少于T1期（P＜0.01）；T4期與T3期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T4期明顯少于T1期（P＜0.01）。②CTL在T1期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯少于T2期（P＜0.01）；T4期與T3期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T4期與明顯少于T2期（P＜0.01）。④B淋巴細胞在腫瘤組織中的變化趨勢與外周血中不同，B淋巴細胞在腫瘤組織中占所有CD45+炎細胞比例小于10%，且在腫瘤發展過程中無明顯變化（P＞0.05）。見表 3。
2.2.3 腫瘤組織中粒細胞逐漸增多
T1期腫瘤組織中粒細胞約占CD45+炎細胞總數的30%。T4期腫瘤組織中粒細胞約占CD45+炎細胞總數的53%。在腫瘤發展過程中，粒細胞比例呈上升趨勢。T1期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T1期（P＜0.05）；T4期明顯多于T3期（P＜0.05）。見表 3。
2.2.4 腫瘤組織中樹突細胞及巨噬細胞逐漸增多
T1期腫瘤組織中樹突細胞約占所有炎細胞的6%，而巨噬細胞約為10%。隨著腫瘤進展，樹突細胞及巨噬細胞均呈增多趨勢。①樹突細胞在T1期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T1期（P＜0.05）；T4期明顯多于T3期（P＜0.05）。②巨噬細胞在T1期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T1期（P＜0.05）；T4期明顯多于T3期（P＜0.05）。見表 3。
2.2.5 腫瘤組織中NK細胞及NKT細胞先增多后減少
T1期胰腺癌組織中NK細胞及NKT細胞極少。隨著腫瘤進展，NK細胞及NKT細胞均逐漸增多，在T3期達到高峰，而在T4期又驟然減少。①NK細胞在T1期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T2期（P＜0.05）；T4期明顯少于T3期（P＜0.05）。②NKT細胞在T2期明顯多于T1期（P＜0.01）；T3期與T2期比較差異無統計學意義（P＞0.05）；T3期明顯多于T1期（P＜0.01）；T4期明顯少于T3期（P＜0.01）。見表 3。
3 討論
胰腺癌微環境中炎細胞扮演重要角色，故深入研究胰腺癌和免疫細胞群相互作用的動態關系具有重要意義[4]。目前尚缺乏對免疫健全小鼠胰腺癌發展過程中各免疫細胞群動態變化的詳細描述。
本研究利用C57BL6/J小鼠Panc02同源胰腺癌細胞株建立皮下種植瘤模型，詳細描述了各免疫細胞群的動態變化過程，在研究中發現，腫瘤組織中CD45+炎細胞總數與胰腺癌腫瘤負荷呈正向性。但也有文獻[5]報道，小細胞肺癌組織中CD45+炎細胞浸潤與腫瘤的分化級別有關，分化級別越高腫瘤組織中CD45+炎細胞越多，分化級別越低則CD45+炎細胞越少。尚無文獻報道CD45+炎細胞與胰腺癌分化級別的關系，而本研究也僅基于單株胰腺癌細胞系，故其臨床意義有待進一步證實。
腫瘤免疫主要以T淋巴細胞介導的細胞免疫為主，然而腫瘤細胞可以通過分泌如轉化生長因子-β、血管內皮生長因子、白細胞介素-10等細胞因子誘導產生局部及全身的免疫抑制效應，促進粒細胞異常增生，抑制T淋巴細胞的增殖與活化，最終逃過免疫監視，進而生長轉移[6-7]。已有文獻[8-12]報道，外周血粒細胞/淋巴細胞比值與胰腺癌、胃癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤預后相關，比值越高預后越差。本研究結果也發現，隨著胰腺癌進展外周血粒細胞比例逐漸增多，而Th淋巴細胞、CTL以及B淋巴細胞比例均逐漸減少。與外周血變化趨勢一致，隨著胰腺癌進展，腫瘤組織中粒細胞比例逐漸增多，Th淋巴細胞及CTL逐漸減少。但與外周血變化趨勢不同，腫瘤組織中B淋巴細胞占所有CD45+炎細胞比例小于10%，且并不隨腫瘤進展而變化。既往認為，腫瘤細胞缺乏刺激B淋巴細胞產生特異性抗體的能力，故B淋巴細胞在腫瘤免疫中的作用甚微。但近年來有文獻報道，腫瘤組織中浸潤的B淋巴細胞與腫瘤預后相關。Pavoli等[13]發現，腫瘤組織中浸潤的B淋巴細胞可產生針對乳腺癌的特異性抗體。Shi等[14]發現，腫瘤組織邊緣B淋巴細胞與肝癌預后呈正相關。Xu等[15]也發現，鼻咽癌患者外周血中B淋巴細胞比例下降提示預后不佳。本研究發現，隨著胰腺癌進展，外周血B淋巴細胞比例明顯下降，提示外周血B淋巴細胞與胰腺癌腫瘤負荷有一定的相關性。但隨著胰腺癌進展，腫瘤組織中B淋巴細胞比例并未有顯著變化，原因不明，有待進一步深入探討。
樹突細胞作為最重要的抗原呈遞細胞，在腫瘤免疫中發揮重要作用。樹突細胞疫苗可以提高胰腺癌的化療療效[16-17]。本研究發現，在胰腺癌發展中外周血樹突細胞比例增多，但在T4期其比例驟然下降，而在腫瘤組織中樹突細胞持續增多，提示胰腺癌可以刺激樹突細胞增殖以及誘導其向腫瘤組織中趨化。雖然腫瘤組織中樹突細胞持續增多，但我們以前的研究[18]發現，腫瘤組織中樹突細胞在腫瘤細胞的誘導下絕大多數處于無能狀態，并不能有效呈遞腫瘤抗原介導有效的抗腫瘤效應。
固有免疫細胞群增殖活化速度快，通常在腫瘤發生發展早期即可被激活，發揮抗腫瘤效應[19]。本研究結果也發現，在腫瘤發展過程中外周血巨噬細胞、NK細胞及NKT細胞比例迅速增多，但T4期胰腺癌中，由于腫瘤細胞誘導的嚴重的免疫抑制效應，外周血巨噬細胞、NK細胞及NKT細胞比例又迅速減少。與外周血變化一致，腫瘤組織中NK細胞及NKT細胞先反應性升高，后又驟然下降，而巨噬細胞在腫瘤組織中隨胰腺癌進展持續增多。在本研究中T4期胰腺癌組織中巨噬細胞比例甚至超過T淋巴細胞及B淋巴細胞比例總和。T4期外周血巨噬細胞驟然減少，而腫瘤組織中巨噬細胞持續增多，提示腫瘤組織對巨噬細胞具有較強的趨化能力。Deschênes-Simard等[20]也發現，胰腺癌組織中巨噬細胞越多，患者預后越差。近年的研究[21]發現，在腫瘤細胞誘導下巨噬細胞可以由經典的M1型向M2型轉變，促進腫瘤生長及轉移。NK細胞及NKT細胞也均可在腫瘤誘導下向不同的免疫抑制細胞亞群轉化，反而促進腫瘤生長轉移[22-23]。故有必要進一步探索不同免疫表型及功能的免疫細胞抑制亞群的動態變化過程。
綜上，小鼠胰腺癌進展過程中外周血及腫瘤組織中粒細胞持續增多，T淋巴細胞持續減少，外周血B淋巴細胞持續減少，提示胰腺癌誘導產生全身或局部的免疫抑制效應；而腫瘤組織中B淋巴細胞無明顯變化，提示腫瘤誘導的局部免疫抑制效應可能主要通過促進粒細胞增生及抑制T淋巴細胞實現；外周血及腫瘤組織NK及NKT細胞等固有免疫細胞在胰腺癌發展過程中快速增多，提示腫瘤發展早中期可以快速激活固有免疫系統，但由于終末期腫瘤誘發的強烈免疫抑制效應，該些細胞群又驟然減少；外周血樹突細胞及巨噬細胞在胰腺癌發展過程中迅速增多，提示胰腺癌發展早中期可激活抗原呈遞系統，而T4期胰腺癌外周血中樹突細胞及巨噬細胞又驟然減少，而在腫瘤組織中卻持續增多，提示晚期腫瘤在誘發免疫抑制效應時，對外周血中樹突細胞及巨噬細胞均有較強的趨化能力。腫瘤細胞可以誘導產生不同的腫瘤免疫抑制亞群，故進一步分析在胰腺癌發展過程中各免疫細胞抑制亞群表型及功能變化及機制對于更準確預測胰腺癌患者預后和發現新的治療靶點具有重要意義。
