引用本文： 蔣志偉, 汪濤, 湯禮軍, 陳光宇, 黎鵬武, 鄭曉博, 王科. 緊密連接蛋白1與重癥急性胰腺炎大鼠胰腺微血管損傷關系的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(9): 1114-1119. doi: 10.7507/1007-9424.20140267 復制
重癥急性胰腺炎（sever acute pancreatitis，SAP）
病程進展迅速，病情兇險，病死率高達20%～30% [1]，被稱為“20世紀尚未攻克的醫學堡壘”。有研究?[2-3]證實，導致SAP死亡率居高不下的主要原因為一些高發生率的“致死并發癥”，而在這些并發癥的發生發展過程中，血管通透性的改變都扮演著十分重要的角色。有研究[4]指出，毛細血管滲漏綜合征（capillary leak syndrome，CLS）可能在SAP的病程發展中起決定性的作用，并與SAP互為因果。對于SAP的病理學過程，業已有了較為統一的認識，即胰腺發生局部病變后，大量炎癥因子及毒素進入體循環，形成級聯瀑布反應，并發全身多臟器的功能不全和衰竭。CLS發生的初始病理狀態即為細胞旁途徑的病理性開放，此為水、離子及大分子物質的“大門”。毛細血管屏障一般由機械屏障、化學屏障、免疫屏障等構成，與毛細血管滲透性關系最密切的為機械屏障，其由血管內皮細胞本身及緊密連接復合體組成。而構成緊密連接的眾多蛋白中，緊密連接蛋白1（ZO-1蛋白）因其與其他成員蛋白的關系密切，因此在緊密連接中的地位也較重要。研究?[5]發現，ZO-1蛋白的破壞能較直接地影響緊密連接的屏障功能。歸結起來就是，CLS的病理重點在于血管內皮細胞緊密連接的損傷，緊密連接損傷蛋白水平的重點在于ZO-1蛋白的異常表達。因此，本研究檢測了SAP大鼠胰腺微血管中ZO-1蛋白的表達及血液中ZO-1蛋白的濃度情況，并探討了其與SAP病程發展的聯系。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要試劑與設備
選用健康雄性SPF級Wistar大鼠54只?（購自四川省資陽市達碩動物公司），體質量?200～250 g，6～8周齡，進行環境適應性喂養1周后，再進行實驗。試劑：牛磺膽酸鈉（Sigma公司），大鼠血清淀粉酶試劑盒（泛博生物公司），胰蛋白酶測定試劑盒（建成生物公司），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-8（IL-8）及ZO-1蛋白的ELISA試劑盒（BD公司），ZO-1蛋白抗體（小鼠抗大鼠ZO-1蛋白及羊抗小鼠IgG，博士德生物公司）。設備：全自動生化分析儀（美國Beckman公司）、Bioreal550型酶標儀（美國Thermo公司）及BIO-TEK全自動酶標儀（美國Thermo公司）。
1.2 動物分組與模型制備
將48只大鼠按隨機數字表法隨機分為假手術組（SO）和SAP組，每組24只；另6只大鼠作為死亡大鼠的補充。實驗前12 h禁食、不禁水。①SO組：腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后（SAP組同），行開腹手術，翻動胰腺后關腹。②SAP組：參照Aho等[6]的方法，開腹后以動脈夾夾閉肝門部膽管，經十二指腸乳頭逆行行胰膽管穿刺，用靜脈微量輸液泵以3 mL/h的速度注射5%牛磺膽酸鈉（1 mL/kg），再用動脈夾夾閉近十二指腸端的胰膽管10 min。肉眼見胰腺組織發生充血、水腫、出血、壞死等改變后，表明大鼠SAP模型制備成功，關腹。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平檢測
2組大鼠均分別于手術后6、12及24 h隨機（隨機數字表法）處死8只大鼠，采集腹主動脈血3～4 mL，以離心機離心（3 000 r/min，r=8 cm，10 min），取上層清夜置于-20℃冰箱中凍存，以待檢測。分別采用全自動生化分析儀及酶標儀檢測血液中血清淀粉酶及胰蛋白酶水平；采用ELISA法檢測血液中IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平。操作均按試劑盒說明書進行。
1.3.2 HE染色
取胰腺組織1 g以4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，5μm厚切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察胰腺組織的病理學改變，并進行病理學評分，病理學評分參照Schmidt等[7]的方法。
1.3.3 ZO-1蛋白的免疫組化染色
取胰腺組織1 g進行SP免疫組化染色。首先將組織以4%甲醛液固定，脫水，石蠟包埋，5μm厚連續切片。切片經常規脫蠟至水，以胃蛋白酶消化后滴加相應的小鼠抗大鼠ZO-1蛋白，4℃冰箱過夜；滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠IgG，室溫孵育2 h；以二氨基聯苯胺（DAB）顯色10 min后，用中性樹膠封片。以正常Wistar大鼠胰腺組織行免疫組化染色后的切片為陽性對照，以未行免疫組化染色的切片為陰性對照。目標蛋白ZO-1蛋白為棕黃色顆粒，觀察各時相胰腺組織棕黃色顆粒的表達情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件進行數據的統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 2組大鼠手術后的一般情況
SAP組大鼠造模成功后出現精神萎靡、活動量減少、食欲差及尿量少，且隨時間延長，上述癥狀逐漸加重；而各時點SO組大鼠的一般情況與術前無明顯差異。術后SO組大鼠均未出現死亡，而SAP組大鼠因腸道出血、壞死、大量胸腹水、重度腹腔感染等因素死亡（于造模后7、12、16及19 h分別死亡1、1、2及2只），6只死亡大鼠均予以重新造模補充。
2.2 血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平檢測結果
與同時點SO組比較，各時點SAP組的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平均較高（P＜0.05）。SO組內各時點間的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平的差異均無統計學意義（P＞0.05），而SAP組內除3個時點組的TNF-α水平比較差異無統計學意義之外（P＞0.05），3個時點組的其余指標均不全相同（P＜0.05）。①血清淀粉酶：SAP-6 h組和12 h組的血清淀粉酶水平均低于24 h組（P＜0.05），而6 h組和12 h組的差異無統計學意義（P＞0.05）；②胰蛋白酶、IL-8和ZO-1蛋白：SAP組內大鼠的胰蛋白酶、IL-8和ZO-1蛋白水平均隨時點的延長逐漸升高，各時點兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表 1。
表1
2組大鼠各時點的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α、ZO-1蛋白水平及胰腺組織的病理學評分結果（n=8，2.3 血清ZO-1蛋白水平與其他指標的關系
多重線性回歸模型結果顯示，SAP組血清ZO-1蛋白水平與胰腺組織病理學評分（b=0.96，P＜0.05）、血清淀粉酶水平（b=0.87，P＜0.05）、胰蛋白酶水平（b=0.72，P＜0.05）及IL-8水平（b=0.69，P＜0.05）均呈正相關，而與TNF-α水平的關系無統計學意義（P＞0.05）。
2.4 處死大鼠的胰腺大體觀察結果
各時點SO組大鼠的胰腺大體無異常。SAP組大鼠在注射5%牛磺膽酸鈉后，見沿胰管走行方向的周圍胰腺組織出現輕度充血水腫；造模6 h后胰腺整體見明顯的充血水腫，伴少量血性腹水；12 h時見胰腺出血壞死，胰周出現皂化斑，伴血性腹水；24 h時胰腺壞死明顯，胰腺組織變薄，網膜見大量皂化斑，腹水量達6～10 mL（平均7.84 mL）。
2.5 胰腺組織的病理學改變
HE染色結果顯示，各時點SO組大鼠的胰腺組織無明顯異常。SAP-6 h組大鼠的胰腺組織水腫明顯，出現點狀出血，并有散在壞死灶及少量中性粒細胞浸潤；12 h組見腺泡小葉結構破壞，伴實質出血；24 h組除實質出血外，還存在胰腺組織片狀壞死，且有大量中性粒細胞和單核細胞浸潤（圖 1）。同時點與SO組比較，SAP各時點組大鼠的胰腺組織病理學評分均較高（P＜0.05）。SO組各時點間的胰腺組織病理學評分的差異無統計學意義（P＞0.05）；SAP-12 h組和24 h組的病理學評分均高于6 h組（P＜0.05），而12 h組和24 h組的差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1。
圖1
示各時點2組大鼠胰腺組織的HE染色結果（HE×200）。1A：SO-6 h組；1B：SO-12 h組；1C：SO-24 h組；1D：SAP-6 h組；1E：SAP-12 h組；1F：SAP-24 h組圖 2 ?示2組大鼠胰腺組織的免疫組化染色結果。2A：SO-6 h組（SP×200）；2B：SO-12 h組（SP×200）；2C：SO-24 h組（SP×400）；2D：SAP-6 h組（SP×200）；2E：SAP-12 h組（SP×200）；2F：SAP-24 h組（SP×400）
Figure1.
HE staining results of pancreatic tissues in rats of 2 groups at different time points (HE×200). 1A:SO-6 hours group; 1B:SO-12 hours group; 1C: SO-24 hours group; 1D:SAP-6 hours group; 1E: SAP-12 hours group; 1F: SAP-24 hours group Figure 2 ?The immunohistochemical staining results of pancreatic tissues in rats of 2 groups. 2A: SO-6 hours group (SP×200); 2B: SO-12 hours group (SP×200); 2C: SO-24 hours group (SP×400); 2D:SAP-6 hours group (SP×200); 2E: SAP-12 hours group (SP×200); 2F:SAP-24 hours group(SP×400)
2.6 胰腺組織ZO-1蛋白的免疫組化染色結果
2組大鼠的免疫組化染色結果顯示，目標蛋白ZO-1蛋白為棕黃色顆粒。各時點SO組見胰腺腺泡細胞間及毛細血管壁有棕黃色ZO-1蛋白染色顆粒表達，且在毛細血管中的表達呈連續性。SAP-6 h組毛細血管壁及胰腺腺泡細胞間棕黃色顆粒表達不連續，較SO組表達顆粒明顯減少；12 h時見胰腺腺泡細胞間及毛細血管壁的棕黃色顆粒表達數量較6 h時明顯少，且在毛細血管中的表達為間斷表達；24 h時胰腺腺泡細胞間及毛細血管壁只見少量散在的棕黃色顆粒（圖 2）。
3 討論
ZO蛋白是組成緊密連接的結構蛋白，其細胞外部分跨膜4次而形成2個環狀結構，與相鄰細胞的外環連接，封閉細胞間隙；而胞質內的蛋白端則與細胞骨架蛋白相連，使其緊密連接固定在細胞膜上并保持延續性[8]。SAP時大量血管內液體、小分子蛋白等透過各屏障迅速滲漏到組織等第三間隙，多數會產生病理相關性腹水[9]，并出現由進行性全身性水腫、低蛋白血癥、血壓及中心靜脈壓降低、血液濃縮、急性腎缺血等臨床表現構成的一組綜合征，嚴重時可發生多器官功能衰竭。如臨床上SAP患者中急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的發生率約為60% [10]；腎功能損害的發生率僅次于肺功能損傷，為14%～43% [11]；腹腔間隔室綜合征（ACS）的發病率約為40% [12-14]等。在SAP的病理狀態下，炎癥細胞因子大量釋放，胰酶的易位、過度激活等因素成為了SAP時并發CLS的重要原因，提示SAP與CLS有著密不可分的關聯。
經過多年的臨床實踐發現，血清淀粉酶的活性高低與SAP的病情嚴重程度沒有一定的相關性，但其升高的幅度越大，診斷胰腺炎的可能性也越大，因此，目前還是將血清淀粉酶作為胰腺炎診斷的首選指標。本實驗發現，SAP組造模6 h后其血清胰蛋白酶、IL-8及ZO-1蛋白水平均隨時間延長逐漸升高，并出現腹水；同時血清ZO-1蛋白水平與血清淀粉酶、IL-8等胰腺炎血清學經典指標以及胰腺組織病理學評分均呈正相關，提示ZO-1蛋白的變化出現在SAP的早期，并貫穿于SAP的病程發展過程中。ZO-1蛋白分布于細胞間緊密連接及毛細血管內皮細胞上，對于ZO-1蛋白表達缺乏的小鼠的研究[15]充分證明了其在緊密連接中的重要地位；也有研究[16]證實，TNF-α能通過激活上皮細胞間的肌球蛋白輕鏈激酶，調整ZO-1蛋白在細胞膜上的分布。另有實驗[17]發現，單純將胰蛋白酶注入大鼠循環系統后，能破壞毛細血管中的ZO-1蛋白，使其從緊密連接處脫落入血或進入周圍組織液，改變血管的滲透功能，可導致與大鼠SAP時極為相似的血管及周圍組織的病理學改變。本實驗結果顯示，隨著時間的推移，SAP組大鼠血清中ZO-1蛋白的濃度與胰蛋白酶水平同步逐漸上升，與上述研究結果相近；同時免疫組化染色結果顯示，隨時間推移，SAP組胰腺組織及周圍毛細血管中ZO-1蛋白的表達逐漸下調，甚至幾乎不表達，考慮系TNF-α與胰蛋白酶共同作用的結果。
SAP時的血管損傷是SAP病程發展的重要環節之一，臨床上對毛細血管屏障功能的保護也成了研究治療SAP及改善其預后的一個熱點。ZO-1蛋白作為其中的重要一環，其影響因素并未完全探明，本實驗在前人的基礎上進一步探索其臨床治療的理論基礎，為SAP的治療提出了ZO-1蛋白這一可能的關鍵靶點，希望找到疾病治療的新方向。
重癥急性胰腺炎（sever acute pancreatitis，SAP）
病程進展迅速，病情兇險，病死率高達20%～30% [1]，被稱為“20世紀尚未攻克的醫學堡壘”。有研究?[2-3]證實，導致SAP死亡率居高不下的主要原因為一些高發生率的“致死并發癥”，而在這些并發癥的發生發展過程中，血管通透性的改變都扮演著十分重要的角色。有研究[4]指出，毛細血管滲漏綜合征（capillary leak syndrome，CLS）可能在SAP的病程發展中起決定性的作用，并與SAP互為因果。對于SAP的病理學過程，業已有了較為統一的認識，即胰腺發生局部病變后，大量炎癥因子及毒素進入體循環，形成級聯瀑布反應，并發全身多臟器的功能不全和衰竭。CLS發生的初始病理狀態即為細胞旁途徑的病理性開放，此為水、離子及大分子物質的“大門”。毛細血管屏障一般由機械屏障、化學屏障、免疫屏障等構成，與毛細血管滲透性關系最密切的為機械屏障，其由血管內皮細胞本身及緊密連接復合體組成。而構成緊密連接的眾多蛋白中，緊密連接蛋白1（ZO-1蛋白）因其與其他成員蛋白的關系密切，因此在緊密連接中的地位也較重要。研究?[5]發現，ZO-1蛋白的破壞能較直接地影響緊密連接的屏障功能。歸結起來就是，CLS的病理重點在于血管內皮細胞緊密連接的損傷，緊密連接損傷蛋白水平的重點在于ZO-1蛋白的異常表達。因此，本研究檢測了SAP大鼠胰腺微血管中ZO-1蛋白的表達及血液中ZO-1蛋白的濃度情況，并探討了其與SAP病程發展的聯系。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要試劑與設備
選用健康雄性SPF級Wistar大鼠54只?（購自四川省資陽市達碩動物公司），體質量?200～250 g，6～8周齡，進行環境適應性喂養1周后，再進行實驗。試劑：牛磺膽酸鈉（Sigma公司），大鼠血清淀粉酶試劑盒（泛博生物公司），胰蛋白酶測定試劑盒（建成生物公司），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-8（IL-8）及ZO-1蛋白的ELISA試劑盒（BD公司），ZO-1蛋白抗體（小鼠抗大鼠ZO-1蛋白及羊抗小鼠IgG，博士德生物公司）。設備：全自動生化分析儀（美國Beckman公司）、Bioreal550型酶標儀（美國Thermo公司）及BIO-TEK全自動酶標儀（美國Thermo公司）。
1.2 動物分組與模型制備
將48只大鼠按隨機數字表法隨機分為假手術組（SO）和SAP組，每組24只；另6只大鼠作為死亡大鼠的補充。實驗前12 h禁食、不禁水。①SO組：腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后（SAP組同），行開腹手術，翻動胰腺后關腹。②SAP組：參照Aho等[6]的方法，開腹后以動脈夾夾閉肝門部膽管，經十二指腸乳頭逆行行胰膽管穿刺，用靜脈微量輸液泵以3 mL/h的速度注射5%牛磺膽酸鈉（1 mL/kg），再用動脈夾夾閉近十二指腸端的胰膽管10 min。肉眼見胰腺組織發生充血、水腫、出血、壞死等改變后，表明大鼠SAP模型制備成功，關腹。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平檢測
2組大鼠均分別于手術后6、12及24 h隨機（隨機數字表法）處死8只大鼠，采集腹主動脈血3～4 mL，以離心機離心（3 000 r/min，r=8 cm，10 min），取上層清夜置于-20℃冰箱中凍存，以待檢測。分別采用全自動生化分析儀及酶標儀檢測血液中血清淀粉酶及胰蛋白酶水平；采用ELISA法檢測血液中IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平。操作均按試劑盒說明書進行。
1.3.2 HE染色
取胰腺組織1 g以4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，5μm厚切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察胰腺組織的病理學改變，并進行病理學評分，病理學評分參照Schmidt等[7]的方法。
1.3.3 ZO-1蛋白的免疫組化染色
取胰腺組織1 g進行SP免疫組化染色。首先將組織以4%甲醛液固定，脫水，石蠟包埋，5μm厚連續切片。切片經常規脫蠟至水，以胃蛋白酶消化后滴加相應的小鼠抗大鼠ZO-1蛋白，4℃冰箱過夜；滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠IgG，室溫孵育2 h；以二氨基聯苯胺（DAB）顯色10 min后，用中性樹膠封片。以正常Wistar大鼠胰腺組織行免疫組化染色后的切片為陽性對照，以未行免疫組化染色的切片為陰性對照。目標蛋白ZO-1蛋白為棕黃色顆粒，觀察各時相胰腺組織棕黃色顆粒的表達情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件進行數據的統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 2組大鼠手術后的一般情況
SAP組大鼠造模成功后出現精神萎靡、活動量減少、食欲差及尿量少，且隨時間延長，上述癥狀逐漸加重；而各時點SO組大鼠的一般情況與術前無明顯差異。術后SO組大鼠均未出現死亡，而SAP組大鼠因腸道出血、壞死、大量胸腹水、重度腹腔感染等因素死亡（于造模后7、12、16及19 h分別死亡1、1、2及2只），6只死亡大鼠均予以重新造模補充。
2.2 血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平檢測結果
與同時點SO組比較，各時點SAP組的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平均較高（P＜0.05）。SO組內各時點間的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平的差異均無統計學意義（P＞0.05），而SAP組內除3個時點組的TNF-α水平比較差異無統計學意義之外（P＞0.05），3個時點組的其余指標均不全相同（P＜0.05）。①血清淀粉酶：SAP-6 h組和12 h組的血清淀粉酶水平均低于24 h組（P＜0.05），而6 h組和12 h組的差異無統計學意義（P＞0.05）；②胰蛋白酶、IL-8和ZO-1蛋白：SAP組內大鼠的胰蛋白酶、IL-8和ZO-1蛋白水平均隨時點的延長逐漸升高，各時點兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表 1。
表1
2組大鼠各時點的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α、ZO-1蛋白水平及胰腺組織的病理學評分結果（n=8，2.3 血清ZO-1蛋白水平與其他指標的關系
多重線性回歸模型結果顯示，SAP組血清ZO-1蛋白水平與胰腺組織病理學評分（b=0.96，P＜0.05）、血清淀粉酶水平（b=0.87，P＜0.05）、胰蛋白酶水平（b=0.72，P＜0.05）及IL-8水平（b=0.69，P＜0.05）均呈正相關，而與TNF-α水平的關系無統計學意義（P＞0.05）。
2.4 處死大鼠的胰腺大體觀察結果
各時點SO組大鼠的胰腺大體無異常。SAP組大鼠在注射5%牛磺膽酸鈉后，見沿胰管走行方向的周圍胰腺組織出現輕度充血水腫；造模6 h后胰腺整體見明顯的充血水腫，伴少量血性腹水；12 h時見胰腺出血壞死，胰周出現皂化斑，伴血性腹水；24 h時胰腺壞死明顯，胰腺組織變薄，網膜見大量皂化斑，腹水量達6～10 mL（平均7.84 mL）。
2.5 胰腺組織的病理學改變
HE染色結果顯示，各時點SO組大鼠的胰腺組織無明顯異常。SAP-6 h組大鼠的胰腺組織水腫明顯，出現點狀出血，并有散在壞死灶及少量中性粒細胞浸潤；12 h組見腺泡小葉結構破壞，伴實質出血；24 h組除實質出血外，還存在胰腺組織片狀壞死，且有大量中性粒細胞和單核細胞浸潤（圖 1）。同時點與SO組比較，SAP各時點組大鼠的胰腺組織病理學評分均較高（P＜0.05）。SO組各時點間的胰腺組織病理學評分的差異無統計學意義（P＞0.05）；SAP-12 h組和24 h組的病理學評分均高于6 h組（P＜0.05），而12 h組和24 h組的差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1。
圖1
示各時點2組大鼠胰腺組織的HE染色結果（HE×200）。1A：SO-6 h組；1B：SO-12 h組；1C：SO-24 h組；1D：SAP-6 h組；1E：SAP-12 h組；1F：SAP-24 h組圖 2 ?示2組大鼠胰腺組織的免疫組化染色結果。2A：SO-6 h組（SP×200）；2B：SO-12 h組（SP×200）；2C：SO-24 h組（SP×400）；2D：SAP-6 h組（SP×200）；2E：SAP-12 h組（SP×200）；2F：SAP-24 h組（SP×400）
Figure1.
HE staining results of pancreatic tissues in rats of 2 groups at different time points (HE×200). 1A:SO-6 hours group; 1B:SO-12 hours group; 1C: SO-24 hours group; 1D:SAP-6 hours group; 1E: SAP-12 hours group; 1F: SAP-24 hours group Figure 2 ?The immunohistochemical staining results of pancreatic tissues in rats of 2 groups. 2A: SO-6 hours group (SP×200); 2B: SO-12 hours group (SP×200); 2C: SO-24 hours group (SP×400); 2D:SAP-6 hours group (SP×200); 2E: SAP-12 hours group (SP×200); 2F:SAP-24 hours group(SP×400)
2.6 胰腺組織ZO-1蛋白的免疫組化染色結果
2組大鼠的免疫組化染色結果顯示，目標蛋白ZO-1蛋白為棕黃色顆粒。各時點SO組見胰腺腺泡細胞間及毛細血管壁有棕黃色ZO-1蛋白染色顆粒表達，且在毛細血管中的表達呈連續性。SAP-6 h組毛細血管壁及胰腺腺泡細胞間棕黃色顆粒表達不連續，較SO組表達顆粒明顯減少；12 h時見胰腺腺泡細胞間及毛細血管壁的棕黃色顆粒表達數量較6 h時明顯少，且在毛細血管中的表達為間斷表達；24 h時胰腺腺泡細胞間及毛細血管壁只見少量散在的棕黃色顆粒（圖 2）。
3 討論
ZO蛋白是組成緊密連接的結構蛋白，其細胞外部分跨膜4次而形成2個環狀結構，與相鄰細胞的外環連接，封閉細胞間隙；而胞質內的蛋白端則與細胞骨架蛋白相連，使其緊密連接固定在細胞膜上并保持延續性[8]。SAP時大量血管內液體、小分子蛋白等透過各屏障迅速滲漏到組織等第三間隙，多數會產生病理相關性腹水[9]，并出現由進行性全身性水腫、低蛋白血癥、血壓及中心靜脈壓降低、血液濃縮、急性腎缺血等臨床表現構成的一組綜合征，嚴重時可發生多器官功能衰竭。如臨床上SAP患者中急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的發生率約為60% [10]；腎功能損害的發生率僅次于肺功能損傷，為14%～43% [11]；腹腔間隔室綜合征（ACS）的發病率約為40% [12-14]等。在SAP的病理狀態下，炎癥細胞因子大量釋放，胰酶的易位、過度激活等因素成為了SAP時并發CLS的重要原因，提示SAP與CLS有著密不可分的關聯。
經過多年的臨床實踐發現，血清淀粉酶的活性高低與SAP的病情嚴重程度沒有一定的相關性，但其升高的幅度越大，診斷胰腺炎的可能性也越大，因此，目前還是將血清淀粉酶作為胰腺炎診斷的首選指標。本實驗發現，SAP組造模6 h后其血清胰蛋白酶、IL-8及ZO-1蛋白水平均隨時間延長逐漸升高，并出現腹水；同時血清ZO-1蛋白水平與血清淀粉酶、IL-8等胰腺炎血清學經典指標以及胰腺組織病理學評分均呈正相關，提示ZO-1蛋白的變化出現在SAP的早期，并貫穿于SAP的病程發展過程中。ZO-1蛋白分布于細胞間緊密連接及毛細血管內皮細胞上，對于ZO-1蛋白表達缺乏的小鼠的研究[15]充分證明了其在緊密連接中的重要地位；也有研究[16]證實，TNF-α能通過激活上皮細胞間的肌球蛋白輕鏈激酶，調整ZO-1蛋白在細胞膜上的分布。另有實驗[17]發現，單純將胰蛋白酶注入大鼠循環系統后，能破壞毛細血管中的ZO-1蛋白，使其從緊密連接處脫落入血或進入周圍組織液，改變血管的滲透功能，可導致與大鼠SAP時極為相似的血管及周圍組織的病理學改變。本實驗結果顯示，隨著時間的推移，SAP組大鼠血清中ZO-1蛋白的濃度與胰蛋白酶水平同步逐漸上升，與上述研究結果相近；同時免疫組化染色結果顯示，隨時間推移，SAP組胰腺組織及周圍毛細血管中ZO-1蛋白的表達逐漸下調，甚至幾乎不表達，考慮系TNF-α與胰蛋白酶共同作用的結果。
SAP時的血管損傷是SAP病程發展的重要環節之一，臨床上對毛細血管屏障功能的保護也成了研究治療SAP及改善其預后的一個熱點。ZO-1蛋白作為其中的重要一環，其影響因素并未完全探明，本實驗在前人的基礎上進一步探索其臨床治療的理論基礎，為SAP的治療提出了ZO-1蛋白這一可能的關鍵靶點，希望找到疾病治療的新方向。
