引用本文： 平波. 甲狀腺結節的細胞學檢查. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(9): 1070-1075. doi: 10.7507/1007-9424.20140259 復制
普通人群中通過觸診和高分辨率超聲檢查發現的甲狀腺結節的比例分別為3%～7%和20%～76%[1]，而甲狀腺結節中甲狀腺癌卻僅占5%～15%[2]。因此，外科手術雖為甲狀腺癌的主要治療方式，卻不能對所有甲狀腺結節均不加篩選地予以手術處理。作為一種安全、可靠且性價比高的非手術診斷方法，在多個不同國家和地區制定的甲狀腺腫瘤診治指南中，甲狀腺細針穿刺（fine needle aspiration，FNA）已被列為篩選出需手術或其他激進治療的甲狀腺結節的有效手段[2-5]。隨著甲狀腺腫瘤診治的逐步規范化，甲狀腺FNA在我國也日益受到臨床、影像及病理科醫師的重視。然而，因相關專業人員數量不足及經驗欠缺，尤其在穿刺操作和診斷方面，甲狀腺FNA的開展有待進一步普及。筆者現對甲狀腺細胞學檢查的臨床價值、標準化報告系統的使用和相關輔助檢查予以介紹。
1 甲狀腺結節細胞學檢查的價值
2012年我國發布的《甲狀腺結節和分化型甲狀腺癌診治指南》（以下簡稱“中國指南”）[1]指出：“術前甲狀腺FNA檢查有助于減少不必要的甲狀腺結節手術，并幫助確定恰當的手術方案”，這是甲狀腺結節細胞學檢查的最大價值所在。由于操作安全簡便、經濟且具有相當的準確性，甲狀腺FNA是目前用于篩選甲狀腺結節是否需要手術治療的最好的檢查方法。2010年版《美國臨床內分泌醫師協會、意大利臨床內分泌協會和歐洲甲狀腺學會甲狀腺結節診斷和處理臨床指南》[4]回顧性分析了既往文獻，總結甲狀腺FNA檢查的靈敏度、特異度、陽性預測值、假陰性率和假陽性率分別為65%～98%、72%～100%、50%～96%、1%～11%及0～7%。多年來，大量證據[4, 6-8]表明，通過FNA篩選可有效減少診斷性甲狀腺手術的數量，提高手術病例中甲狀腺癌的比例，其增幅可達14%～50%，從而避免不必要的手術及手術傷害，并降低醫療費用。
與金標準（組織病理學檢查）相比，甲狀腺細胞學檢查因觀察組織結構困難，在準確性方面的固有缺陷主要涉及對濾泡性腫瘤（follicular neoplasm，FN）的診斷與鑒別診斷。FN包括濾泡性癌（含Hürthle細胞癌）和濾泡性腺瘤（含Hürthle細胞腺瘤），兩者在組織病理學上的區別僅在于前者存在腫瘤細胞對包膜和（或）血管的侵犯，而此類組織學結構范疇的線索并不能經由細胞學涂片發現，故細胞學檢查對FN不作良惡性區分。因此，對細胞學診斷為FN或可疑濾泡性腫瘤（suspicious of foll-icular neoplasm，SFN）的病例，歐美地區指南[2, 4, 9]一般建議對病變部位行手術切除，多數為甲狀腺腺葉切除或單側甲狀腺切除，亦有全甲狀腺切除，但需結合臨床情況及患者意愿。然而，這并不影響FNA對甲狀腺結節進行術前篩選的價值，因FN是否存在包膜和（或）血管侵犯需待病變完整切除后經石蠟切片檢查才可確定，而術中冰凍切片（frozen sectioning，FS）檢查同樣難以完成FN的良惡性鑒別，故對術前FNA診斷為FN或SFN的病例，不推薦行術中FS，明確診斷待術后的石蠟切片確定[4, 10-12]。另一方面，對于約占分化型甲狀腺癌85%的甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC），FS并不會改變因術前FNA診斷為PTC或疑為PTC而決定的手術方式[10, 12]。對于甲狀腺髓樣癌（medullary
thyroid carcinoma，MTC）的診斷，FS甚至并不優于術前FNA[10, 13]。Antic等[10]報道，對術后石蠟切片確診為MTC的病例，術前FNA診斷為MTC和疑為MTC者分別占64.3%和27.3%，而FS診斷為MTC和疑為MTC者分別占53.3%和6.7%。對于惡性程度高的甲狀腺低分化癌、未分化癌以及淋巴造血系統腫瘤，FS同樣不具優勢，即使可診斷為惡性，也并不能準確區分腫瘤類型[10, 13]。而FNA則可通過免疫組化檢查、流式細胞免疫表型分析等輔助檢查先期明確診斷方向，按需進一步選擇是否手術或行空芯針活檢（core needle biopsy，CNB）以獲得組織病理學結果，從而避免不必要的診斷性手術。有文獻[11-12]曾比較了同組患者術前FNA和術中FS的結果，總體而言兩者的診斷準確性相當。因此，術前FNA確可有效替代術中FS，以幫助判斷是否手術以及確立手術方案。雖然FS仍可用于術前FNA診斷不滿意或不確定的患者，或用于包膜界限不清的病例[4]，但其更大的用途則為術中識別轉移性淋巴結、甲狀旁腺、易位胸腺等組織[10]。由于甲狀腺FNA在我國開展得較少，且濾泡性癌被FS錯漏的現象因其發病率低而易被忽視，目前我國臨床醫生仍較多采用術中FS來指導手術方式，并有觀點[14-15]認為，FS更符合我國國情。然而，隨著甲狀腺腫瘤診治規范化的推進，甲狀腺FNA替代術中FS已漸成趨勢。雖然2012年版中國指南[1]尚未對術中FS的價值予以闡述，各科各級醫生也應了解術中FS同樣不能鑒別濾泡性癌和濾泡性腺瘤，其診斷必須依賴對FN完整切除標本進行有無包膜和血管侵犯的評價。
近年來，超聲引導下的甲狀腺CNB作為一種非手術方式的組織病理學檢查，也在部分醫院開展。該項檢查具有一定的技術安全性、患者耐受性、標本滿意度和診斷準確性[16-17]，但操作成本價格高且報告時間長。然而，由于獲取腫塊不完整、獲取組織過小且易發生機械損傷，對于FN，CNB同樣難以判斷包膜的完整性及有無血管侵犯。雖然CNB尚可用于PTC和非濾泡上皮來源的其他惡性腫瘤的診斷，但總體上并無明顯證據表明其價值優于FNA [17]。對于FNA判為標本不滿意的病例，CNB或可有所幫助，有報道[16, 18]表明，其標本滿意度高于再次進行FNA。此外，如前所述，CNB可用于甲狀腺淋巴造血系統腫瘤組織學標本的獲取。因此，目前在術前篩選甲狀腺結節方面，CNB并不能替代FNA，但CNB可有選擇地應用于反復行FNA而標本仍不滿意或診斷仍不明確的病例[4]，并可用于不能手術或者不宜手術但需要組織學檢查結果的情況。
2 甲狀腺細胞病理學Bethesda報告系統（The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology，TBSRTC）解讀
鑒于FNA對甲狀腺結節術前篩選的重要影響，甲狀腺細胞學診斷術語及報告結果除應含義清晰、簡明易懂外，更應能體現與臨床處理的密切相關性[19]。因此，近年來制定的多種甲狀腺細胞學診斷分類或報告系統的共同要點為細胞學診斷均為描述性，而非數字等級式報告，需盡可能給出診斷，并對每一診斷類別都提出相應的臨床處理意見，以利于臨床按不同診斷類別進行統一規范的操作。各甲狀腺細胞學診斷分類或報告系統的主要差異是診斷分類達4～6類不等，除均包括“標本無法診斷或不滿意”、“良性”及“惡性”3個類別外，其余診斷或集中歸為單一的“不確定（indeterminate）”診斷類別，或進一步分作2～3類，后者更多被新近的診斷分類或報告系統所采納[2-4, 9, 20-21]。其中美國2009年出版的《甲狀腺細胞病理學Bethesda報告系統：定義、標準和注釋》[9]極具代表性，2010年我國出版了該書的譯本[22]。TBSRTC源自2007年美國國立癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）的馬里蘭州Bethesda甲狀腺FNA專題會議，采用6個診斷分類（表 1 [22]），并規定每一分類的定義、細胞形態標準、惡性風險、推薦的臨床處理等[9]。以下筆者將按各診斷類別解讀其中要點，側重介紹普遍原則、難點及爭議焦點。
表1
TBSRTC：惡性風險程度和推薦的臨床處理
2.1 標本無法診斷或不滿意
正確診斷的前提為獲取滿意的標本。除標本保存、制片及染色不當導致無法診斷外，甲狀腺FNA標本無法診斷的另一個重要原因為標本內濾泡細胞數量過少。TBSRTC提出的細胞數量滿意標準為涂片內至少含6個適宜觀察（即涂片染色良好、細胞形態不扭曲變形且無遮蓋）的濾泡細胞團，每團至少含10個細胞，且最好分布于單張涂片中[9]。然而，并非所有濾泡細胞過少的標本皆不可診斷。濾泡細胞過少的原因一方面受穿刺操作的影響，即穿刺未及目標或出血過多等導致涂片內細胞過少而無法診斷，對此類情況，病理或臨床醫生應注意切勿報告或理解為“未見腫瘤證據”。另一方面，甲狀腺結節本身性質使其穿刺內容物并不含有足量濾泡細胞。例如囊性病變，包括良性的膠質結節和惡性的PTC囊性變，如僅見囊液，建議結合囊腫大小和超聲檢查有無可疑發現考慮隨訪、重復穿刺或手術等進一步處理方式。各類甲狀腺炎癥形成的結節穿刺后也可能僅含大量炎癥細胞而導致濾泡細胞數量過少，此時標本并非不可診斷，而屬于后文所提及的“良性病變”。更為重要的是，一旦出現異型細胞，無論濾泡細胞數量和質量如何，皆屬可診斷標本。本診斷分類占甲狀腺FNA結果的2%～21%不等[23]，雖較難評價，但仍有文獻[24]報道，其總體惡性風險可達1%～4%，尤其是穿刺僅獲得囊液的病例其惡性風險更高，接近其上限4%。對首次穿刺報告為“標本無法診斷或不滿意”者，TBSRTC建議再行穿刺，間隔時間不應短于3個月，以防反應性或修復性改變導致的假陽性結果[9]。再行穿刺最好于超聲引導下進行，尤其是對實性結節；囊性結節應在有可疑超聲發現時再行超聲引導下穿刺。如連續兩次報告為“標本無法診斷或不滿意”，應參考臨床發現選擇超聲檢查以密切隨訪或手術[21]。
2.2 良性病變
該類別主要包括良性濾泡性結節和各類甲狀腺炎，甲狀腺炎中以橋本甲狀腺炎最為常見。良性濾泡性結節主要指結節性甲狀腺腫、增生性/腺瘤樣結節、膠質結節、Grave病中的結節等非腫瘤性病變，但濾泡性腺瘤的大濾泡亞型因形態特殊而與上述病變有重疊，也可能被歸入該診斷分類[9]。事實上，FNA無法區分這些病變的具體組織學類型，少數情況下甚至需與腫瘤鑒別，但作為術前篩選工具，將這些病變診斷為“良性”一般不至造成對患者的不良影響，TBSRTC中總結此類的惡性風險為0～3%[9]。然而惡性風險的評價存在難點，僅約10%的患者最終接受手術，故根據術后病理診斷進行準確性評價存在偏倚，假陰性率為1%～10%，而依據5～10年長期隨訪結果所得的假陰性率則降至＜1%[21]。雖然絕大多數診斷為良性病變的患者無需手術，但臨床處理仍推薦為定期隨訪，包括觸診和超聲檢查，間隔為每6～18個月1次，持續3～5年，如超聲檢查有異常發現則復查FNA[9]。
2.3 FN/SFN
細胞學檢查在FN診斷和鑒別診斷方面的固有缺陷雖不影響FNA作為甲狀腺結節術前篩選的重要工具，但卻造成甲狀腺細胞學診斷的一個灰區。由于不能明確區別良惡性或冠以確切的組織學診斷名稱，濾泡性癌、濾泡性腺瘤及其疑似病變的細胞學診斷術語曾經稱謂眾多，從側重形態特征的“富于濾泡的病變”和“微濾泡增生/病變”，到含義不甚確切的“不典型性濾泡性病變”、“不確定病變”等。診斷術語不統一不僅影響臨床醫生對報告結果的判斷，不利于臨床與病理界的溝通，甚至影響病理醫生對相互報告的理解，最終導致臨床處理的困惑。故TBSRTC中將FN（含Hürthle細胞腫瘤）及其疑似病變統一歸類為“FN/SFN”，即原則上濾泡性腺瘤不列入“良性”診斷類別，濾泡性癌不屬于“惡性”及“SM”的診斷類別，并推薦臨床處理為病變部位的手術切除，大多為甲狀腺腺葉切除術/單側甲狀腺切除術，按組織學結果進一步決定治療措施[21]。FN/SFN的共同細胞學形態特征為濾泡細胞排列明顯擁擠和（或）形成微濾泡結構；此外，如果涂片內細胞全部或幾乎為Hürthle細胞，則要說明為FN/SFN（Hürthle細胞型）。因為兩者雖在TBSRTC中歸為同一診斷類別，但確實存在形態和分子遺傳學改變上的一定差異[9]。另一方面，增生性/腺瘤樣結節、乳頭狀癌的濾泡和嗜酸細胞亞型、甲狀旁腺腺瘤、Hürthle細胞增生（可見于橋本甲狀腺炎、結節性甲狀腺腫等）等均可能因出現相似的細胞學特征而被列入該診斷類別。據術后診斷資料[21]證實，該診斷類別的腫瘤風險為65%～85%，惡性風險為15%～30%，而PTC則占據了診斷為FN/SFN的惡性腫瘤的27%～68%。因此，需了解該分類制定的目的為篩選出可能是“濾泡性癌”的病變，并予以診斷性手術切除，而非明確診斷“FN”。
2.4 SM
如具有惡性腫瘤的部分特征，懷疑存在惡性腫瘤，但又不足以明確診斷，可歸入SM這一診斷類別，并盡可能注明所懷疑的腫瘤類型，例如疑PTC、疑MTC、疑惡性淋巴瘤、疑惡性腫瘤非特殊類型等。需注意本類別不包括疑似濾泡性腫瘤或Hürthle細胞腫瘤。另外，即使病變形態與FN/SFN有重疊，如PTC濾泡亞型或嗜酸細胞亞型，一旦發現疑似PTC的特征，應診斷為SM。本類別的惡性風險高達60%～75%[21]，臨床處理按所懷疑的惡性腫瘤類型而定。如為疑PTC，則已構成手術指征；如為疑MTC，可結合血清降鈣素水平檢測進一步明確診斷；如可獲取額外的細胞學標本，對于疑MTC及其他SM，尚可行免疫組化檢查、流式細胞免疫表型分析、分子遺傳學檢測等輔助確診。
2.5 惡性腫瘤
若細胞形態學特征明確為惡性，則歸入本診斷類別，并盡可能注明腫瘤類型，必要時加行免疫組化檢查、流式細胞免疫表型分析、分子遺傳學檢測等輔助檢查。本類別的惡性風險高達97%～99%[21]，病種包括PTC、MTC、淋巴瘤、原發性甲狀腺未分化癌/鱗癌/低分化癌、轉移性惡性腫瘤等，同樣不包括濾泡性癌。臨床處理按所診斷的惡性腫瘤類型而定。需注意，對細胞學診斷的分化差的癌，尤其是具有未分化癌/鱗癌形態者，一般通過細胞形態學和免疫組化檢查無法區分原發性或轉移性，故應首先結合臨床和影像學檢查除外甲狀腺外可能的原發病灶后，再考慮甲狀腺原發惡性腫瘤。
2.6 AUS/FLUS
所謂AUS/FLUS的定義為：標本內細胞（濾泡細胞、淋巴樣細胞或其他細胞）具有一定的結構和（或）核非典型性，既不足以診斷為“FN/SFN”、“SM”或“惡性腫瘤”，也不能肯定明確為“良性”[22]。除細胞學形態特征不明確外，部分病例受取材（細胞過少或血液覆蓋）或制片欠佳等的影響，也可令診斷不明而歸入此類。因而，AUS/FLUS實為排除性診斷[25]。該診斷類別相當于英國甲狀腺協會和皇家病理醫師學院制定的2009年版《甲狀腺細胞學標本報告指南》[26]中的“Thy3a”亞類，并被2009年的《美國甲狀腺協會甲狀腺結節和分化型甲狀腺癌患者處理指南修改版》[2]所引用。然而，在得到認可的同時，AUS/FLUS也成為TBSRTC提出后極具爭議的類別[25, 27-28]。一方面，AUS/FLUS類別中的病變組成實際上非常多樣，導致診斷標準更難把握，診斷可重復性相對較差[29-30]，因而診斷率（占FNA各類診斷中的比例）波動較大，文獻[31]報道從0.8%～27.2%不等，往往高于TBSRTC最初建議的7%的診斷率上限[9]。另一方面，TBSRTC推測AUS/FLUS為惡性風險較低的診斷類別，如依據手術病理及隨訪結果，總體惡性風險為5%～15%；僅依據手術后組織病理學結果則惡性風險可達20%～25%[9]，因而推薦的臨床處理為：初次診斷為AUS/FLUS者建議結合臨床，多數患者需間隔適當時間后重復穿刺，如仍為AUS/FLUS，或是臨床和超聲檢查發現異常應考慮手術切除。但是根據近期文獻[28, 32]匯總，AUS/FLUS的惡性風險變化較大，頻繁高于預計，依據手術病理學檢查結果，其惡性風險可達6%～81%，因而初次診斷為AUS/FLUS后采用保守重復穿刺的處理是否得當具有爭議。因此，鑒于AUS/FLUS病變組成的多樣性，已有眾多研究[28, 33-34]著眼于如何將AUS/FLUS病例進一步分流為惡性風險不同的類別，并予以不同的臨床處理。分流標準主要根據形態學差異，并已有分子檢測和臨床特征方面的分流嘗試[28, 33-34]。
3 甲狀腺分化型癌相關蛋白及分子遺傳學標志物在細胞學檢查中的用途
甲狀腺FNA的價值雖已被公認為篩選需要手術的甲狀腺結節，并幫助確定手術范圍，然而這兩方面的應用均存在局限性，希望通過輔以甲狀腺分化型癌相關蛋白及分子標志物檢測而得到改進。首先，對于細胞學診斷不確定的類別，通常指AUS/FLUS、FN/SFN和SM三類，期待通過輔助檢查進一步篩選出其中真正需要手術的惡性腫瘤。另一方面，僅憑細胞形態學檢查難以在術前判斷甲狀腺分化型癌的預后差異，如何篩選出少數易復發和（或）進展的高危病例，而予以全/近全甲狀腺切除及淋巴結清掃術，目前有賴于對臨床、影像學檢查、包括家族史在內的病史等的綜合判斷。細胞學輔助檢查有望成為另一類預后判斷的有效工具。
甲狀腺分化型癌相關蛋白標志物檢測可利用穿刺細胞塊的石蠟切片及細胞學涂片開展，其主要目的為輔助鑒別濾泡上皮來源病變的良惡性。其優勢為可結合細胞形態判斷且價格低廉，缺陷為易受免疫標志物檢測技術穩定性和結果判斷主觀性的不利影響[35]。常用的標志物包括galectin-3、CK19、CD44、HBME-1等[36-38]。常用于鑒別濾泡上皮來源病變良惡性的分子遺傳學標志物主要包括BRAF基因突變、Ras基因突變、PAX8/PPARγ重排以及RET/PTC重排。Nikiforov等[39]曾對1 056例細胞學診斷不確定的病例聯合進行上述分子遺傳學標志物檢測，并分為具有任一分子遺傳學改變和無任何遺傳學改變2組，結果前者的惡性風險達89%，后者僅為11%；除Ras突變可見于濾泡性腺瘤外，其余分子遺傳學標志物的特異度均達100%；然而，上述分子遺傳學標志物的靈敏度均欠佳，聯合檢測在AUS/FLUS、FN/SFN和SM組中的靈敏度僅分別為63%、57%和68%。
有望用于甲狀腺癌預后判斷的分子標志物包括Ras、PIK3CA、PTEN、P53、ALK、BRAF等基因的突變，其中對BRAF突變作為預后因子的研究較深入[35]。研究[35, 40]顯示，BRAF突變在復發性PTC中的陽性率達78%～95%，且與較低的放射性碘親和性相關，術前甲狀腺FNA標本BRAF突變陽性可預測淋巴結轉移、甲狀腺外侵犯和進展期疾病，從而輔助患者治療方案的決策。
綜上所述，甲狀腺結節細胞學檢查的重要價值在于篩選需手術治療的病例，減少不必要的診斷性手術，并幫助確定手術方案。細胞學對于甲狀腺FN及其疑似病變的診斷缺陷并不影響其篩查價值。使用標準化的甲狀腺細胞學診斷報告系統，有利于診斷術語的統一，以便臨床對病理報告的準確理解，并促進甲狀腺結節臨床處理的規范化。術前聯合細胞形態學、免疫組化檢查及分子標志物檢測將有利于提高細胞學檢查的準確性，并輔助判斷患者的預后。
普通人群中通過觸診和高分辨率超聲檢查發現的甲狀腺結節的比例分別為3%～7%和20%～76%[1]，而甲狀腺結節中甲狀腺癌卻僅占5%～15%[2]。因此，外科手術雖為甲狀腺癌的主要治療方式，卻不能對所有甲狀腺結節均不加篩選地予以手術處理。作為一種安全、可靠且性價比高的非手術診斷方法，在多個不同國家和地區制定的甲狀腺腫瘤診治指南中，甲狀腺細針穿刺（fine needle aspiration，FNA）已被列為篩選出需手術或其他激進治療的甲狀腺結節的有效手段[2-5]。隨著甲狀腺腫瘤診治的逐步規范化，甲狀腺FNA在我國也日益受到臨床、影像及病理科醫師的重視。然而，因相關專業人員數量不足及經驗欠缺，尤其在穿刺操作和診斷方面，甲狀腺FNA的開展有待進一步普及。筆者現對甲狀腺細胞學檢查的臨床價值、標準化報告系統的使用和相關輔助檢查予以介紹。
1 甲狀腺結節細胞學檢查的價值
2012年我國發布的《甲狀腺結節和分化型甲狀腺癌診治指南》（以下簡稱“中國指南”）[1]指出：“術前甲狀腺FNA檢查有助于減少不必要的甲狀腺結節手術，并幫助確定恰當的手術方案”，這是甲狀腺結節細胞學檢查的最大價值所在。由于操作安全簡便、經濟且具有相當的準確性，甲狀腺FNA是目前用于篩選甲狀腺結節是否需要手術治療的最好的檢查方法。2010年版《美國臨床內分泌醫師協會、意大利臨床內分泌協會和歐洲甲狀腺學會甲狀腺結節診斷和處理臨床指南》[4]回顧性分析了既往文獻，總結甲狀腺FNA檢查的靈敏度、特異度、陽性預測值、假陰性率和假陽性率分別為65%～98%、72%～100%、50%～96%、1%～11%及0～7%。多年來，大量證據[4, 6-8]表明，通過FNA篩選可有效減少診斷性甲狀腺手術的數量，提高手術病例中甲狀腺癌的比例，其增幅可達14%～50%，從而避免不必要的手術及手術傷害，并降低醫療費用。
與金標準（組織病理學檢查）相比，甲狀腺細胞學檢查因觀察組織結構困難，在準確性方面的固有缺陷主要涉及對濾泡性腫瘤（follicular neoplasm，FN）的診斷與鑒別診斷。FN包括濾泡性癌（含Hürthle細胞癌）和濾泡性腺瘤（含Hürthle細胞腺瘤），兩者在組織病理學上的區別僅在于前者存在腫瘤細胞對包膜和（或）血管的侵犯，而此類組織學結構范疇的線索并不能經由細胞學涂片發現，故細胞學檢查對FN不作良惡性區分。因此，對細胞學診斷為FN或可疑濾泡性腫瘤（suspicious of foll-icular neoplasm，SFN）的病例，歐美地區指南[2, 4, 9]一般建議對病變部位行手術切除，多數為甲狀腺腺葉切除或單側甲狀腺切除，亦有全甲狀腺切除，但需結合臨床情況及患者意愿。然而，這并不影響FNA對甲狀腺結節進行術前篩選的價值，因FN是否存在包膜和（或）血管侵犯需待病變完整切除后經石蠟切片檢查才可確定，而術中冰凍切片（frozen sectioning，FS）檢查同樣難以完成FN的良惡性鑒別，故對術前FNA診斷為FN或SFN的病例，不推薦行術中FS，明確診斷待術后的石蠟切片確定[4, 10-12]。另一方面，對于約占分化型甲狀腺癌85%的甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC），FS并不會改變因術前FNA診斷為PTC或疑為PTC而決定的手術方式[10, 12]。對于甲狀腺髓樣癌（medullary
thyroid carcinoma，MTC）的診斷，FS甚至并不優于術前FNA[10, 13]。Antic等[10]報道，對術后石蠟切片確診為MTC的病例，術前FNA診斷為MTC和疑為MTC者分別占64.3%和27.3%，而FS診斷為MTC和疑為MTC者分別占53.3%和6.7%。對于惡性程度高的甲狀腺低分化癌、未分化癌以及淋巴造血系統腫瘤，FS同樣不具優勢，即使可診斷為惡性，也并不能準確區分腫瘤類型[10, 13]。而FNA則可通過免疫組化檢查、流式細胞免疫表型分析等輔助檢查先期明確診斷方向，按需進一步選擇是否手術或行空芯針活檢（core needle biopsy，CNB）以獲得組織病理學結果，從而避免不必要的診斷性手術。有文獻[11-12]曾比較了同組患者術前FNA和術中FS的結果，總體而言兩者的診斷準確性相當。因此，術前FNA確可有效替代術中FS，以幫助判斷是否手術以及確立手術方案。雖然FS仍可用于術前FNA診斷不滿意或不確定的患者，或用于包膜界限不清的病例[4]，但其更大的用途則為術中識別轉移性淋巴結、甲狀旁腺、易位胸腺等組織[10]。由于甲狀腺FNA在我國開展得較少，且濾泡性癌被FS錯漏的現象因其發病率低而易被忽視，目前我國臨床醫生仍較多采用術中FS來指導手術方式，并有觀點[14-15]認為，FS更符合我國國情。然而，隨著甲狀腺腫瘤診治規范化的推進，甲狀腺FNA替代術中FS已漸成趨勢。雖然2012年版中國指南[1]尚未對術中FS的價值予以闡述，各科各級醫生也應了解術中FS同樣不能鑒別濾泡性癌和濾泡性腺瘤，其診斷必須依賴對FN完整切除標本進行有無包膜和血管侵犯的評價。
近年來，超聲引導下的甲狀腺CNB作為一種非手術方式的組織病理學檢查，也在部分醫院開展。該項檢查具有一定的技術安全性、患者耐受性、標本滿意度和診斷準確性[16-17]，但操作成本價格高且報告時間長。然而，由于獲取腫塊不完整、獲取組織過小且易發生機械損傷，對于FN，CNB同樣難以判斷包膜的完整性及有無血管侵犯。雖然CNB尚可用于PTC和非濾泡上皮來源的其他惡性腫瘤的診斷，但總體上并無明顯證據表明其價值優于FNA [17]。對于FNA判為標本不滿意的病例，CNB或可有所幫助，有報道[16, 18]表明，其標本滿意度高于再次進行FNA。此外，如前所述，CNB可用于甲狀腺淋巴造血系統腫瘤組織學標本的獲取。因此，目前在術前篩選甲狀腺結節方面，CNB并不能替代FNA，但CNB可有選擇地應用于反復行FNA而標本仍不滿意或診斷仍不明確的病例[4]，并可用于不能手術或者不宜手術但需要組織學檢查結果的情況。
2 甲狀腺細胞病理學Bethesda報告系統（The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology，TBSRTC）解讀
鑒于FNA對甲狀腺結節術前篩選的重要影響，甲狀腺細胞學診斷術語及報告結果除應含義清晰、簡明易懂外，更應能體現與臨床處理的密切相關性[19]。因此，近年來制定的多種甲狀腺細胞學診斷分類或報告系統的共同要點為細胞學診斷均為描述性，而非數字等級式報告，需盡可能給出診斷，并對每一診斷類別都提出相應的臨床處理意見，以利于臨床按不同診斷類別進行統一規范的操作。各甲狀腺細胞學診斷分類或報告系統的主要差異是診斷分類達4～6類不等，除均包括“標本無法診斷或不滿意”、“良性”及“惡性”3個類別外，其余診斷或集中歸為單一的“不確定（indeterminate）”診斷類別，或進一步分作2～3類，后者更多被新近的診斷分類或報告系統所采納[2-4, 9, 20-21]。其中美國2009年出版的《甲狀腺細胞病理學Bethesda報告系統：定義、標準和注釋》[9]極具代表性，2010年我國出版了該書的譯本[22]。TBSRTC源自2007年美國國立癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）的馬里蘭州Bethesda甲狀腺FNA專題會議，采用6個診斷分類（表 1 [22]），并規定每一分類的定義、細胞形態標準、惡性風險、推薦的臨床處理等[9]。以下筆者將按各診斷類別解讀其中要點，側重介紹普遍原則、難點及爭議焦點。
表1
TBSRTC：惡性風險程度和推薦的臨床處理
2.1 標本無法診斷或不滿意
正確診斷的前提為獲取滿意的標本。除標本保存、制片及染色不當導致無法診斷外，甲狀腺FNA標本無法診斷的另一個重要原因為標本內濾泡細胞數量過少。TBSRTC提出的細胞數量滿意標準為涂片內至少含6個適宜觀察（即涂片染色良好、細胞形態不扭曲變形且無遮蓋）的濾泡細胞團，每團至少含10個細胞，且最好分布于單張涂片中[9]。然而，并非所有濾泡細胞過少的標本皆不可診斷。濾泡細胞過少的原因一方面受穿刺操作的影響，即穿刺未及目標或出血過多等導致涂片內細胞過少而無法診斷，對此類情況，病理或臨床醫生應注意切勿報告或理解為“未見腫瘤證據”。另一方面，甲狀腺結節本身性質使其穿刺內容物并不含有足量濾泡細胞。例如囊性病變，包括良性的膠質結節和惡性的PTC囊性變，如僅見囊液，建議結合囊腫大小和超聲檢查有無可疑發現考慮隨訪、重復穿刺或手術等進一步處理方式。各類甲狀腺炎癥形成的結節穿刺后也可能僅含大量炎癥細胞而導致濾泡細胞數量過少，此時標本并非不可診斷，而屬于后文所提及的“良性病變”。更為重要的是，一旦出現異型細胞，無論濾泡細胞數量和質量如何，皆屬可診斷標本。本診斷分類占甲狀腺FNA結果的2%～21%不等[23]，雖較難評價，但仍有文獻[24]報道，其總體惡性風險可達1%～4%，尤其是穿刺僅獲得囊液的病例其惡性風險更高，接近其上限4%。對首次穿刺報告為“標本無法診斷或不滿意”者，TBSRTC建議再行穿刺，間隔時間不應短于3個月，以防反應性或修復性改變導致的假陽性結果[9]。再行穿刺最好于超聲引導下進行，尤其是對實性結節；囊性結節應在有可疑超聲發現時再行超聲引導下穿刺。如連續兩次報告為“標本無法診斷或不滿意”，應參考臨床發現選擇超聲檢查以密切隨訪或手術[21]。
2.2 良性病變
該類別主要包括良性濾泡性結節和各類甲狀腺炎，甲狀腺炎中以橋本甲狀腺炎最為常見。良性濾泡性結節主要指結節性甲狀腺腫、增生性/腺瘤樣結節、膠質結節、Grave病中的結節等非腫瘤性病變，但濾泡性腺瘤的大濾泡亞型因形態特殊而與上述病變有重疊，也可能被歸入該診斷分類[9]。事實上，FNA無法區分這些病變的具體組織學類型，少數情況下甚至需與腫瘤鑒別，但作為術前篩選工具，將這些病變診斷為“良性”一般不至造成對患者的不良影響，TBSRTC中總結此類的惡性風險為0～3%[9]。然而惡性風險的評價存在難點，僅約10%的患者最終接受手術，故根據術后病理診斷進行準確性評價存在偏倚，假陰性率為1%～10%，而依據5～10年長期隨訪結果所得的假陰性率則降至＜1%[21]。雖然絕大多數診斷為良性病變的患者無需手術，但臨床處理仍推薦為定期隨訪，包括觸診和超聲檢查，間隔為每6～18個月1次，持續3～5年，如超聲檢查有異常發現則復查FNA[9]。
2.3 FN/SFN
細胞學檢查在FN診斷和鑒別診斷方面的固有缺陷雖不影響FNA作為甲狀腺結節術前篩選的重要工具，但卻造成甲狀腺細胞學診斷的一個灰區。由于不能明確區別良惡性或冠以確切的組織學診斷名稱，濾泡性癌、濾泡性腺瘤及其疑似病變的細胞學診斷術語曾經稱謂眾多，從側重形態特征的“富于濾泡的病變”和“微濾泡增生/病變”，到含義不甚確切的“不典型性濾泡性病變”、“不確定病變”等。診斷術語不統一不僅影響臨床醫生對報告結果的判斷，不利于臨床與病理界的溝通，甚至影響病理醫生對相互報告的理解，最終導致臨床處理的困惑。故TBSRTC中將FN（含Hürthle細胞腫瘤）及其疑似病變統一歸類為“FN/SFN”，即原則上濾泡性腺瘤不列入“良性”診斷類別，濾泡性癌不屬于“惡性”及“SM”的診斷類別，并推薦臨床處理為病變部位的手術切除，大多為甲狀腺腺葉切除術/單側甲狀腺切除術，按組織學結果進一步決定治療措施[21]。FN/SFN的共同細胞學形態特征為濾泡細胞排列明顯擁擠和（或）形成微濾泡結構；此外，如果涂片內細胞全部或幾乎為Hürthle細胞，則要說明為FN/SFN（Hürthle細胞型）。因為兩者雖在TBSRTC中歸為同一診斷類別，但確實存在形態和分子遺傳學改變上的一定差異[9]。另一方面，增生性/腺瘤樣結節、乳頭狀癌的濾泡和嗜酸細胞亞型、甲狀旁腺腺瘤、Hürthle細胞增生（可見于橋本甲狀腺炎、結節性甲狀腺腫等）等均可能因出現相似的細胞學特征而被列入該診斷類別。據術后診斷資料[21]證實，該診斷類別的腫瘤風險為65%～85%，惡性風險為15%～30%，而PTC則占據了診斷為FN/SFN的惡性腫瘤的27%～68%。因此，需了解該分類制定的目的為篩選出可能是“濾泡性癌”的病變，并予以診斷性手術切除，而非明確診斷“FN”。
2.4 SM
如具有惡性腫瘤的部分特征，懷疑存在惡性腫瘤，但又不足以明確診斷，可歸入SM這一診斷類別，并盡可能注明所懷疑的腫瘤類型，例如疑PTC、疑MTC、疑惡性淋巴瘤、疑惡性腫瘤非特殊類型等。需注意本類別不包括疑似濾泡性腫瘤或Hürthle細胞腫瘤。另外，即使病變形態與FN/SFN有重疊，如PTC濾泡亞型或嗜酸細胞亞型，一旦發現疑似PTC的特征，應診斷為SM。本類別的惡性風險高達60%～75%[21]，臨床處理按所懷疑的惡性腫瘤類型而定。如為疑PTC，則已構成手術指征；如為疑MTC，可結合血清降鈣素水平檢測進一步明確診斷；如可獲取額外的細胞學標本，對于疑MTC及其他SM，尚可行免疫組化檢查、流式細胞免疫表型分析、分子遺傳學檢測等輔助確診。
2.5 惡性腫瘤
若細胞形態學特征明確為惡性，則歸入本診斷類別，并盡可能注明腫瘤類型，必要時加行免疫組化檢查、流式細胞免疫表型分析、分子遺傳學檢測等輔助檢查。本類別的惡性風險高達97%～99%[21]，病種包括PTC、MTC、淋巴瘤、原發性甲狀腺未分化癌/鱗癌/低分化癌、轉移性惡性腫瘤等，同樣不包括濾泡性癌。臨床處理按所診斷的惡性腫瘤類型而定。需注意，對細胞學診斷的分化差的癌，尤其是具有未分化癌/鱗癌形態者，一般通過細胞形態學和免疫組化檢查無法區分原發性或轉移性，故應首先結合臨床和影像學檢查除外甲狀腺外可能的原發病灶后，再考慮甲狀腺原發惡性腫瘤。
2.6 AUS/FLUS
所謂AUS/FLUS的定義為：標本內細胞（濾泡細胞、淋巴樣細胞或其他細胞）具有一定的結構和（或）核非典型性，既不足以診斷為“FN/SFN”、“SM”或“惡性腫瘤”，也不能肯定明確為“良性”[22]。除細胞學形態特征不明確外，部分病例受取材（細胞過少或血液覆蓋）或制片欠佳等的影響，也可令診斷不明而歸入此類。因而，AUS/FLUS實為排除性診斷[25]。該診斷類別相當于英國甲狀腺協會和皇家病理醫師學院制定的2009年版《甲狀腺細胞學標本報告指南》[26]中的“Thy3a”亞類，并被2009年的《美國甲狀腺協會甲狀腺結節和分化型甲狀腺癌患者處理指南修改版》[2]所引用。然而，在得到認可的同時，AUS/FLUS也成為TBSRTC提出后極具爭議的類別[25, 27-28]。一方面，AUS/FLUS類別中的病變組成實際上非常多樣，導致診斷標準更難把握，診斷可重復性相對較差[29-30]，因而診斷率（占FNA各類診斷中的比例）波動較大，文獻[31]報道從0.8%～27.2%不等，往往高于TBSRTC最初建議的7%的診斷率上限[9]。另一方面，TBSRTC推測AUS/FLUS為惡性風險較低的診斷類別，如依據手術病理及隨訪結果，總體惡性風險為5%～15%；僅依據手術后組織病理學結果則惡性風險可達20%～25%[9]，因而推薦的臨床處理為：初次診斷為AUS/FLUS者建議結合臨床，多數患者需間隔適當時間后重復穿刺，如仍為AUS/FLUS，或是臨床和超聲檢查發現異常應考慮手術切除。但是根據近期文獻[28, 32]匯總，AUS/FLUS的惡性風險變化較大，頻繁高于預計，依據手術病理學檢查結果，其惡性風險可達6%～81%，因而初次診斷為AUS/FLUS后采用保守重復穿刺的處理是否得當具有爭議。因此，鑒于AUS/FLUS病變組成的多樣性，已有眾多研究[28, 33-34]著眼于如何將AUS/FLUS病例進一步分流為惡性風險不同的類別，并予以不同的臨床處理。分流標準主要根據形態學差異，并已有分子檢測和臨床特征方面的分流嘗試[28, 33-34]。
3 甲狀腺分化型癌相關蛋白及分子遺傳學標志物在細胞學檢查中的用途
甲狀腺FNA的價值雖已被公認為篩選需要手術的甲狀腺結節，并幫助確定手術范圍，然而這兩方面的應用均存在局限性，希望通過輔以甲狀腺分化型癌相關蛋白及分子標志物檢測而得到改進。首先，對于細胞學診斷不確定的類別，通常指AUS/FLUS、FN/SFN和SM三類，期待通過輔助檢查進一步篩選出其中真正需要手術的惡性腫瘤。另一方面，僅憑細胞形態學檢查難以在術前判斷甲狀腺分化型癌的預后差異，如何篩選出少數易復發和（或）進展的高危病例，而予以全/近全甲狀腺切除及淋巴結清掃術，目前有賴于對臨床、影像學檢查、包括家族史在內的病史等的綜合判斷。細胞學輔助檢查有望成為另一類預后判斷的有效工具。
甲狀腺分化型癌相關蛋白標志物檢測可利用穿刺細胞塊的石蠟切片及細胞學涂片開展，其主要目的為輔助鑒別濾泡上皮來源病變的良惡性。其優勢為可結合細胞形態判斷且價格低廉，缺陷為易受免疫標志物檢測技術穩定性和結果判斷主觀性的不利影響[35]。常用的標志物包括galectin-3、CK19、CD44、HBME-1等[36-38]。常用于鑒別濾泡上皮來源病變良惡性的分子遺傳學標志物主要包括BRAF基因突變、Ras基因突變、PAX8/PPARγ重排以及RET/PTC重排。Nikiforov等[39]曾對1 056例細胞學診斷不確定的病例聯合進行上述分子遺傳學標志物檢測，并分為具有任一分子遺傳學改變和無任何遺傳學改變2組，結果前者的惡性風險達89%，后者僅為11%；除Ras突變可見于濾泡性腺瘤外，其余分子遺傳學標志物的特異度均達100%；然而，上述分子遺傳學標志物的靈敏度均欠佳，聯合檢測在AUS/FLUS、FN/SFN和SM組中的靈敏度僅分別為63%、57%和68%。
有望用于甲狀腺癌預后判斷的分子標志物包括Ras、PIK3CA、PTEN、P53、ALK、BRAF等基因的突變，其中對BRAF突變作為預后因子的研究較深入[35]。研究[35, 40]顯示，BRAF突變在復發性PTC中的陽性率達78%～95%，且與較低的放射性碘親和性相關，術前甲狀腺FNA標本BRAF突變陽性可預測淋巴結轉移、甲狀腺外侵犯和進展期疾病，從而輔助患者治療方案的決策。
綜上所述，甲狀腺結節細胞學檢查的重要價值在于篩選需手術治療的病例，減少不必要的診斷性手術，并幫助確定手術方案。細胞學對于甲狀腺FN及其疑似病變的診斷缺陷并不影響其篩查價值。使用標準化的甲狀腺細胞學診斷報告系統，有利于診斷術語的統一，以便臨床對病理報告的準確理解，并促進甲狀腺結節臨床處理的規范化。術前聯合細胞形態學、免疫組化檢查及分子標志物檢測將有利于提高細胞學檢查的準確性，并輔助判斷患者的預后。
