引用本文： 朱松明, 張超峰, 張捷, 戴剛, 黃俠. 法尼酯X受體的激活抑制結腸癌細胞生長. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(7): 827-831. doi: 10.7507/1007-9424.20140197 復制
膽酸與結腸癌的發生關系密切，高脂飲食可刺激肝臟合成膽鹽增多，致使腸道暴露在高膽酸的環境中，引起結腸腺瘤與結腸癌的發生。有研究[1-3]對膽囊切除后的患者進行糞膽酸含量測定，結果顯示糞膽酸的升高與結腸癌特別是近端結腸癌的發生直接相關，但膽汁酸參與結腸癌發生的機理尚不明確。法尼酯X受體（farnesiod X receptor，FXR）即膽汁酸的核受體，可以感知細胞內膽汁酸的水平，參與調節膽汁酸的腸肝循環。那么激活FXR后是否可以影響結腸癌細胞的生長呢？因此，本研究應用FXR激動劑GW4064體外作用于結腸癌HCT-116細胞，以檢測FXR激活后，是否可以抑制結腸癌HCT-116細胞的生長。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及試劑
人結腸癌細胞株HCT116由上海腫瘤醫院贈予，胎牛血清（FBS）以及DMEM培養基均購自于GIBCO公司，FXR特異性激動劑GW4064購自于Tocris公司，兔抗人FXR（sc-13063）、鼠抗人GAPDH和免疫熒光二抗均購自于Santa Crus公司，四唑氮藍（MTT）購自于Sigma公司，LDH試劑盒購自于南京建成生物工程研究所，RNA抽提Trizoll試劑購自于Invitrigen公司，逆轉錄PCR試劑盒購自于Famentus公司，PCR試劑盒購自于Takara公司。流式細胞凋亡試劑盒Annexin V-FITC和PI試劑盒購自于Invitrogen公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
取HCT116細胞3×105個/孔置于10% FBS DMEM培養基中，常規培養于培養箱中，待其貼壁生長至70%～80%時，用0.05%胰酶消化傳代培養。
1.2.2 HCT116細胞增殖情況檢測
采用MTT還原法。取消化傳代培養第3代的HTC116細胞按8×103個/孔接種于96孔板，孵育24 h待細胞貼壁后，將培養基換成含1% FBS的DMEM培養基200μL。然后分別加入不同濃度的FXR特異性激動劑GW4064：0（對照組）、0.1、1、3、5、7及10μmol/L，各濃度組重復5孔，另外設空白對照（該培養孔內只含培養液）用于調零。再分別繼續培養24、48及72 h后，各加入20μL的5 mg/mL MTT，再孵育4 h，棄培養基，加入150μL的二甲基亞砜（DMSO），震蕩后用多功能酶標儀檢測570 nm處的吸光度值（A值）。取5孔的平均值作為檢測結果。然后根據公式：細胞活力=加樣孔A值/對照組A值×100%，計算細胞活力，并繪制藥物濃度-細胞活力曲線。
1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況
取消化傳代培養第3代的HCT116細胞按4×104個/孔鋪24孔板，孵育24 h待細胞貼壁后，將培養基換成含1% FBS的DMEM培養基500μL。然后分別加入不同濃度的GW4064：0、1、5和7μmol/L，各濃度組重復3孔，分別于加藥培養24、48及72 h后應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。具體方法是：將培養板中的細胞上清液移入離心管中，用PBS 1 mL /孔洗滌細胞，并將洗液移入對應的離心管中，加入0.25%胰酶消化后輕輕吹打成單細胞懸液，將細胞懸液再次移入對應的離心管中，將各組的細胞懸液放入離心機按1 500 r/min（r=10 cm）離心3 min，棄上清液，行細胞計數，每個樣本取2×105個細胞，加入PBS 4 mL /管，洗2次，加入100μL緩沖液后，再加入5μL熒光標記的AnnexinⅤ和PI試劑，混勻后避光在室溫下放置15 min孵育后，再加入緩沖液400μL，搖勻，立即在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況，比較各濃度組的細胞凋亡率。凋亡率=早期凋亡細胞＋晚期凋亡細胞/總細胞數×100%。
1.2.4 HCT116細胞FXR mRNA及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA表達的檢測
采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法。取HCT116細胞懸液，按4×105個/孔鋪6孔板，然后分別加入不同濃度的GW4064：0、1及5μmol/L，孵育24 h后提取細胞株HCT116總RNA，取5μg RNA逆轉錄合成cDNA鏈。取2μg cDNA作為模板，加入引物，引物序列分別為GAPDH：正義鏈5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反義鏈5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；FXR：正義鏈5′-AACAATCCAAGGAGGTAGAAGAC-3′，反義鏈5′-GAAGAAATCCAGGAA ACTA AGAG-3′；VEGF：正義鏈5′-GTGGACATCTTCCAGGAGTACC-3′，反義鏈5′-GATCCGCAT GATCTGCATGGTG-3′。各引物的退火溫度為50℃，40個循環。取10μL PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳。圖象結果用Band-scan 5.0軟件進行分析。結果計算：FXR mRNA表達量=FXR灰度值/GAPDH灰度值×100%，VEGF mRNA表達量=VEFG灰度值/GAPDH灰度值×100%。
1.3 統計學方法
所有數據應用SPSS 15.0統計軟件包進行處理。計量數據均以均數±標準差（
2 結果
2.1 HCT116細胞增殖情況檢測結果
因MTT結果顯示GW4064 0.1μmol/L組的HCT116細胞生長活性無明顯變化，而10μmol/L組的HCT116細胞的死亡率明顯增高，因此該2組數據均未納入分析。MTT檢測結果顯示，1、3、5及7μmol/L GW4064處理組的HCT116細胞的增殖均受到了明顯的抑制，其生長抑制率與對照組（0μmol/L）相比均明顯升高，其差異均有統計學意義（P＜0.05）；同一濃度的GW4064作用24、48和72 h后的HCT116細胞生長抑制率的差異亦有統計學意義（P＜0.05）。GW4064對HCT116細胞的增殖抑制作用呈現劑量及時間依賴關系，即隨著GW4064劑量的增大和作用時間的延長，其對HCT116細胞的生長抑制作用逐漸增強（圖 1）。72 h GW4064對HCT116細胞的半數抑制濃度（IC50）為4.75μmol/L。
圖1
示不同濃度GW4064作用不同時間后HCT116細胞增殖情況
Figure1.
Results of proliferation of HCT116 cells after GW4064 handled in different concentration and different time
2.2 HCT116細胞凋亡情況檢測結果
HCT116細胞的凋亡情況檢測結果見圖 2和表 1。由圖 2和表 1可見，GW4064可以促進結腸癌HCT116細胞的凋亡，且呈時間和劑量依賴關系（P＜0.05）。
圖2
示GW4064作用48 h各濃度組流式細胞圖，左下象限為活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，左上象限為死亡細胞。2A：對照組；2B：1μmol/L組；2C：5μmol/L組；2D：7μmol/L組??圖 3 ??示不同濃度GW4064作用24 h后HCT116細胞FXR mRNA及VEGF mRNA表達的電泳結果。1：0μmol/L；2：1μmol/L；3：5μmol/L ??圖 4??示不同濃度GW4064作用24 h后HCT116細胞FXR mRNA及VEGF mRNA表達量檢測結果
Figure2.
The results of flow cytometry in different GW4064 concentration after 48 h. Left lower quadrant for live cells, right lower quadrant for early apoptotic cells, right upper quadrant for late apoptotic cells, and left upper quadrant for dead cells. 2A: Contol group; 2B: 1μmol/L group; 2C: 5μmol/L group; 2D: 7μmol/L group ??Figure 3 ??Electrophoresis results on expressions of FXR mRNA and VEGF mRNA of HCT116 cells after GW4064 handled 24 h in different concentration. 1: 0μmol/L; 2: 1μmol/L; 3: 5μmol/L ??Figure 4 ??Results on expression levels of FXR mRNA and VEGF mRNA of HCT116 cells after GW4064 handled 24 h in different concentration
表1
不同濃度的GW4064作用不同時間后HCT116細胞凋亡率檢測結果（%，2.3 HCT116細胞FXR mRNA及VEGF mRNA表達檢測結果
HCT116細胞FXR mRNA及VEGF mRNA表達檢測結果見圖 3和圖 4。由圖 3和圖 4可見，不同濃度的GW4064孵育24 h后，FXR mRNA表達呈劑量依賴性增高，而VEGF mRNA表達則呈劑量依賴性降低，各濃度組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。
3 討論
結腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，居癌癥發病率的第3位，且仍以每年2%的速度遞增。隨著人民生活水平的提高、生活方式的改變，在亞洲、拉美等一些曾經的低發區，結腸癌的發病率和死亡率有迅速升高的趨勢[4]。我國結直腸癌死亡率由2004年的7.35/10萬上升至2005年的9.72/10萬[5]。目前，結腸癌治療是以外科為主的多學科治療，手術切除為其首選治療方法，但術前多數已發生轉移，術后復發率高，治療效果不理想。因此，進一步闡明結腸癌的生長轉移機理，以期找到更加有效的治療方法成為當務之急。
FXR即膽汁酸的核受體，可以感知細胞內膽汁酸水平，參與調節膽汁酸的腸肝循環和膽固醇、脂及糖的代謝；它亦參與動脈粥樣硬化、非乙醇性肝硬變及腸炎的病理過程。研究[6-8]發現，FXR在腫瘤細胞生長及凋亡中也起重要作用，FXR缺失小鼠可引起腸道炎癥、肝臟及腸道腫瘤，FXR激活后可調節多種炎癥因子的表達和抑制腫瘤細胞的生長。在肝臟、乳腺、血管等組織中，激活FXR能夠抑制iNOS、NF-κB、COX-2等炎癥因子的表達[9-11]，而這些均是促進腫瘤細胞生長的重要因子。而急性炎癥期FXR的表達反之亦受到抑制[12]。
近年來，FXR在結直腸癌中的作用成為研究熱點。De Gottardi等[13]通過定量RT-PCR方法檢測60例結腸腺瘤和結腸癌患者中FXR的表達，結果：與正常結腸黏膜相比，結腸腺瘤中FXR的表達下降至17.2%，而結腸癌Ⅰ期和Ⅳ期FXR的表達分別下降至6.9%和3.3%，FXR的表達水平與腫瘤分期相關，同時體外研究發現人結腸癌細胞系Caco-2和HT-29均出現FXR表達下調，且分化程度越低的細胞系其表達程度越低，而在未分化細胞系SW480和轉移來源的SW620細胞系中未發現FXR的表達。Torres等[14]對原發性硬化性膽管炎及潰瘍性結腸炎患者結腸黏膜中檢測FXR表達降低，而該兩種疾病均是結腸癌患者高發人群。Lax等[15]在人體組織中進一步證實了這一觀點，同時結腸癌中低表達FXR的患者預后較差，FXR的表達與結腸癌的分期亦成反比關系。張超峰等[16]的研究中對膽管癌及其正常組織中FXR表達的檢測得到相似的結果。Swales等[17]研究發現，FXR亦可以調節乳腺細胞的調亡。Smith等[18]認為，牛黃脫氧膽酸通過激活FXR抑制結直腸癌細胞的形成。綜上所述，FXR與結腸癌的關系密切，FXR的表達與結腸癌生長成負相關，FXR表達的抑制可能是促進結腸癌生長與轉移的機理之一。
本研究應用FXR特異性激動劑GW4064作用結腸癌HCT116細胞，發現其可以明顯抑制結腸癌HCT116細胞的生長，并促進其凋亡；同時FXR mRNA的表達增高。那么FXR表達升高后是通過什么機理來抑制腫瘤細胞生長呢? VEGF在結腸癌中高表達，對結腸癌新生血管形成及腫瘤生長起重要作用，腫瘤細胞的生長及轉移依賴新生血管的形成，VEGF是最有效的促血管生長因子，它是目前腫瘤臨床病理檢測的主要標志物之一[19]。因此，本研究同時檢測了結腸癌HCT116細胞的VEGF mRNA的表達情況。結果發現，GW4064作用HCT166細胞后，VEGF mRNA的表達受到明顯抑制，并呈劑量依賴性。該結果提示，GW4064通過刺激FXR mRNA的表達促進結腸癌細胞的凋亡，FXR可能通過降低VEGF mRNA的表達促進了結腸癌細胞的凋亡。Li等[20]研究認為，FXR激動劑可以抑制血管平滑肌細胞的生長及轉移，后者是腫瘤生長及轉移的重要因素，Peng等[21]研究證明，GW4064通過FXR作用于結腸癌細胞，可以抑制結腸癌的形成及生長，這和本研究結果相似。相反，Bailey等[22]研究表明，DNA的甲基化以及癌基因同系物（KRAS）通過沉默FXR基因表達，促進腫瘤的形成。同時大量研究[23-25]證明，FXR是人體的一個保護性受體。因此，FXR可能成為治療結腸癌的一個重要靶點。
綜上，本研究初步證實了GW4064可以抑制結腸癌細胞的生長，其可能機理為通過刺激FXR抑制VEGF的表達，進而抑制結腸癌細胞的生長，但深入的機理值得我們進一步研究。FXR可能成為治療結腸癌的一個重要靶點，而其激動劑GW4064可能成為治療結腸癌的重要化學藥物。
膽酸與結腸癌的發生關系密切，高脂飲食可刺激肝臟合成膽鹽增多，致使腸道暴露在高膽酸的環境中，引起結腸腺瘤與結腸癌的發生。有研究[1-3]對膽囊切除后的患者進行糞膽酸含量測定，結果顯示糞膽酸的升高與結腸癌特別是近端結腸癌的發生直接相關，但膽汁酸參與結腸癌發生的機理尚不明確。法尼酯X受體（farnesiod X receptor，FXR）即膽汁酸的核受體，可以感知細胞內膽汁酸的水平，參與調節膽汁酸的腸肝循環。那么激活FXR后是否可以影響結腸癌細胞的生長呢？因此，本研究應用FXR激動劑GW4064體外作用于結腸癌HCT-116細胞，以檢測FXR激活后，是否可以抑制結腸癌HCT-116細胞的生長。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及試劑
人結腸癌細胞株HCT116由上海腫瘤醫院贈予，胎牛血清（FBS）以及DMEM培養基均購自于GIBCO公司，FXR特異性激動劑GW4064購自于Tocris公司，兔抗人FXR（sc-13063）、鼠抗人GAPDH和免疫熒光二抗均購自于Santa Crus公司，四唑氮藍（MTT）購自于Sigma公司，LDH試劑盒購自于南京建成生物工程研究所，RNA抽提Trizoll試劑購自于Invitrigen公司，逆轉錄PCR試劑盒購自于Famentus公司，PCR試劑盒購自于Takara公司。流式細胞凋亡試劑盒Annexin V-FITC和PI試劑盒購自于Invitrogen公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
取HCT116細胞3×105個/孔置于10% FBS DMEM培養基中，常規培養于培養箱中，待其貼壁生長至70%～80%時，用0.05%胰酶消化傳代培養。
1.2.2 HCT116細胞增殖情況檢測
采用MTT還原法。取消化傳代培養第3代的HTC116細胞按8×103個/孔接種于96孔板，孵育24 h待細胞貼壁后，將培養基換成含1% FBS的DMEM培養基200μL。然后分別加入不同濃度的FXR特異性激動劑GW4064：0（對照組）、0.1、1、3、5、7及10μmol/L，各濃度組重復5孔，另外設空白對照（該培養孔內只含培養液）用于調零。再分別繼續培養24、48及72 h后，各加入20μL的5 mg/mL MTT，再孵育4 h，棄培養基，加入150μL的二甲基亞砜（DMSO），震蕩后用多功能酶標儀檢測570 nm處的吸光度值（A值）。取5孔的平均值作為檢測結果。然后根據公式：細胞活力=加樣孔A值/對照組A值×100%，計算細胞活力，并繪制藥物濃度-細胞活力曲線。
1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況
取消化傳代培養第3代的HCT116細胞按4×104個/孔鋪24孔板，孵育24 h待細胞貼壁后，將培養基換成含1% FBS的DMEM培養基500μL。然后分別加入不同濃度的GW4064：0、1、5和7μmol/L，各濃度組重復3孔，分別于加藥培養24、48及72 h后應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。具體方法是：將培養板中的細胞上清液移入離心管中，用PBS 1 mL /孔洗滌細胞，并將洗液移入對應的離心管中，加入0.25%胰酶消化后輕輕吹打成單細胞懸液，將細胞懸液再次移入對應的離心管中，將各組的細胞懸液放入離心機按1 500 r/min（r=10 cm）離心3 min，棄上清液，行細胞計數，每個樣本取2×105個細胞，加入PBS 4 mL /管，洗2次，加入100μL緩沖液后，再加入5μL熒光標記的AnnexinⅤ和PI試劑，混勻后避光在室溫下放置15 min孵育后，再加入緩沖液400μL，搖勻，立即在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況，比較各濃度組的細胞凋亡率。凋亡率=早期凋亡細胞＋晚期凋亡細胞/總細胞數×100%。
1.2.4 HCT116細胞FXR mRNA及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA表達的檢測
采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法。取HCT116細胞懸液，按4×105個/孔鋪6孔板，然后分別加入不同濃度的GW4064：0、1及5μmol/L，孵育24 h后提取細胞株HCT116總RNA，取5μg RNA逆轉錄合成cDNA鏈。取2μg cDNA作為模板，加入引物，引物序列分別為GAPDH：正義鏈5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反義鏈5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；FXR：正義鏈5′-AACAATCCAAGGAGGTAGAAGAC-3′，反義鏈5′-GAAGAAATCCAGGAA ACTA AGAG-3′；VEGF：正義鏈5′-GTGGACATCTTCCAGGAGTACC-3′，反義鏈5′-GATCCGCAT GATCTGCATGGTG-3′。各引物的退火溫度為50℃，40個循環。取10μL PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳。圖象結果用Band-scan 5.0軟件進行分析。結果計算：FXR mRNA表達量=FXR灰度值/GAPDH灰度值×100%，VEGF mRNA表達量=VEFG灰度值/GAPDH灰度值×100%。
1.3 統計學方法
所有數據應用SPSS 15.0統計軟件包進行處理。計量數據均以均數±標準差（
2 結果
2.1 HCT116細胞增殖情況檢測結果
因MTT結果顯示GW4064 0.1μmol/L組的HCT116細胞生長活性無明顯變化，而10μmol/L組的HCT116細胞的死亡率明顯增高，因此該2組數據均未納入分析。MTT檢測結果顯示，1、3、5及7μmol/L GW4064處理組的HCT116細胞的增殖均受到了明顯的抑制，其生長抑制率與對照組（0μmol/L）相比均明顯升高，其差異均有統計學意義（P＜0.05）；同一濃度的GW4064作用24、48和72 h后的HCT116細胞生長抑制率的差異亦有統計學意義（P＜0.05）。GW4064對HCT116細胞的增殖抑制作用呈現劑量及時間依賴關系，即隨著GW4064劑量的增大和作用時間的延長，其對HCT116細胞的生長抑制作用逐漸增強（圖 1）。72 h GW4064對HCT116細胞的半數抑制濃度（IC50）為4.75μmol/L。
圖1
示不同濃度GW4064作用不同時間后HCT116細胞增殖情況
Figure1.
Results of proliferation of HCT116 cells after GW4064 handled in different concentration and different time
2.2 HCT116細胞凋亡情況檢測結果
HCT116細胞的凋亡情況檢測結果見圖 2和表 1。由圖 2和表 1可見，GW4064可以促進結腸癌HCT116細胞的凋亡，且呈時間和劑量依賴關系（P＜0.05）。
圖2
示GW4064作用48 h各濃度組流式細胞圖，左下象限為活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，左上象限為死亡細胞。2A：對照組；2B：1μmol/L組；2C：5μmol/L組；2D：7μmol/L組??圖 3 ??示不同濃度GW4064作用24 h后HCT116細胞FXR mRNA及VEGF mRNA表達的電泳結果。1：0μmol/L；2：1μmol/L；3：5μmol/L ??圖 4??示不同濃度GW4064作用24 h后HCT116細胞FXR mRNA及VEGF mRNA表達量檢測結果
Figure2.
The results of flow cytometry in different GW4064 concentration after 48 h. Left lower quadrant for live cells, right lower quadrant for early apoptotic cells, right upper quadrant for late apoptotic cells, and left upper quadrant for dead cells. 2A: Contol group; 2B: 1μmol/L group; 2C: 5μmol/L group; 2D: 7μmol/L group ??Figure 3 ??Electrophoresis results on expressions of FXR mRNA and VEGF mRNA of HCT116 cells after GW4064 handled 24 h in different concentration. 1: 0μmol/L; 2: 1μmol/L; 3: 5μmol/L ??Figure 4 ??Results on expression levels of FXR mRNA and VEGF mRNA of HCT116 cells after GW4064 handled 24 h in different concentration
表1
不同濃度的GW4064作用不同時間后HCT116細胞凋亡率檢測結果（%，2.3 HCT116細胞FXR mRNA及VEGF mRNA表達檢測結果
HCT116細胞FXR mRNA及VEGF mRNA表達檢測結果見圖 3和圖 4。由圖 3和圖 4可見，不同濃度的GW4064孵育24 h后，FXR mRNA表達呈劑量依賴性增高，而VEGF mRNA表達則呈劑量依賴性降低，各濃度組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。
3 討論
結腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，居癌癥發病率的第3位，且仍以每年2%的速度遞增。隨著人民生活水平的提高、生活方式的改變，在亞洲、拉美等一些曾經的低發區，結腸癌的發病率和死亡率有迅速升高的趨勢[4]。我國結直腸癌死亡率由2004年的7.35/10萬上升至2005年的9.72/10萬[5]。目前，結腸癌治療是以外科為主的多學科治療，手術切除為其首選治療方法，但術前多數已發生轉移，術后復發率高，治療效果不理想。因此，進一步闡明結腸癌的生長轉移機理，以期找到更加有效的治療方法成為當務之急。
FXR即膽汁酸的核受體，可以感知細胞內膽汁酸水平，參與調節膽汁酸的腸肝循環和膽固醇、脂及糖的代謝；它亦參與動脈粥樣硬化、非乙醇性肝硬變及腸炎的病理過程。研究[6-8]發現，FXR在腫瘤細胞生長及凋亡中也起重要作用，FXR缺失小鼠可引起腸道炎癥、肝臟及腸道腫瘤，FXR激活后可調節多種炎癥因子的表達和抑制腫瘤細胞的生長。在肝臟、乳腺、血管等組織中，激活FXR能夠抑制iNOS、NF-κB、COX-2等炎癥因子的表達[9-11]，而這些均是促進腫瘤細胞生長的重要因子。而急性炎癥期FXR的表達反之亦受到抑制[12]。
近年來，FXR在結直腸癌中的作用成為研究熱點。De Gottardi等[13]通過定量RT-PCR方法檢測60例結腸腺瘤和結腸癌患者中FXR的表達，結果：與正常結腸黏膜相比，結腸腺瘤中FXR的表達下降至17.2%，而結腸癌Ⅰ期和Ⅳ期FXR的表達分別下降至6.9%和3.3%，FXR的表達水平與腫瘤分期相關，同時體外研究發現人結腸癌細胞系Caco-2和HT-29均出現FXR表達下調，且分化程度越低的細胞系其表達程度越低，而在未分化細胞系SW480和轉移來源的SW620細胞系中未發現FXR的表達。Torres等[14]對原發性硬化性膽管炎及潰瘍性結腸炎患者結腸黏膜中檢測FXR表達降低，而該兩種疾病均是結腸癌患者高發人群。Lax等[15]在人體組織中進一步證實了這一觀點，同時結腸癌中低表達FXR的患者預后較差，FXR的表達與結腸癌的分期亦成反比關系。張超峰等[16]的研究中對膽管癌及其正常組織中FXR表達的檢測得到相似的結果。Swales等[17]研究發現，FXR亦可以調節乳腺細胞的調亡。Smith等[18]認為，牛黃脫氧膽酸通過激活FXR抑制結直腸癌細胞的形成。綜上所述，FXR與結腸癌的關系密切，FXR的表達與結腸癌生長成負相關，FXR表達的抑制可能是促進結腸癌生長與轉移的機理之一。
本研究應用FXR特異性激動劑GW4064作用結腸癌HCT116細胞，發現其可以明顯抑制結腸癌HCT116細胞的生長，并促進其凋亡；同時FXR mRNA的表達增高。那么FXR表達升高后是通過什么機理來抑制腫瘤細胞生長呢? VEGF在結腸癌中高表達，對結腸癌新生血管形成及腫瘤生長起重要作用，腫瘤細胞的生長及轉移依賴新生血管的形成，VEGF是最有效的促血管生長因子，它是目前腫瘤臨床病理檢測的主要標志物之一[19]。因此，本研究同時檢測了結腸癌HCT116細胞的VEGF mRNA的表達情況。結果發現，GW4064作用HCT166細胞后，VEGF mRNA的表達受到明顯抑制，并呈劑量依賴性。該結果提示，GW4064通過刺激FXR mRNA的表達促進結腸癌細胞的凋亡，FXR可能通過降低VEGF mRNA的表達促進了結腸癌細胞的凋亡。Li等[20]研究認為，FXR激動劑可以抑制血管平滑肌細胞的生長及轉移，后者是腫瘤生長及轉移的重要因素，Peng等[21]研究證明，GW4064通過FXR作用于結腸癌細胞，可以抑制結腸癌的形成及生長，這和本研究結果相似。相反，Bailey等[22]研究表明，DNA的甲基化以及癌基因同系物（KRAS）通過沉默FXR基因表達，促進腫瘤的形成。同時大量研究[23-25]證明，FXR是人體的一個保護性受體。因此，FXR可能成為治療結腸癌的一個重要靶點。
綜上，本研究初步證實了GW4064可以抑制結腸癌細胞的生長，其可能機理為通過刺激FXR抑制VEGF的表達，進而抑制結腸癌細胞的生長，但深入的機理值得我們進一步研究。FXR可能成為治療結腸癌的一個重要靶點，而其激動劑GW4064可能成為治療結腸癌的重要化學藥物。
