引用本文： 孫英冬, 周勇, 王勇, 劉金鋼. Ghrelin提高L6大鼠成肌細胞胰島素敏感性及其機理. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(7): 816-821. doi: 10.7507/1007-9424.20140195 復制
Ghrelin是一種由28個氨基酸組成的小分子活性肽，主要由胃底的X/A樣細胞分泌，Ghrelin在體內有3種形式存在：Ghrelin（n-octanoyl-Ghrelin、acy-lated Ghrelin及Ghrelin，AG）、非酰化Ghrelin（unacy-lated Ghrelin、des-Ghrelin及UAG）和瘦素（obestatin，Ob）[1-2]，Ghrelin可在腸道、胰腺、腎臟、性腺、胎盤、下丘腦、垂體等組織中表達，發揮相應的生物學功能[3]。有研究[1-2, 4]表明，Ghrelin除了促進生長激素釋放、增加食欲外，還與胰島素、瘦素等外周信號共同影響能量平衡和糖代謝，與肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病等關系密切。骨骼肌是人體胰島素作用的主要靶組織，胰島素刺激下的機體葡萄糖攝取約有80%是由骨骼肌完成的，機體胰島素敏感性極大地依賴于骨骼肌葡萄糖攝取量[5]。本研究通過體外培養L6大鼠成肌細胞，利用棕櫚酸建立胰島素抵抗模型，觀察Ghrelin是否影響L6大鼠成肌細胞胰島素刺激下的葡萄糖代謝，并討論其與磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β（PI3K/Akt/GSK-3β）信號通路的關系。
1 材料與方法
1.1 材料
L6大鼠成肌細胞株購于武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清、高糖DMEM培養液及胰酶購于北京久峰潤達生物技術有限公司；Ghrelin購于北京晨博生物科技有限公司；葡萄糖測定試劑盒購于上海榮盛生物藥業有限公司；BCA定量試劑盒和PI3K阻斷劑（LY294002）購于碧云天生物技術研究所；胎牛胰島素、棕櫚酸、抗磷酸化總蛋白激酶B（Akt）兔抗體（Ser473）及抗磷酸化糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）兔抗體（Ser9）購于美國Sigma-Aldrich生物技術公司；抗總Akt兔抗體和抗總GSK-3β兔抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；山羊抗兔二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司；抗GLUT-4兔抗體購于美國Santa Cruz生物技術公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
將復蘇后的L6大鼠成肌細胞接種在培養瓶中，在5% CO2、37℃飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液孵育，經4～5 d細胞生長至70%～80%融合時，換為含2%胎牛血清的高糖DMEM培養液進行誘導分化，每隔2 d換液，直至細胞生長出肌管。實驗分為對照組、棕櫚酸組、胰島素組、棕櫚酸＋胰島素組（該組即為胰島素抵抗組）及實驗組。棕櫚酸組、胰島素組及棕櫚酸＋胰島素組實為制作胰島素抵抗模型過程，按實驗要求分別加入棕櫚酸及胰島素。實驗組則向培養瓶中加入含有0.3 mmol/L的棕櫚酸無血清DMEM培養液孵育16 h，然后分別加入1、10及100 nmol/L的Ghrelin孵育8 h，并于提取上清液前30 min加100 nmol/L胰島素孵育30 min。對照組則加入等量蒸餾水。
1.2.2 檢測葡萄糖攝取
用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法（GOD-POD）檢測各組上清液中殘余葡萄糖濃度，將試劑R1和R2等量混勻配制成工作液，取200μL工作液加入96孔板，同時設立空白孔和標準孔，加樣后37℃水浴30 min，在490 nm處測定各孔的吸光度值（A值）。測定孔與標準孔A值的比值即為上清液殘存的葡萄糖濃度，以此計算各組L6大鼠成肌細胞葡萄糖攝取量。
1.2.3 熒光共聚焦顯微鏡下觀察細胞膜GLUT-4染色情況
取棕櫚酸＋胰島素組和100 nmol/L Ghrelin組細胞，棄上清液后用PBS沖洗細胞3次。以4%多聚甲醛在室溫固定細胞20 min，后用PBS沖洗3次。0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）于室溫透化作用10 min，PBS沖洗3次后，加入抗Glut-4兔抗體（1:500稀釋）室溫下孵育2 h。PBS沖洗一抗3次，每次浸泡5 min，以異硫氰酸熒光素結合二抗（1:200稀釋）于室溫下避光孵育1 h。PBS沖洗3次，于熒光共聚焦顯微鏡下觀察并拍攝圖片。
1.2.4 免疫印跡（Western blot）法檢測Akt、pAkt、GSK-3β及pGSK-3β蛋白表達水平
取各組待測細胞棄上清液后以PBS沖洗3次，用細胞刮收集細胞于Eppendorf管中，4℃、1 000 r/min離心5 min（r=42 mm）后，棄上清PBS。于冰上用含磷酸酶抑制劑（phosphatase inhibitor，PI）和苯甲基磺酰氟絲氨酸蛋白酶抑制劑（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的細胞組織快速裂解液（RIPA）裂解細胞15 min，用1 mL注射器反復抽吸10次，4℃、14 000 r/min（r=42 mm）離心30 min。取上清，以BCA試劑盒測定蛋白濃度，再與裂解緩沖液（5×Lysis buffer）按1:4比例混合后，100℃加熱震蕩5 min，使蛋白變性。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE；濃縮膠5%，電壓80 V；分離膠10%，電壓120 V）分離蛋白樣品（每孔上樣55μg）后，再依照Marker切取Akt和GSK-3β相應的蛋白條帶，再濕轉2 h到二氟化樹脂（PVDF）膜上。上述含有相應蛋白條帶的PVDF膜經5%胎牛血清封閉2 h后，分別用抗總Akt兔抗體（1:200稀釋）、抗磷酸化Akt兔抗體（Ser473，1:1 000稀釋）、抗總GSK-3β兔抗體（1:200稀釋）或抗磷酸化GSK-3β兔抗體（Ser9，1:1 000稀釋）在4℃條件下孵育PVDF膜過夜。次日PVDF膜復溫30 min，后以1×三羥甲基氨基甲烷-氯化鈉-吐溫20三者的混合物（TBST）清洗PVDF膜3次，每次10 min。二抗使用偶聯過氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG（1:6 000稀釋）室溫孵育2 h。1×TBST洗膜3次，方法同前。最后蛋白條帶用增強化學發光底物檢測試劑盒檢測后，曝光，應用NIHImage J軟件分析定量，即可分別檢測Akt及GSK-3β蛋白磷酸化表達水平。
1.2.5 PI3K阻斷劑LY294002作用后葡萄糖攝取及Akt、pAkt、GSK-3β和pGSK-3β蛋白表達水平的檢測
在100 nmol/L Ghrelin與骨骼肌細胞作用前30 min加入PI3K阻斷劑LY294002，其終濃度為10μmol/L，然后按1.2.2和1.2.4項的方法分別檢測葡萄糖攝取及Akt、pAkt，GSK-3β和pGSK-3β蛋白的表達。
1.3 統計學方法
采用SPSS 16.0統計軟件包進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 各組L6大鼠成肌細胞葡萄糖攝取量檢測結果
胰島素組葡萄糖攝取量高于對照組，是后者的1.699倍（P＜0.05）；棕櫚酸＋胰島素組（胰島素抵抗模型）葡萄糖攝取量低于胰島素組，是后者的35.6%（P＜0.05）。而在Ghrelin的作用下，各Ghrelin濃度組葡萄糖攝取量均有所提高，且呈濃度依賴型，與棕櫚酸＋胰島素組比較，其中1、10和100 nmol/L Ghrelin組葡萄糖攝取量分別提高了29.7%（P=0.057）、35.3%（P＜0.05）和100.1%（P＜0.01），見表 1。該結果提示，Ghrelin可改善胰島素抵抗L6大鼠成肌細胞的葡萄糖攝取。
表1
各組上清液中葡萄糖濃度及細胞的葡萄糖攝取量檢測結果（2.2 2組L6大鼠成肌細胞GLUT-4膜蛋白表達檢測結果
利用熒光抗體標記2組細胞膜GLUT-4蛋白，共聚焦顯微鏡下觀察GLUT-4蛋白熒光顯色變化。結果100 nmol/L Ghrelin處理組細胞膜上GLUT-4熒光染色較棕櫚酸＋胰島素組（胰島素抵抗組）明顯加深（圖 1）。該結果提示，Ghrelin可增加胰島素抵抗L6大鼠成肌細胞GLUT-4膜蛋白的表達。
圖1
示共聚焦顯微鏡下觀察細胞膜GLUT-4蛋白染色情況（免疫熒光染色×400）。1A：胰島素抵抗組；1B：100 nmol/L Ghrelin處理組
Figure1.
GLUT-4 protein staining on cell membrane under confocal microscopy (Immunofluorescence staining×400). 1A: Insulin resistance group; 1B: 100 nmol/L Ghrelin group
2.3 各組L6大鼠成肌細胞Akt及GSK-3β蛋白磷酸化水平檢測結果
胰島素組pAkt蛋白的表達明顯高于對照組（P＜0.05），而棕櫚酸處理后，胰島素刺激下的pAkt蛋白表達明顯降低（P＜0.05），而經100 nmol/L的Ghrelin作用后，pAkt蛋白的表達有所上升（P＜0.05），見圖 2；pGSK-3β蛋白的表達也呈相同趨勢（圖 3）。各組細胞總Akt及總GSK-3β蛋白的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。該結果提示，Ghrelin可增加胰島素抵抗L6大鼠成肌細胞pAkt及pGSK-3β蛋白的表達。
圖2
示各組細胞pAkt蛋白表達檢測結果。2A：電泳結果；2B：定量結果；1：對照組；2：胰島素組；3：胰島素抵抗組；4：Ghrelin組??圖 3??示各組細胞pGSK-3β蛋白表達檢測結果。3A：電泳結果；3B：定量結果；1：對照組；2：胰島素組；3：胰島素抵抗組；4：Ghrelin組??圖 4??示PI3K阻斷劑作用后pAkt蛋白表達檢測結果。4A：電泳結果；4B：定量結果；1：Ghrelin組；2：PI3K阻斷劑組??圖 5??示PI3K阻斷劑作用后pGSK-3β蛋白表達檢測結果。4A：電泳結果；4B：定量結果；1：Ghrelin組；2：PI3K阻斷劑組
Figure2.
Expression results of pAkt protein of cells in each group. 2A: Electrophoresis results; 2B: Quantitative results; 1: Control group; 2: Insulin group; 3: Insulin-resistant group; 4: Ghrelin group??Figure 3??Expression results of pGSK-3βprotein of cells in each group. 2A: Electrophoresis results; 2B: Quantitative results; 1: Control group; 2: Insulin group; 3: Insulin-resistant group; 4: Ghrelin group??Figure 4?? Expression results of pAkt protein after PI3K blocking in two groups. 4A: Electrophoresis results; 4B: Quantitative results; 1: Ghrelin group; 2: PI3K inhibitor group??Figure 5??Expression results of pGSK-3βprotein after PI3K blocking in two groups. 4A: Electrophoresis results; 4B: Quantitative results; 1: Ghrelin group; 2: PI3K inhibitor group
2.4 PI3K阻斷劑對Ghrelin改善葡萄糖攝取的影響
于100 nmol/L Ghrelin作用前30 min加入PI3K阻斷劑LY294002 10μmol/L，胰島素作用30 min后，PI3K阻斷劑組細胞的葡萄糖攝取量為（2.748±0.168）×10-6 mol，較Ghrelin組的（4.539±0.161）×10-6 mol降低了39.5%（P＜0.05），減弱了Ghrelin對細胞葡萄糖攝取的改善作用。經免疫印跡法檢測，PI3K阻斷劑組細胞的pAkt及pGSK-3β蛋白表達水平均較Ghrelin組明顯下降（P＜0.05），見圖 4及圖 5。
3 討論
Ghrelin是在外周組織中有豐富表達的小分子腦腸肽，是生長激素促分泌物受體（GHS-R）的內源性配體[4]。GHS-R屬于G蛋白偶聯受體，可分為GHS-R1α和GHS-R1β兩個亞型。其中GHS-R1α廣泛存在于周圍及中樞組織中，是GHS-R發揮生物學功能的主要形式，而GHS-R1β則不介導生物學效應[6]。Ghrelin通過與GHS-R1α相結合而發揮生物學作用[7-8]，包括促進生長激素GH釋放和參與調節攝食行為。有研究發現[5, 9-11]，Ghrelin與改善外周組織糖代謝和保護胰島細胞功能密切相關，而且存在很大爭議。
2型糖尿病已成為威脅國人健康的第一大疾病，且近期有年輕化趨勢。在我國20歲以上的人群中，糖尿病男女的患病率分別達10.6%和8.8%，總體糖尿病患病率為9.7% [12]，形勢十分嚴峻。2型糖尿病是由環境、基因及內分泌因素引起的一種病理狀態，其發病原因和確切機理尚不完全清楚，但周圍組織胰島素抵抗是2型糖尿病發生和發展的重要病理生理基礎[13]。因此，有效改善機體胰島素抵抗狀態，對降低2型糖尿病的發病率，采取有效的防治措施具有重要意義。
骨骼肌是人體胰島素作用的主要靶組織，胰島素刺激下的機體葡萄糖攝取約有80%是由骨骼肌完成的，機體胰島素敏感性極大地依賴于骨骼肌葡萄糖攝取量[14-16]。有研究闡述，造成骨骼肌胰島素抵抗的主要原因是線粒體功能的喪失[17]和膜蛋白表達受抑制[5, 18]。在體內，胰島素主要通過胰島素受體底物（IRS-1）/ PI3K）/ Akt途徑促進葡萄糖轉運。Akt屬絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，是PI3K信號通路下游受體蛋白激酶的主要靶點，Akt由PI3K激活后其結構發生變化，導致其兩個調節位點Thr308和Ser-473磷酸化，在多數情況下，Ser-473位點磷酸化水平可以代表Akt的磷酸化程度[19]，Akt、GSK-3β和葡萄糖轉運因子GLUT-4均為胰島素信號傳導通路中的調節因子。Akt是參與骨骼肌細胞中胰島素刺激的GLUT-4向質膜轉位的重要信號蛋白，它能刺激葡萄糖攝取和GLUT-4轉位，調節葡萄糖攝取、糖原合成、糖酵解等胰島素代謝反應[20-22]。GSK-3是一種廣泛存在于真核生物體內的多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有兩種亞型：GSK-3α和GSK-3β，在氨基酸排列順序上二者有85%的同源性。GSK-3β是糖原合成途徑中的關鍵酶，正常情況下，GSK-3β是有活性的，可通過使糖原合成酶磷酸化失活，抑制糖原合成，導致血糖升高[9]。GSK-3β為Akt的直接底物，活化的Akt可使GSK-3β的Ser9位點磷酸化，導致GSK-3β失活，糖原合成增加[23]，此過程依賴Akt的參與[24]。因此，PI3K、Akt和GSK-3β形成骨骼肌中胰島素調節糖原合成的信號級聯系統中一個重要通路。本研究中，經棕櫚酸處理的L6大鼠成肌細胞，其胰島素敏感性明顯降低，細胞處于胰島素抵抗狀態。細胞經Ghrelin處理后，pAkt表達增加，進而增加pGSK-3β表達，抑制GSK-3β活性，促進糖原合成，最終使GLUT-4從細胞質轉位到細胞膜表面，將葡萄糖轉入細胞內。GLUT-4的膜表達增加，細胞葡萄糖攝取量也有所提高，細胞胰島素抵抗得以改善。而在PI3K阻斷劑存在時，這種改善作用消失。
綜上所述，棕櫚酸可引起骨骼肌細胞胰島素信號通路缺陷，造成胰島素抵抗，而Ghrelin通過PI3K/ Akt/GSK-3β通路緩解L6大鼠成肌細胞胰島素抵抗。本研究也為改善2型糖尿病患者周圍組織胰島素抵抗狀態提供新的思路。而非酰化Ghrelin和瘦素也是Ghrelin在機體存在的重要形式[25]，其與Ghrelin之間有何相互作用，有待進一步研究證實。
Ghrelin是一種由28個氨基酸組成的小分子活性肽，主要由胃底的X/A樣細胞分泌，Ghrelin在體內有3種形式存在：Ghrelin（n-octanoyl-Ghrelin、acy-lated Ghrelin及Ghrelin，AG）、非酰化Ghrelin（unacy-lated Ghrelin、des-Ghrelin及UAG）和瘦素（obestatin，Ob）[1-2]，Ghrelin可在腸道、胰腺、腎臟、性腺、胎盤、下丘腦、垂體等組織中表達，發揮相應的生物學功能[3]。有研究[1-2, 4]表明，Ghrelin除了促進生長激素釋放、增加食欲外，還與胰島素、瘦素等外周信號共同影響能量平衡和糖代謝，與肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病等關系密切。骨骼肌是人體胰島素作用的主要靶組織，胰島素刺激下的機體葡萄糖攝取約有80%是由骨骼肌完成的，機體胰島素敏感性極大地依賴于骨骼肌葡萄糖攝取量[5]。本研究通過體外培養L6大鼠成肌細胞，利用棕櫚酸建立胰島素抵抗模型，觀察Ghrelin是否影響L6大鼠成肌細胞胰島素刺激下的葡萄糖代謝，并討論其與磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β（PI3K/Akt/GSK-3β）信號通路的關系。
1 材料與方法
1.1 材料
L6大鼠成肌細胞株購于武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清、高糖DMEM培養液及胰酶購于北京久峰潤達生物技術有限公司；Ghrelin購于北京晨博生物科技有限公司；葡萄糖測定試劑盒購于上海榮盛生物藥業有限公司；BCA定量試劑盒和PI3K阻斷劑（LY294002）購于碧云天生物技術研究所；胎牛胰島素、棕櫚酸、抗磷酸化總蛋白激酶B（Akt）兔抗體（Ser473）及抗磷酸化糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）兔抗體（Ser9）購于美國Sigma-Aldrich生物技術公司；抗總Akt兔抗體和抗總GSK-3β兔抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；山羊抗兔二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司；抗GLUT-4兔抗體購于美國Santa Cruz生物技術公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
將復蘇后的L6大鼠成肌細胞接種在培養瓶中，在5% CO2、37℃飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液孵育，經4～5 d細胞生長至70%～80%融合時，換為含2%胎牛血清的高糖DMEM培養液進行誘導分化，每隔2 d換液，直至細胞生長出肌管。實驗分為對照組、棕櫚酸組、胰島素組、棕櫚酸＋胰島素組（該組即為胰島素抵抗組）及實驗組。棕櫚酸組、胰島素組及棕櫚酸＋胰島素組實為制作胰島素抵抗模型過程，按實驗要求分別加入棕櫚酸及胰島素。實驗組則向培養瓶中加入含有0.3 mmol/L的棕櫚酸無血清DMEM培養液孵育16 h，然后分別加入1、10及100 nmol/L的Ghrelin孵育8 h，并于提取上清液前30 min加100 nmol/L胰島素孵育30 min。對照組則加入等量蒸餾水。
1.2.2 檢測葡萄糖攝取
用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法（GOD-POD）檢測各組上清液中殘余葡萄糖濃度，將試劑R1和R2等量混勻配制成工作液，取200μL工作液加入96孔板，同時設立空白孔和標準孔，加樣后37℃水浴30 min，在490 nm處測定各孔的吸光度值（A值）。測定孔與標準孔A值的比值即為上清液殘存的葡萄糖濃度，以此計算各組L6大鼠成肌細胞葡萄糖攝取量。
1.2.3 熒光共聚焦顯微鏡下觀察細胞膜GLUT-4染色情況
取棕櫚酸＋胰島素組和100 nmol/L Ghrelin組細胞，棄上清液后用PBS沖洗細胞3次。以4%多聚甲醛在室溫固定細胞20 min，后用PBS沖洗3次。0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）于室溫透化作用10 min，PBS沖洗3次后，加入抗Glut-4兔抗體（1:500稀釋）室溫下孵育2 h。PBS沖洗一抗3次，每次浸泡5 min，以異硫氰酸熒光素結合二抗（1:200稀釋）于室溫下避光孵育1 h。PBS沖洗3次，于熒光共聚焦顯微鏡下觀察并拍攝圖片。
1.2.4 免疫印跡（Western blot）法檢測Akt、pAkt、GSK-3β及pGSK-3β蛋白表達水平
取各組待測細胞棄上清液后以PBS沖洗3次，用細胞刮收集細胞于Eppendorf管中，4℃、1 000 r/min離心5 min（r=42 mm）后，棄上清PBS。于冰上用含磷酸酶抑制劑（phosphatase inhibitor，PI）和苯甲基磺酰氟絲氨酸蛋白酶抑制劑（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的細胞組織快速裂解液（RIPA）裂解細胞15 min，用1 mL注射器反復抽吸10次，4℃、14 000 r/min（r=42 mm）離心30 min。取上清，以BCA試劑盒測定蛋白濃度，再與裂解緩沖液（5×Lysis buffer）按1:4比例混合后，100℃加熱震蕩5 min，使蛋白變性。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE；濃縮膠5%，電壓80 V；分離膠10%，電壓120 V）分離蛋白樣品（每孔上樣55μg）后，再依照Marker切取Akt和GSK-3β相應的蛋白條帶，再濕轉2 h到二氟化樹脂（PVDF）膜上。上述含有相應蛋白條帶的PVDF膜經5%胎牛血清封閉2 h后，分別用抗總Akt兔抗體（1:200稀釋）、抗磷酸化Akt兔抗體（Ser473，1:1 000稀釋）、抗總GSK-3β兔抗體（1:200稀釋）或抗磷酸化GSK-3β兔抗體（Ser9，1:1 000稀釋）在4℃條件下孵育PVDF膜過夜。次日PVDF膜復溫30 min，后以1×三羥甲基氨基甲烷-氯化鈉-吐溫20三者的混合物（TBST）清洗PVDF膜3次，每次10 min。二抗使用偶聯過氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG（1:6 000稀釋）室溫孵育2 h。1×TBST洗膜3次，方法同前。最后蛋白條帶用增強化學發光底物檢測試劑盒檢測后，曝光，應用NIHImage J軟件分析定量，即可分別檢測Akt及GSK-3β蛋白磷酸化表達水平。
1.2.5 PI3K阻斷劑LY294002作用后葡萄糖攝取及Akt、pAkt、GSK-3β和pGSK-3β蛋白表達水平的檢測
在100 nmol/L Ghrelin與骨骼肌細胞作用前30 min加入PI3K阻斷劑LY294002，其終濃度為10μmol/L，然后按1.2.2和1.2.4項的方法分別檢測葡萄糖攝取及Akt、pAkt，GSK-3β和pGSK-3β蛋白的表達。
1.3 統計學方法
采用SPSS 16.0統計軟件包進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 各組L6大鼠成肌細胞葡萄糖攝取量檢測結果
胰島素組葡萄糖攝取量高于對照組，是后者的1.699倍（P＜0.05）；棕櫚酸＋胰島素組（胰島素抵抗模型）葡萄糖攝取量低于胰島素組，是后者的35.6%（P＜0.05）。而在Ghrelin的作用下，各Ghrelin濃度組葡萄糖攝取量均有所提高，且呈濃度依賴型，與棕櫚酸＋胰島素組比較，其中1、10和100 nmol/L Ghrelin組葡萄糖攝取量分別提高了29.7%（P=0.057）、35.3%（P＜0.05）和100.1%（P＜0.01），見表 1。該結果提示，Ghrelin可改善胰島素抵抗L6大鼠成肌細胞的葡萄糖攝取。
表1
各組上清液中葡萄糖濃度及細胞的葡萄糖攝取量檢測結果（2.2 2組L6大鼠成肌細胞GLUT-4膜蛋白表達檢測結果
利用熒光抗體標記2組細胞膜GLUT-4蛋白，共聚焦顯微鏡下觀察GLUT-4蛋白熒光顯色變化。結果100 nmol/L Ghrelin處理組細胞膜上GLUT-4熒光染色較棕櫚酸＋胰島素組（胰島素抵抗組）明顯加深（圖 1）。該結果提示，Ghrelin可增加胰島素抵抗L6大鼠成肌細胞GLUT-4膜蛋白的表達。
圖1
示共聚焦顯微鏡下觀察細胞膜GLUT-4蛋白染色情況（免疫熒光染色×400）。1A：胰島素抵抗組；1B：100 nmol/L Ghrelin處理組
Figure1.
GLUT-4 protein staining on cell membrane under confocal microscopy (Immunofluorescence staining×400). 1A: Insulin resistance group; 1B: 100 nmol/L Ghrelin group
2.3 各組L6大鼠成肌細胞Akt及GSK-3β蛋白磷酸化水平檢測結果
胰島素組pAkt蛋白的表達明顯高于對照組（P＜0.05），而棕櫚酸處理后，胰島素刺激下的pAkt蛋白表達明顯降低（P＜0.05），而經100 nmol/L的Ghrelin作用后，pAkt蛋白的表達有所上升（P＜0.05），見圖 2；pGSK-3β蛋白的表達也呈相同趨勢（圖 3）。各組細胞總Akt及總GSK-3β蛋白的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。該結果提示，Ghrelin可增加胰島素抵抗L6大鼠成肌細胞pAkt及pGSK-3β蛋白的表達。
圖2
示各組細胞pAkt蛋白表達檢測結果。2A：電泳結果；2B：定量結果；1：對照組；2：胰島素組；3：胰島素抵抗組；4：Ghrelin組??圖 3??示各組細胞pGSK-3β蛋白表達檢測結果。3A：電泳結果；3B：定量結果；1：對照組；2：胰島素組；3：胰島素抵抗組；4：Ghrelin組??圖 4??示PI3K阻斷劑作用后pAkt蛋白表達檢測結果。4A：電泳結果；4B：定量結果；1：Ghrelin組；2：PI3K阻斷劑組??圖 5??示PI3K阻斷劑作用后pGSK-3β蛋白表達檢測結果。4A：電泳結果；4B：定量結果；1：Ghrelin組；2：PI3K阻斷劑組
Figure2.
Expression results of pAkt protein of cells in each group. 2A: Electrophoresis results; 2B: Quantitative results; 1: Control group; 2: Insulin group; 3: Insulin-resistant group; 4: Ghrelin group??Figure 3??Expression results of pGSK-3βprotein of cells in each group. 2A: Electrophoresis results; 2B: Quantitative results; 1: Control group; 2: Insulin group; 3: Insulin-resistant group; 4: Ghrelin group??Figure 4?? Expression results of pAkt protein after PI3K blocking in two groups. 4A: Electrophoresis results; 4B: Quantitative results; 1: Ghrelin group; 2: PI3K inhibitor group??Figure 5??Expression results of pGSK-3βprotein after PI3K blocking in two groups. 4A: Electrophoresis results; 4B: Quantitative results; 1: Ghrelin group; 2: PI3K inhibitor group
2.4 PI3K阻斷劑對Ghrelin改善葡萄糖攝取的影響
于100 nmol/L Ghrelin作用前30 min加入PI3K阻斷劑LY294002 10μmol/L，胰島素作用30 min后，PI3K阻斷劑組細胞的葡萄糖攝取量為（2.748±0.168）×10-6 mol，較Ghrelin組的（4.539±0.161）×10-6 mol降低了39.5%（P＜0.05），減弱了Ghrelin對細胞葡萄糖攝取的改善作用。經免疫印跡法檢測，PI3K阻斷劑組細胞的pAkt及pGSK-3β蛋白表達水平均較Ghrelin組明顯下降（P＜0.05），見圖 4及圖 5。
3 討論
Ghrelin是在外周組織中有豐富表達的小分子腦腸肽，是生長激素促分泌物受體（GHS-R）的內源性配體[4]。GHS-R屬于G蛋白偶聯受體，可分為GHS-R1α和GHS-R1β兩個亞型。其中GHS-R1α廣泛存在于周圍及中樞組織中，是GHS-R發揮生物學功能的主要形式，而GHS-R1β則不介導生物學效應[6]。Ghrelin通過與GHS-R1α相結合而發揮生物學作用[7-8]，包括促進生長激素GH釋放和參與調節攝食行為。有研究發現[5, 9-11]，Ghrelin與改善外周組織糖代謝和保護胰島細胞功能密切相關，而且存在很大爭議。
2型糖尿病已成為威脅國人健康的第一大疾病，且近期有年輕化趨勢。在我國20歲以上的人群中，糖尿病男女的患病率分別達10.6%和8.8%，總體糖尿病患病率為9.7% [12]，形勢十分嚴峻。2型糖尿病是由環境、基因及內分泌因素引起的一種病理狀態，其發病原因和確切機理尚不完全清楚，但周圍組織胰島素抵抗是2型糖尿病發生和發展的重要病理生理基礎[13]。因此，有效改善機體胰島素抵抗狀態，對降低2型糖尿病的發病率，采取有效的防治措施具有重要意義。
骨骼肌是人體胰島素作用的主要靶組織，胰島素刺激下的機體葡萄糖攝取約有80%是由骨骼肌完成的，機體胰島素敏感性極大地依賴于骨骼肌葡萄糖攝取量[14-16]。有研究闡述，造成骨骼肌胰島素抵抗的主要原因是線粒體功能的喪失[17]和膜蛋白表達受抑制[5, 18]。在體內，胰島素主要通過胰島素受體底物（IRS-1）/ PI3K）/ Akt途徑促進葡萄糖轉運。Akt屬絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，是PI3K信號通路下游受體蛋白激酶的主要靶點，Akt由PI3K激活后其結構發生變化，導致其兩個調節位點Thr308和Ser-473磷酸化，在多數情況下，Ser-473位點磷酸化水平可以代表Akt的磷酸化程度[19]，Akt、GSK-3β和葡萄糖轉運因子GLUT-4均為胰島素信號傳導通路中的調節因子。Akt是參與骨骼肌細胞中胰島素刺激的GLUT-4向質膜轉位的重要信號蛋白，它能刺激葡萄糖攝取和GLUT-4轉位，調節葡萄糖攝取、糖原合成、糖酵解等胰島素代謝反應[20-22]。GSK-3是一種廣泛存在于真核生物體內的多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有兩種亞型：GSK-3α和GSK-3β，在氨基酸排列順序上二者有85%的同源性。GSK-3β是糖原合成途徑中的關鍵酶，正常情況下，GSK-3β是有活性的，可通過使糖原合成酶磷酸化失活，抑制糖原合成，導致血糖升高[9]。GSK-3β為Akt的直接底物，活化的Akt可使GSK-3β的Ser9位點磷酸化，導致GSK-3β失活，糖原合成增加[23]，此過程依賴Akt的參與[24]。因此，PI3K、Akt和GSK-3β形成骨骼肌中胰島素調節糖原合成的信號級聯系統中一個重要通路。本研究中，經棕櫚酸處理的L6大鼠成肌細胞，其胰島素敏感性明顯降低，細胞處于胰島素抵抗狀態。細胞經Ghrelin處理后，pAkt表達增加，進而增加pGSK-3β表達，抑制GSK-3β活性，促進糖原合成，最終使GLUT-4從細胞質轉位到細胞膜表面，將葡萄糖轉入細胞內。GLUT-4的膜表達增加，細胞葡萄糖攝取量也有所提高，細胞胰島素抵抗得以改善。而在PI3K阻斷劑存在時，這種改善作用消失。
綜上所述，棕櫚酸可引起骨骼肌細胞胰島素信號通路缺陷，造成胰島素抵抗，而Ghrelin通過PI3K/ Akt/GSK-3β通路緩解L6大鼠成肌細胞胰島素抵抗。本研究也為改善2型糖尿病患者周圍組織胰島素抵抗狀態提供新的思路。而非酰化Ghrelin和瘦素也是Ghrelin在機體存在的重要形式[25]，其與Ghrelin之間有何相互作用，有待進一步研究證實。
