引用本文： 錢昌林, 劉驊, 沈志勇, 季福, 蔡端. 運甲狀腺素蛋白在膽固醇結石膽囊組織中的表達及其促成核作用研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(6): 716-720. doi: 10.7507/1007-9424.20140170 復制
運甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）又名前白蛋白，主要在肝臟細胞中合成。其主要的生理功能是運輸甲狀腺素和維生素A [1-3]。由于其半衰期很短，僅約1.9 d [4]，因此其血漿濃度測定可用于了解蛋白質營養狀況，在評估肝功能不全方面較白蛋白（ALB）和轉鐵蛋白更具敏感性。TTR與血漿中的視黃醇和視黃醇結合蛋白（retinol binding protein，RBP）形成復合體后，再通過肝臟運輸到外周組織。RBP和TTR一般以數量1︰1的比例結合成復合體在血液中循環。有研究[5-6]利用質譜法分析了復合體中2種蛋白質的相互作用，證實每個TTR四聚體最多可以結合兩分子RBP。目前認為，多因素綜合作用導致膽固醇結石的形成，包括熱力學體系失平衡，促、抑成核因子比例失衡及膽道運動功能紊亂[7]。研究[8]表明，膽固醇結石組和正常對照組膽囊膽汁、膽汁微膠粒相和泡相中RBP表達的差異均有統計學意義；且體外模擬膽汁體系實驗[9]表明，RBP是一種重要的促成核因子，其加速了膽固醇結晶形成，縮短了成核時間。比較蛋白質組學研究[10]結果提示，TTR在膽固醇結石患者膽囊組織中的表達水平高于正常人群。本實驗通過逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）及Western blot技術檢測了TTR基因及其蛋白在膽固醇結石患者和正常人膽囊組織中的表達；同時在構建不同模擬膽汁體系的基礎上，運用Holan成核時間法探討TTR的促成核效應[11-12]，為探討膽固醇結石的成因提供實驗依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
收集上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院及復旦大學附屬華山醫院普外科2010年11月至2012年4月期間施行擇期膽囊切除術的25例膽固醇結石患者的膽囊組織（膽固醇結石組）。其中男13例，女12例；年齡35～71歲，中位年齡為53.0歲。所有病例均經B超檢查和病理學檢查確診。收集2010年11月至2011年5月期間肝移植供體的9例膽囊組織作為正常對照組（膽囊正常無病變，來自上述2所醫院，于肝移植供體等待手術時取出膽囊組織放置于液氮中），其中男7例，女2例；年齡24～45歲，中位年齡為34.5歲。本研究經仁濟醫院倫理委員會批準。
1.2 主要材料、試劑及設備
1.2.1 主要試劑和材料
膽紅素Ⅸa購于Fluka公司，兔抗人TTR單克隆抗體購于Abcam公司，TTR、α1-酸性糖蛋白、膽固醇、卵磷脂、牛磺脫氧膽酸鈉及三羥甲基氨基甲烷（Tris）購于Sigma公司，甲醇、依地酸鈉、氯仿、疊氮鈉及乙醇鈉購于上海信帆生物科技公司，RNA提取試劑Trizol和莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）反轉錄酶購自Promega公司，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）等試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）購于Millipore公司，醫用Kodak X-感光片購自上海西巴斯技術公司，增強化學發光（ECL）試劑盒購自博鑫生物工程公司。
1.2.2 主要儀器
Western blot儀（Mini-PROTEAN?Tetra）為美國Bio-Rad公司產品，光學顯微鏡（E200）為日本尼康公司產品，RT-PCR儀（CFX96 TouchTM）為德國Biotron公司產品，高速低溫離心機（Stratos）為Biofuge公司產品，分光光度計（722N）為上海科學儀器公司產品。
1.3 方法
1.3.1 人工模擬膽汁體系的制備
Small模擬膽汁的制備方法采用改良Kibe法[13]，綜合模擬膽汁的制備參考文獻[14]的方法（其成分比例見表 1）。
表1
模擬膽汁配置成分比例表（CSI=1.2）
Table1.
The composition of model bile system（CSI=1.2）
1.3.2 RT-PCR法檢測TTR基因的表達
①RNA提取及逆轉錄。取于液氮中保存的2組膽囊組織置入離心管中，加入1.0 mL Trizol液充分勻漿，4 ℃離心10 min（12 000 r/min，r=8 cm）；按1.0 mL RNA rose（異硫氰酸胍）使用200.0 μL的比例加入氯仿，室溫放置15 min；4 ℃離心15 min（12 000 r/min，r=8 cm），加入等體積異丙醇，繼續4 ℃離心15 min（12 000 r/min，r=8 cm）；小心棄上清液，加入75%乙醇后再4 ℃離心5 min（7 500 r/min，r=8 cm），棄上清，室溫靜置10 min使RNA沉淀；加入50.0 μL無核酶水溶解RNA。抽提RNA后，測定樣品在260 nm和280 nm處的吸光度值（A值），確定RNA的濃度和純度。A260/A280應在1.8～2.0之間。樣本保存于-70 ℃冰箱中。將RNA逆轉錄為cDNA，逆轉錄操作按試劑盒說明書進行。②PCR法擴增TTR及磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因。GAPDH基因：上游引物序列為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列為5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′（擴增長度為672 bp）。TTR基因：上游引物序列為5′-GGCTCACCACAGATGAGAAGTTC-3′，下游引物序列為5′-ACAAATGGGAGCTACTGCTTTGGC-3′（擴增長度為269 bp）。引物均由上海康成生物工程公司合成。擴增條件：95 ℃ 5 min熱啟動；95 ℃30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，擴增30循環；72 ℃保溫10 min。擴增反應體系：10×Taq Buffer 5.0 μL，dNTP（10 mmol/L）4.0 μL，上下游引物各1.0 μL，Taq酶0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，最后滴加ddH2O至50.0 μL。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳1～2 h。電泳結束后，紫外線下觀察電泳后的凝膠，拍照保存。采用Quantity One軟件進行圖片分析，以TTR mRNA和GAPDH mRNA灰度值的比值作為TTR mRNA的相對表達量。
1.3.3 Western blot法檢測TTR蛋白的表達
將完整的膽囊組織放入等滲生理鹽水中浸泡，加入液氮冷凍后研磨至粉末狀；加入裂解液完全覆蓋研磨粉末，繼續超聲裂解6～10次，每次5 min；置于冰上3 h后，4 ℃下高速離心（15 000 r/min，r=8 cm）1 h，取其上清液放至離心管中。蛋白定量采用考馬斯亮藍法（Bradford法）[15]。上清液經聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉至PVDF膜，以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗〔兔抗人TTR單克隆抗體（1︰1 000）〕4 ℃過夜后，再加入二抗〔HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體（1︰3 000）〕室溫孵育2 h，最后采用ECL法進行化學發光，暗室下行X-感光片曝光、顯影、定影并掃描記錄。以TTR蛋白和GAPDH的灰度值比值作為TTR蛋白的相對表達量。
1.3.4 成核時間（NT）以及成核活性的測定
取Small模擬膽汁和綜合模擬膽汁各分為2組：TTR組和ALB組（對照組），每組4份，每份480.0 μL，37 ℃恒溫超速離心0.5 h（45 000 r/min，r=8 cm）后去除結晶碎片，分別加入TTR或ALB（50 μg /份），靜置入37 ℃恒溫培養箱中培養，每24小時在顯微鏡下觀察膽固醇結晶的析出情況，連續觀察21 d。NT采用Holan成核時間法[11]測定，而成核活性則采用Holzbach法[12]計算。
1.4 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 2組膽囊組織中TTR基因及其蛋白的表達
RT-PCR結果顯示，膽固醇結石組TTR mRNA的表達量為1.51±0.78，高于正常對照組的0.85±
0.63（P<0.05）；Western blot結果顯示，膽固醇結石組TTR蛋白的表達量為3.95±0.09，高于正常對照組的1.53±0.08（P<0.05），見圖 1。
圖1
示2組患者膽囊組織中TTR mRNA及其蛋白的電泳結果。1：正常對照組；2：膽固醇結石組；1A：TTR mRNA；1B：TTR蛋白
Figure1.
Electrophoresis results of TTR mRNA and its protein in gallbladder tissues of 2 groups. 1：Normal control group；2：Cholesterol stones group；1A：TTR mRNA；1B：TTR protein
2.2 膽固醇結晶成核時間和成核活性
至21 d時，在Small模擬膽汁體系中，TTR組膽固醇結晶的NT為（14.5±1.3）d，ALB組為（18.0±0.8）d，2組比較差異有統計學意義（P<0.01），TTR組較短；以ALB作比較，可計算出TTR在Small模擬膽汁體系中的成核活性為0.81。在綜合模擬膽汁體系中，TTR組膽固醇結晶的NT為（13.5±0.6）d，ALB組為（18.5±1.3）d，2組比較差異有統計學意義（P<0.01），TTR組較短；綜合模擬膽汁體系中TTR的成核活性為0.73。該結果表明，TTR有加速膽固醇結晶成核的作用。
2.3 膽固醇成核和結晶過程的形態學觀察結果
Small模擬膽汁體系中的膽固醇結晶形成步驟：膽汁泡聚集繼而融合形成復合膽汁泡，復合膽汁泡呈散在分布、大小不等，其中央逐漸形成成核，最終導致膽固醇結晶的形成。含ALB的Small模擬膽汁體系在18 d開始形成片狀膽固醇結晶；含TTR的Small模擬膽汁體系在9 d開始形成片狀結晶，在17 d已形成片狀和團簇狀結晶（圖 2和圖 3）。
圖2
示含ALB的Small模擬膽汁體系中膽固醇成核和結晶（黑箭）的形態學動態變化（ ×10）。2A：2 d；2B：4 d；2C：18 d；2D：20 d ? ?圖 3 示含TTR的Small模擬膽汁體系中膽固醇成核和結晶（黑箭）的形態學動態變化（ ×10）。3A：1 d；3B：3 d；3C：9 d；3D：17 d
Figure2.
Changes of cholesterol nucleation and crystal morphology dynamic （black arrow）in small model bile system which contained ALB （ ×10）. 2A：2 d；2B：4 d；2C：18 d；2D：20 d ? ?Figure 3 Changes of cholesterol nucleation and crystal morphology dynamic （black arrow）in small model bile system which contained TTR （ ×10）. 3A：1 d；3B：3 d；3C：9 d；3D：17 d
3 討論
3.1 TTR的研究現狀
TTR主要在肝臟細胞中合成，少部分形成于腦部的脈絡叢或由眼底的感光組織合成，其半衰期很短，僅約1.9 d [4]，其生理功能主要是運輸甲狀腺素和維生素A。其在一般的醋酸纖維素薄膜電泳時不易看到，需用改進的緩沖液和新鮮血清方可見到。研究[16]表明，TTR基因的點突變與家族性淀粉樣多發性神經病變密切相關，因為該基因的突變導致相應的蛋白結構出現變化，使得這些原本為水溶性的蛋白變成類淀粉蛋白纖維，在細胞外沉積而致病。這些沉積的纖維性蛋白會集結在臟器、血管、心臟、胃腸道等，特別是集結在周圍神經系統而導致不同的癥狀與病變。通常此類患者血液中的TTR含量較低。
研究[17]表明，血清中TTR表達水平的升高與糖尿病密切相關。Refai等[18]的研究表明，TTR四聚體轉化為單聚體過程中，可能會促使胰島β細胞發生功能障礙，從而導致糖尿病的發生。Sundsten等[19]運用SDS-PAGE電泳和表面增強激光解析離子化飛行時間質譜（SELDI-TOF MS）技術分析了正常糖耐量受試者與2型糖尿病患者血清中TTR的表達水平，結果表明，TTR在糖尿病患者中的表達上調。糖尿病與膽固醇結石的發病密切相關，而糖尿病易引起脂肪代謝障礙、內臟自主神經功能紊亂及微血管病變，推測TTR可能誘使膽汁中膽固醇、膽汁酸及磷脂的比例失調而致結石形成。這使我們將焦點集中于研究TTR在結石形成中的作用。
迄今為止（至2013年），鮮有研究報道膽固醇結石形成與TTR的關系。膽固醇結石是多因素作用的結果，其本質是一種代謝紊亂性疾病，其中蛋白及脂類的代謝異常是其主要原因[20-21]。有研究[22]測定了204例膽結石患者血清TTR的表達水平，結果表明，與無肝膽系統及心血管系統疾病的其他疾病患者比較，結石組患者靜脈血中TTR的表達水平升高（P<0.01），可能與其參與形成結石構架、加速結石成核和生長有關，提示其是膽結石形成的敏感因素。在人體代謝過程中，TTR與血漿中的視黃醇和RBP形成復合體后，再從肝臟運輸到外周組織。RBP與TTR的關系密切，而RBP與糖脂類代謝疾病如胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征均密切相關[23]。研究[8, 23-24]表明，RBP在膽固醇結石患者中的表達水平高于正常人群，膽汁泡相的濃度較微膠粒相升高，在體外模擬膽汁體系中具有促成核活性。
3.2 TTR的促成核作用
本實驗通過體外模擬膽汁體系研究了TTR在膽固醇結石形成過程中的促成核作用。Western blot和RT-PCR結果表明膽固醇結石組患者膽囊組織中TTR基因及其蛋白的表達上調。在Small模擬膽汁體系和綜合模擬膽汁體系中，TTR組的NT均短于ALB組，其成核活性分別為0.81和0.73，表明TTR能縮短膽固醇結晶的成核時間。此外，本實驗還觀察到了模擬膽汁體系中的結晶形成步驟：膽汁泡聚集、融合形成復合膽汁泡后，進一步形成膽固醇片狀結晶；ALB組在18 d開始形成膽固醇片狀結晶，而TTR組在9 d即開始形成片狀結晶，在17 d已形成團簇狀結晶，初步說明了TTR具有促成核功能。筆者推測，TTR可能經膽囊黏膜分泌到膽汁中，影響膽固醇、膽汁酸及磷脂三者的比例，從而發揮促成核作用，促使膽固醇結石形成。
綜上所述，TTR與糖脂類代謝疾病密切相關[25-27]。本實驗結果表明，TTR在膽固醇結石患者膽囊組織中的表達上調，且在體外模擬膽汁體系中表現出促成核活性，其可能參與了膽固醇結石的發生和發展過程，但其具體的體內代謝機理有待于進一步深入研究。
運甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）又名前白蛋白，主要在肝臟細胞中合成。其主要的生理功能是運輸甲狀腺素和維生素A [1-3]。由于其半衰期很短，僅約1.9 d [4]，因此其血漿濃度測定可用于了解蛋白質營養狀況，在評估肝功能不全方面較白蛋白（ALB）和轉鐵蛋白更具敏感性。TTR與血漿中的視黃醇和視黃醇結合蛋白（retinol binding protein，RBP）形成復合體后，再通過肝臟運輸到外周組織。RBP和TTR一般以數量1︰1的比例結合成復合體在血液中循環。有研究[5-6]利用質譜法分析了復合體中2種蛋白質的相互作用，證實每個TTR四聚體最多可以結合兩分子RBP。目前認為，多因素綜合作用導致膽固醇結石的形成，包括熱力學體系失平衡，促、抑成核因子比例失衡及膽道運動功能紊亂[7]。研究[8]表明，膽固醇結石組和正常對照組膽囊膽汁、膽汁微膠粒相和泡相中RBP表達的差異均有統計學意義；且體外模擬膽汁體系實驗[9]表明，RBP是一種重要的促成核因子，其加速了膽固醇結晶形成，縮短了成核時間。比較蛋白質組學研究[10]結果提示，TTR在膽固醇結石患者膽囊組織中的表達水平高于正常人群。本實驗通過逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）及Western blot技術檢測了TTR基因及其蛋白在膽固醇結石患者和正常人膽囊組織中的表達；同時在構建不同模擬膽汁體系的基礎上，運用Holan成核時間法探討TTR的促成核效應[11-12]，為探討膽固醇結石的成因提供實驗依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
收集上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院及復旦大學附屬華山醫院普外科2010年11月至2012年4月期間施行擇期膽囊切除術的25例膽固醇結石患者的膽囊組織（膽固醇結石組）。其中男13例，女12例；年齡35～71歲，中位年齡為53.0歲。所有病例均經B超檢查和病理學檢查確診。收集2010年11月至2011年5月期間肝移植供體的9例膽囊組織作為正常對照組（膽囊正常無病變，來自上述2所醫院，于肝移植供體等待手術時取出膽囊組織放置于液氮中），其中男7例，女2例；年齡24～45歲，中位年齡為34.5歲。本研究經仁濟醫院倫理委員會批準。
1.2 主要材料、試劑及設備
1.2.1 主要試劑和材料
膽紅素Ⅸa購于Fluka公司，兔抗人TTR單克隆抗體購于Abcam公司，TTR、α1-酸性糖蛋白、膽固醇、卵磷脂、牛磺脫氧膽酸鈉及三羥甲基氨基甲烷（Tris）購于Sigma公司，甲醇、依地酸鈉、氯仿、疊氮鈉及乙醇鈉購于上海信帆生物科技公司，RNA提取試劑Trizol和莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）反轉錄酶購自Promega公司，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）等試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）購于Millipore公司，醫用Kodak X-感光片購自上海西巴斯技術公司，增強化學發光（ECL）試劑盒購自博鑫生物工程公司。
1.2.2 主要儀器
Western blot儀（Mini-PROTEAN?Tetra）為美國Bio-Rad公司產品，光學顯微鏡（E200）為日本尼康公司產品，RT-PCR儀（CFX96 TouchTM）為德國Biotron公司產品，高速低溫離心機（Stratos）為Biofuge公司產品，分光光度計（722N）為上海科學儀器公司產品。
1.3 方法
1.3.1 人工模擬膽汁體系的制備
Small模擬膽汁的制備方法采用改良Kibe法[13]，綜合模擬膽汁的制備參考文獻[14]的方法（其成分比例見表 1）。
表1
模擬膽汁配置成分比例表（CSI=1.2）
Table1.
The composition of model bile system（CSI=1.2）
1.3.2 RT-PCR法檢測TTR基因的表達
①RNA提取及逆轉錄。取于液氮中保存的2組膽囊組織置入離心管中，加入1.0 mL Trizol液充分勻漿，4 ℃離心10 min（12 000 r/min，r=8 cm）；按1.0 mL RNA rose（異硫氰酸胍）使用200.0 μL的比例加入氯仿，室溫放置15 min；4 ℃離心15 min（12 000 r/min，r=8 cm），加入等體積異丙醇，繼續4 ℃離心15 min（12 000 r/min，r=8 cm）；小心棄上清液，加入75%乙醇后再4 ℃離心5 min（7 500 r/min，r=8 cm），棄上清，室溫靜置10 min使RNA沉淀；加入50.0 μL無核酶水溶解RNA。抽提RNA后，測定樣品在260 nm和280 nm處的吸光度值（A值），確定RNA的濃度和純度。A260/A280應在1.8～2.0之間。樣本保存于-70 ℃冰箱中。將RNA逆轉錄為cDNA，逆轉錄操作按試劑盒說明書進行。②PCR法擴增TTR及磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因。GAPDH基因：上游引物序列為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列為5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′（擴增長度為672 bp）。TTR基因：上游引物序列為5′-GGCTCACCACAGATGAGAAGTTC-3′，下游引物序列為5′-ACAAATGGGAGCTACTGCTTTGGC-3′（擴增長度為269 bp）。引物均由上海康成生物工程公司合成。擴增條件：95 ℃ 5 min熱啟動；95 ℃30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，擴增30循環；72 ℃保溫10 min。擴增反應體系：10×Taq Buffer 5.0 μL，dNTP（10 mmol/L）4.0 μL，上下游引物各1.0 μL，Taq酶0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，最后滴加ddH2O至50.0 μL。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳1～2 h。電泳結束后，紫外線下觀察電泳后的凝膠，拍照保存。采用Quantity One軟件進行圖片分析，以TTR mRNA和GAPDH mRNA灰度值的比值作為TTR mRNA的相對表達量。
1.3.3 Western blot法檢測TTR蛋白的表達
將完整的膽囊組織放入等滲生理鹽水中浸泡，加入液氮冷凍后研磨至粉末狀；加入裂解液完全覆蓋研磨粉末，繼續超聲裂解6～10次，每次5 min；置于冰上3 h后，4 ℃下高速離心（15 000 r/min，r=8 cm）1 h，取其上清液放至離心管中。蛋白定量采用考馬斯亮藍法（Bradford法）[15]。上清液經聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉至PVDF膜，以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗〔兔抗人TTR單克隆抗體（1︰1 000）〕4 ℃過夜后，再加入二抗〔HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體（1︰3 000）〕室溫孵育2 h，最后采用ECL法進行化學發光，暗室下行X-感光片曝光、顯影、定影并掃描記錄。以TTR蛋白和GAPDH的灰度值比值作為TTR蛋白的相對表達量。
1.3.4 成核時間（NT）以及成核活性的測定
取Small模擬膽汁和綜合模擬膽汁各分為2組：TTR組和ALB組（對照組），每組4份，每份480.0 μL，37 ℃恒溫超速離心0.5 h（45 000 r/min，r=8 cm）后去除結晶碎片，分別加入TTR或ALB（50 μg /份），靜置入37 ℃恒溫培養箱中培養，每24小時在顯微鏡下觀察膽固醇結晶的析出情況，連續觀察21 d。NT采用Holan成核時間法[11]測定，而成核活性則采用Holzbach法[12]計算。
1.4 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 2組膽囊組織中TTR基因及其蛋白的表達
RT-PCR結果顯示，膽固醇結石組TTR mRNA的表達量為1.51±0.78，高于正常對照組的0.85±
0.63（P<0.05）；Western blot結果顯示，膽固醇結石組TTR蛋白的表達量為3.95±0.09，高于正常對照組的1.53±0.08（P<0.05），見圖 1。
圖1
示2組患者膽囊組織中TTR mRNA及其蛋白的電泳結果。1：正常對照組；2：膽固醇結石組；1A：TTR mRNA；1B：TTR蛋白
Figure1.
Electrophoresis results of TTR mRNA and its protein in gallbladder tissues of 2 groups. 1：Normal control group；2：Cholesterol stones group；1A：TTR mRNA；1B：TTR protein
2.2 膽固醇結晶成核時間和成核活性
至21 d時，在Small模擬膽汁體系中，TTR組膽固醇結晶的NT為（14.5±1.3）d，ALB組為（18.0±0.8）d，2組比較差異有統計學意義（P<0.01），TTR組較短；以ALB作比較，可計算出TTR在Small模擬膽汁體系中的成核活性為0.81。在綜合模擬膽汁體系中，TTR組膽固醇結晶的NT為（13.5±0.6）d，ALB組為（18.5±1.3）d，2組比較差異有統計學意義（P<0.01），TTR組較短；綜合模擬膽汁體系中TTR的成核活性為0.73。該結果表明，TTR有加速膽固醇結晶成核的作用。
2.3 膽固醇成核和結晶過程的形態學觀察結果
Small模擬膽汁體系中的膽固醇結晶形成步驟：膽汁泡聚集繼而融合形成復合膽汁泡，復合膽汁泡呈散在分布、大小不等，其中央逐漸形成成核，最終導致膽固醇結晶的形成。含ALB的Small模擬膽汁體系在18 d開始形成片狀膽固醇結晶；含TTR的Small模擬膽汁體系在9 d開始形成片狀結晶，在17 d已形成片狀和團簇狀結晶（圖 2和圖 3）。
圖2
示含ALB的Small模擬膽汁體系中膽固醇成核和結晶（黑箭）的形態學動態變化（ ×10）。2A：2 d；2B：4 d；2C：18 d；2D：20 d ? ?圖 3 示含TTR的Small模擬膽汁體系中膽固醇成核和結晶（黑箭）的形態學動態變化（ ×10）。3A：1 d；3B：3 d；3C：9 d；3D：17 d
Figure2.
Changes of cholesterol nucleation and crystal morphology dynamic （black arrow）in small model bile system which contained ALB （ ×10）. 2A：2 d；2B：4 d；2C：18 d；2D：20 d ? ?Figure 3 Changes of cholesterol nucleation and crystal morphology dynamic （black arrow）in small model bile system which contained TTR （ ×10）. 3A：1 d；3B：3 d；3C：9 d；3D：17 d
3 討論
3.1 TTR的研究現狀
TTR主要在肝臟細胞中合成，少部分形成于腦部的脈絡叢或由眼底的感光組織合成，其半衰期很短，僅約1.9 d [4]，其生理功能主要是運輸甲狀腺素和維生素A。其在一般的醋酸纖維素薄膜電泳時不易看到，需用改進的緩沖液和新鮮血清方可見到。研究[16]表明，TTR基因的點突變與家族性淀粉樣多發性神經病變密切相關，因為該基因的突變導致相應的蛋白結構出現變化，使得這些原本為水溶性的蛋白變成類淀粉蛋白纖維，在細胞外沉積而致病。這些沉積的纖維性蛋白會集結在臟器、血管、心臟、胃腸道等，特別是集結在周圍神經系統而導致不同的癥狀與病變。通常此類患者血液中的TTR含量較低。
研究[17]表明，血清中TTR表達水平的升高與糖尿病密切相關。Refai等[18]的研究表明，TTR四聚體轉化為單聚體過程中，可能會促使胰島β細胞發生功能障礙，從而導致糖尿病的發生。Sundsten等[19]運用SDS-PAGE電泳和表面增強激光解析離子化飛行時間質譜（SELDI-TOF MS）技術分析了正常糖耐量受試者與2型糖尿病患者血清中TTR的表達水平，結果表明，TTR在糖尿病患者中的表達上調。糖尿病與膽固醇結石的發病密切相關，而糖尿病易引起脂肪代謝障礙、內臟自主神經功能紊亂及微血管病變，推測TTR可能誘使膽汁中膽固醇、膽汁酸及磷脂的比例失調而致結石形成。這使我們將焦點集中于研究TTR在結石形成中的作用。
迄今為止（至2013年），鮮有研究報道膽固醇結石形成與TTR的關系。膽固醇結石是多因素作用的結果，其本質是一種代謝紊亂性疾病，其中蛋白及脂類的代謝異常是其主要原因[20-21]。有研究[22]測定了204例膽結石患者血清TTR的表達水平，結果表明，與無肝膽系統及心血管系統疾病的其他疾病患者比較，結石組患者靜脈血中TTR的表達水平升高（P<0.01），可能與其參與形成結石構架、加速結石成核和生長有關，提示其是膽結石形成的敏感因素。在人體代謝過程中，TTR與血漿中的視黃醇和RBP形成復合體后，再從肝臟運輸到外周組織。RBP與TTR的關系密切，而RBP與糖脂類代謝疾病如胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征均密切相關[23]。研究[8, 23-24]表明，RBP在膽固醇結石患者中的表達水平高于正常人群，膽汁泡相的濃度較微膠粒相升高，在體外模擬膽汁體系中具有促成核活性。
3.2 TTR的促成核作用
本實驗通過體外模擬膽汁體系研究了TTR在膽固醇結石形成過程中的促成核作用。Western blot和RT-PCR結果表明膽固醇結石組患者膽囊組織中TTR基因及其蛋白的表達上調。在Small模擬膽汁體系和綜合模擬膽汁體系中，TTR組的NT均短于ALB組，其成核活性分別為0.81和0.73，表明TTR能縮短膽固醇結晶的成核時間。此外，本實驗還觀察到了模擬膽汁體系中的結晶形成步驟：膽汁泡聚集、融合形成復合膽汁泡后，進一步形成膽固醇片狀結晶；ALB組在18 d開始形成膽固醇片狀結晶，而TTR組在9 d即開始形成片狀結晶，在17 d已形成團簇狀結晶，初步說明了TTR具有促成核功能。筆者推測，TTR可能經膽囊黏膜分泌到膽汁中，影響膽固醇、膽汁酸及磷脂三者的比例，從而發揮促成核作用，促使膽固醇結石形成。
綜上所述，TTR與糖脂類代謝疾病密切相關[25-27]。本實驗結果表明，TTR在膽固醇結石患者膽囊組織中的表達上調，且在體外模擬膽汁體系中表現出促成核活性，其可能參與了膽固醇結石的發生和發展過程，但其具體的體內代謝機理有待于進一步深入研究。
