引用本文： 孫葉飛, 周建平. 胃癌組織中miR-497表達及其生物學意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(5): 609-613. doi: 10.7507/1007-9424.20140146 復制
微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為17～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，其通過與靶mRNA的3′-UTR互補結合，抑制或降解靶mRNA的翻譯來調節基因的表達，miRNA參與腫瘤的增殖、分化、凋亡、組織器官形成等多個病理生理過程[1-2]。研究[3]表明，miRNA的異常表達參與了多種疾病包括腫瘤的發生、發展，因此，miRNA在腫瘤中的研究更成為熱點。胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤，目前已發現一些在胃癌中異常表達的miRNA，如miR-363、miR-202、miR-145、miR-20a等[4]。而miR-497在肝癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]等腫瘤中發揮著抑癌基因的功能，但其在胃癌中的表達及功能尚未有深入研究。本研究采用熒光實時定量PCR法，檢測miR-497在胃癌組織以及與其對應的癌旁組織中的表達情況，同時通過miRNA數據庫預測miR-497的靶基因，RT-PCR和Western blot對miR-497的靶基因進行驗證，對miR-497在胃癌發生、發展中的作用機制進行初步的探索。
1 資料與方法
1.1 材料
1.1.1 組織
收集2010～2013年期間中國醫科大學附屬第一醫院胃腸外科的標本，均已告知患者并取得患者同意，行外科手術切除的胃癌及癌旁組織標本94例，男43例，女51例；年齡28～81歲，平均61.4歲。所有病例術前均未行放化療，均經病理診斷證實。獲取新鮮組織標本后，肉眼下剔除腫瘤的壞死部分、肌肉和脂肪，用生理鹽水沖洗后在液體氮中速凍后移入-80℃冰箱備用。
1.1.2 細胞
人胃癌細胞株SGC-7901來源于中國醫科大學細胞生物學實驗室，在37℃、50 mL/L CO2孵箱、含10% FBS的Hyclone1640培養基中培養。
1.1.3 引物及主要試劑
由miRBase數據庫（http：//microrna.sanger.ac.uk/）查找基因序列，用軟件Primer-Express 2.0進行引物設計。miR-497上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGCAGCAGCACACTGTG-3′，下游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG-GCAATTCAGTTGAGACAAACCA-3′；內參U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；BCL2L2上游引物為5′-GTTCAGGGTAAGATTTTATTT-3′，下游引物為5′-GTTCAGTCCTTCTCATTAAAC-3′，上述引物均由金斯瑞公司合成。TRIzol試劑，Invi-trogen公司；miR-497模擬體（mimics）及模擬體陰性對照，吉瑪基因有限公司；MTT試劑盒，Sigma公司；蛋白抽提試劑盒，上海卓康生物科技有限公司；BCL2L2抗體，Bio world，美國；GAPDH抗體，碧云天公司；逆轉錄試劑盒，Takara公司，日本；熒光定量Real-time PCR試劑盒，Takara公司，日本。
1.2 RT-PCR法檢測胃癌及癌旁組織和細胞系中mRNA表達
1.2.1 總RNA提取
取約100 mg冰凍新鮮胃癌組織放在盛有液氮的研缽中碾碎，移入放有1 mL TRIzol試劑的平底EP管內。高速勻漿機將組織進一步粉碎。室溫放置5 min后，于室溫下12 000 r/min（r=6 cm）離心15 min。將上清移至EP管中，加入200μL的氯仿，室溫下顛倒混勻5 min。4℃條件下，12 000 r/min（r=6 cm）離心15 min。利用異丙醇沉淀RNA，以75%冰乙醇清洗沉淀。在空氣條件下等待沉淀干燥后，DEPC水30μL溶解RNA。紫外分光光度計對提取的總RNA進行純度和含量鑒定。
1.2.2 逆轉錄反應
由于miRNA長度僅有20個核苷酸左右，不能用傳統的實時RT-PCR檢測。逆轉錄引物需設計成特殊的莖環結構來完成cDNA的生成。引物序列見上述。
1.2.3 miRNA末端序列
室溫加樣：RNA 2μg，5×miRNA Reaction Buffer 5μL，25 mmol/L MgCl2 2.5μL，Diluted ATP（4 mmol/L）1μL，PolyA末端序列加尾酶0.5μL，DEPC水調體積至25μL。混勻，37℃孵育15 min。
1.2.4 第一鏈cDNA合成
室溫加樣：已加PolyA末端序列的RNA 4μL，RT Primer（25μmol/L）3μL，65℃孵育5 min后離心管置冰上1 min。加入2×RT Reaction Mix 10μL，SuperScriptⅢRT/RNase-OUT Enzyme Mix 2μL，DEPC水調至終體積20μL。輕輕混勻。反應條件為：50℃孵育50 min，85℃孵育5 min，反應產物置冰上，儲存于-80℃冰箱。
1.2.5 標準樣品制備
選用1管高濃度的總RNA標本，逆轉為cDNA，以蒸餾水連續10倍稀釋成5管，分裝后凍存于-80℃冰箱，作為標準品備用。
1.2.6 實時RT-PCR測定成熟miRNA反應體系
2×SYBR Premix Ex Taq 10μL，10μmol/L上游引物0.4μL，10μmol/L下游引物0.4μL，cDNA模板2μL，DEPC水20μL。輕輕混勻，4 000 r/min（r=10 cm）離心3 min，在Bio-Rad IQ5熒光實時定量PCR儀上進行兩步法RT-PCR反應。反應參數：94℃30 s，60℃60 s，共進行40個循環。同時設不加模板的反應管作陰性對照。每個樣本重復3個平行管。反應結束，溶解曲線確定反應為特異性擴增，通過Bio-Rad IQ5 Comparative quantitation分析程序，以U6 snRNA為內參，分析樣本中miRNA的表達。miR-497的絕對表達量采用標準曲線方法計算求得，再將結果進行log10轉化。以U6 snRNA為內參，算得miR-497的相對表達量。
1.3 miR-497-mimics及陰性對照轉染胃癌SGC-7901細胞系及鑒定轉染效果
取對數生長期的SGC-7901細胞消化下來鋪入6孔板，每孔2.0×105個細胞培養過夜，按照Lipo-fectamine2000說明書轉染終濃度為100 nmol/L的miR-497-mimics或陰性對照。RT-PCR鑒定轉染效果。
1.4 Western blot檢測轉染后胃癌SGC-7901細胞系中BCL2L2蛋白表達情況
用PicTar、TargetScan、miRanda等生物信息學軟件預測，發現BCL2L2的3′-UTR區可與miR-497不完全結合。Western blot檢測miR-497是否作用于BCL2L2。將轉染了miR-497-mimics或陰性對照的胃癌SGC-7901細胞加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，4℃16 000×g離心15 min吸取上清。取30μg轉染了miR-497-mimics或陰性對照的胃癌SGC-7901細胞總蛋白加入5×SDS上樣緩沖液100℃變性5 min，5%濃縮膠、10%分離膠80 V恒壓電泳，250 mA恒流轉至PVDF膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，BCL2L2和GAPDH一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后ECL發光液顯影。
1.5 MTT法檢測miR-497-mimics轉染后SGC-7901細胞對5-Fu化療敏感性的改變
取對數生長期的胃癌SGC-7901細胞轉染miR-497-mimics及陰性對照后分別加入96孔板中，每孔100μL，1×104個細胞。每組加入5-FU使終濃度分別為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00μg/mL，每組細胞每個濃度設3個復孔。5% CO2孵箱中培養48 h后，每孔中加入MTT（5 mg/mL）20μL，繼續培養4 h棄去培養液，再加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，微量振蕩約10 min，于自動酶標儀450 nm處測定各孔吸光度（A）值。根據公式“抑制率=（1-實驗組平均A值/對照組平均A值）×100%”計算抑制率，再根據抑制率計算半數抑制濃度（IC50）。
1.6 統計學方法
用SPSS 13.0行統計學分析，miR-497在組織中表達結果用均數±標準差表示，在細胞中的表達用中位數表示，用Wilcoxon秩和檢驗分析miR-497在癌組織和癌旁組織中的差異。Western blot結果采用Graphpad Prism軟件進行數據統計分析和作圖。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 RT-PCR反應效果及特異性
RT-PCR檢測時，樣本中miR-497 cDNA呈指數增長擴增達平臺期，其擴增曲線為一組典型的S型曲線（圖 1A）。溶解曲線中可見溶解溫度均一，峰形單一銳利，反映特異性良好，無非特異擴增、引物二聚體及發夾結構的出現（圖 1B）。
圖1
樣本中miR-497 RT-PCR的反應效果。1A：miR-497擴增曲線；1B：miR-497溶解曲線
Figure1.
RT-PCR reaction of miR-497 in samples. 1A:Amplification curves of miR-497;1B:Dissociation curves of miR-497
2.2 胃癌組織中miR-497 mRNA表達結果
結果見圖 2。胃癌組織中miR-497 mRNA表達較癌旁組織明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.01）。
圖2
miR-497在胃癌組織和癌旁組織中的表達結果。與癌旁組織比較，* P < 0.01??圖 3?miR-497 mRNA在SGC-7901轉染細胞系中的表達結果。1：陰性對照細胞株；2：miR-497-mimics細胞株。與陰性對照細胞株比較，* P < 0.05
Figure2.
Expression of miR-497 in gastric cancer and adjacent to cancer tissues．Compared with adjacent to cancer tissues, * P < 0.01??Figure 3Expression of miR-497 mRNA in transfected SGC-7901 cell line. 1:Negative control cell line; 2:miR-497-mimics cell line. Compared with negative control cell line, * P < 0.05
2.3 RT-PCR法檢測SGC-7901細胞中miR-497-mimics及陰性對照轉染效率
轉染了mimics的SGC-7901細胞中miR-497表達量明顯高于轉染了陰性對照的SGC-7901細胞，差異有統計學意義（P < 0.05），形成miR-497瞬時轉染細胞。見圖 3。
2.4 miR-497與靶基因BCL2L2結合降低其表達
為了進一步闡述miR-497在胃癌中的作用機制，我們用生物信息學軟件預測，發現BCL2L2的3′-UTR區可與miR-497不完全結合（圖 4A）。RT-PCR檢測結果見轉染miR-497-mimics組與陰性對照組BCL2L2 mRNA表達無明顯差別（圖 4B）；Western blot結果見BCL2L2蛋白在陰性對照組細胞中表達明顯強于miR-497-mimics細胞（圖 4C）。
圖4
miR-497下游靶基因BCL2L2表達結果。4A：miR-497與BCL2L2 3′-UTR結合位點。4B：陰性對照及miR-497-mimics轉染后BCL2L2 mRNA的表達。1：陰性對照細胞株；2：miR-497-mimics細胞株。4C：Western blot檢測陰性對照及miR-497-mimics轉染后BCL2L2蛋白的表達。1和3：陰性對照；2和4：miR-497-mimics
Figure4.
Expressions of downtream target gene BCL2L2 of miR-497. 4A:Predicted miR-497 binding sites within BCL2L2 3′-UTR. 4B:Expressions of BCL2L2 mRNA in negative control and miR-497-mimics transfected SGC-7901 cell line. 1:negative control cell line; 2:miR-497-mimics cell line.4C:Expression of BCL2L2 protein in negative control and miR-497-mimics transfected SGC-7901 cell line. 1 and 3:negative control cell line; 2 and 4:miR-497-mimics cell line
2.5 SGC-7901細胞轉染miR-497-mimics及陰性對照后對5-FU化療的敏感性
轉染miR-497-mimics后的胃癌SGC-7901細胞對5-FU的IC50值為（11.45±0.79）μg/mL，明顯低于轉染陰性對照后的胃癌SGC-7901細胞的（24.97±1.31）μg/mL，差異有統計學意義（P=0.004 6）。結果提示，miR-497過表達可提高胃癌SGC-7901細胞對5-FU的敏感性。
3 討論
miRNA是一類具有調控基因表達的小片段非編碼RNA，主要通過與靶基因的mRNA 3′-UTR結合，導致靶基因的mRNA被降解或者翻譯抑制[8-9]。新近研究[10-11]顯示，在大多數哺乳動物中，miRNA與腫瘤發生相關。腫瘤本質上就是一類多基因表達異常的疾病，通過原癌基因的激活和抑癌基因的失活，使細胞逃離正常的生長機制從而導致癌變，多種miRNA在各種腫瘤組織和細胞中的表達水平均有不同程度的上調或下調，提示腫瘤發生與miRNA表達之間有一定的相關性[9, 12]。
miR-497位于人類染色體17p13.1。近來研究[13-14]發現，在結直腸癌及乳腺癌中可通過下調CCNE1抑制腫瘤細胞增殖及轉移，在乳腺癌中發現miR-497下調后降低CHEK1的表達，在結直腸癌中可下調胰島素樣生長因子-1受體表達發揮其抑癌作用。在本研究中，RT-PCR檢測到胃癌組織相較于癌旁組織中的miR-497表達降低，提示miR-497下調也可能參與了胃癌細胞的始發及演進。
通過PicTar、TargetScan、miRanda等生物信息學軟件預測，發現BCL2L2的3′-UTR區可與miR-497不完全結合。BCL2L2是BCL2家族的一分子，與細胞凋亡及細胞生長有關，有可能對腫瘤細胞的遷移和侵襲也有重要作用[15-16]。為了進一步研究二者的關系，我們轉染miR-497進入SGC-7901細胞上調它的表達，發現轉染miR-497-mimics組的細胞中BCL2L2 mRNA的表達較陰性對照細胞沒有變化，而BCL2L2蛋白明顯下調，提示miR-497可作用于BCL2L2，抑制BCL2L2 mRNA的翻譯而調控蛋白的表達。
臨床上胃癌患者術后需5-FU為主的化療以殺滅殘存癌細胞，降低遠處轉移率及術后復發率，延長生存時間，提高5年生存率[17-18]。但胃癌耐藥日益增多，影響化療效果，如何降低化療耐藥性是胃癌研究的一大熱點[19-20]。本研究中，miR-497過表達后，與陰性對照組相比，IC50值下調，化療敏感性明顯提高。提示miR-497可提高化療敏感性，但其具體作用機制尚需進一步實驗研究。
總之，本研究發現，miR-497在胃癌中的表達降低，可部分降低下游BCL2L2的表達；在細胞水平，發現其過表達可提高胃癌細胞對5-FU化療的敏感性。這一結果豐富了胃癌相關miRNA理論，為從分子水平理解胃癌的病因、尋找理想的標志物并探索基因治療提供了有用的靶點。
微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為17～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，其通過與靶mRNA的3′-UTR互補結合，抑制或降解靶mRNA的翻譯來調節基因的表達，miRNA參與腫瘤的增殖、分化、凋亡、組織器官形成等多個病理生理過程[1-2]。研究[3]表明，miRNA的異常表達參與了多種疾病包括腫瘤的發生、發展，因此，miRNA在腫瘤中的研究更成為熱點。胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤，目前已發現一些在胃癌中異常表達的miRNA，如miR-363、miR-202、miR-145、miR-20a等[4]。而miR-497在肝癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]等腫瘤中發揮著抑癌基因的功能，但其在胃癌中的表達及功能尚未有深入研究。本研究采用熒光實時定量PCR法，檢測miR-497在胃癌組織以及與其對應的癌旁組織中的表達情況，同時通過miRNA數據庫預測miR-497的靶基因，RT-PCR和Western blot對miR-497的靶基因進行驗證，對miR-497在胃癌發生、發展中的作用機制進行初步的探索。
1 資料與方法
1.1 材料
1.1.1 組織
收集2010～2013年期間中國醫科大學附屬第一醫院胃腸外科的標本，均已告知患者并取得患者同意，行外科手術切除的胃癌及癌旁組織標本94例，男43例，女51例；年齡28～81歲，平均61.4歲。所有病例術前均未行放化療，均經病理診斷證實。獲取新鮮組織標本后，肉眼下剔除腫瘤的壞死部分、肌肉和脂肪，用生理鹽水沖洗后在液體氮中速凍后移入-80℃冰箱備用。
1.1.2 細胞
人胃癌細胞株SGC-7901來源于中國醫科大學細胞生物學實驗室，在37℃、50 mL/L CO2孵箱、含10% FBS的Hyclone1640培養基中培養。
1.1.3 引物及主要試劑
由miRBase數據庫（http：//microrna.sanger.ac.uk/）查找基因序列，用軟件Primer-Express 2.0進行引物設計。miR-497上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGCAGCAGCACACTGTG-3′，下游引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG-GCAATTCAGTTGAGACAAACCA-3′；內參U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；BCL2L2上游引物為5′-GTTCAGGGTAAGATTTTATTT-3′，下游引物為5′-GTTCAGTCCTTCTCATTAAAC-3′，上述引物均由金斯瑞公司合成。TRIzol試劑，Invi-trogen公司；miR-497模擬體（mimics）及模擬體陰性對照，吉瑪基因有限公司；MTT試劑盒，Sigma公司；蛋白抽提試劑盒，上海卓康生物科技有限公司；BCL2L2抗體，Bio world，美國；GAPDH抗體，碧云天公司；逆轉錄試劑盒，Takara公司，日本；熒光定量Real-time PCR試劑盒，Takara公司，日本。
1.2 RT-PCR法檢測胃癌及癌旁組織和細胞系中mRNA表達
1.2.1 總RNA提取
取約100 mg冰凍新鮮胃癌組織放在盛有液氮的研缽中碾碎，移入放有1 mL TRIzol試劑的平底EP管內。高速勻漿機將組織進一步粉碎。室溫放置5 min后，于室溫下12 000 r/min（r=6 cm）離心15 min。將上清移至EP管中，加入200μL的氯仿，室溫下顛倒混勻5 min。4℃條件下，12 000 r/min（r=6 cm）離心15 min。利用異丙醇沉淀RNA，以75%冰乙醇清洗沉淀。在空氣條件下等待沉淀干燥后，DEPC水30μL溶解RNA。紫外分光光度計對提取的總RNA進行純度和含量鑒定。
1.2.2 逆轉錄反應
由于miRNA長度僅有20個核苷酸左右，不能用傳統的實時RT-PCR檢測。逆轉錄引物需設計成特殊的莖環結構來完成cDNA的生成。引物序列見上述。
1.2.3 miRNA末端序列
室溫加樣：RNA 2μg，5×miRNA Reaction Buffer 5μL，25 mmol/L MgCl2 2.5μL，Diluted ATP（4 mmol/L）1μL，PolyA末端序列加尾酶0.5μL，DEPC水調體積至25μL。混勻，37℃孵育15 min。
1.2.4 第一鏈cDNA合成
室溫加樣：已加PolyA末端序列的RNA 4μL，RT Primer（25μmol/L）3μL，65℃孵育5 min后離心管置冰上1 min。加入2×RT Reaction Mix 10μL，SuperScriptⅢRT/RNase-OUT Enzyme Mix 2μL，DEPC水調至終體積20μL。輕輕混勻。反應條件為：50℃孵育50 min，85℃孵育5 min，反應產物置冰上，儲存于-80℃冰箱。
1.2.5 標準樣品制備
選用1管高濃度的總RNA標本，逆轉為cDNA，以蒸餾水連續10倍稀釋成5管，分裝后凍存于-80℃冰箱，作為標準品備用。
1.2.6 實時RT-PCR測定成熟miRNA反應體系
2×SYBR Premix Ex Taq 10μL，10μmol/L上游引物0.4μL，10μmol/L下游引物0.4μL，cDNA模板2μL，DEPC水20μL。輕輕混勻，4 000 r/min（r=10 cm）離心3 min，在Bio-Rad IQ5熒光實時定量PCR儀上進行兩步法RT-PCR反應。反應參數：94℃30 s，60℃60 s，共進行40個循環。同時設不加模板的反應管作陰性對照。每個樣本重復3個平行管。反應結束，溶解曲線確定反應為特異性擴增，通過Bio-Rad IQ5 Comparative quantitation分析程序，以U6 snRNA為內參，分析樣本中miRNA的表達。miR-497的絕對表達量采用標準曲線方法計算求得，再將結果進行log10轉化。以U6 snRNA為內參，算得miR-497的相對表達量。
1.3 miR-497-mimics及陰性對照轉染胃癌SGC-7901細胞系及鑒定轉染效果
取對數生長期的SGC-7901細胞消化下來鋪入6孔板，每孔2.0×105個細胞培養過夜，按照Lipo-fectamine2000說明書轉染終濃度為100 nmol/L的miR-497-mimics或陰性對照。RT-PCR鑒定轉染效果。
1.4 Western blot檢測轉染后胃癌SGC-7901細胞系中BCL2L2蛋白表達情況
用PicTar、TargetScan、miRanda等生物信息學軟件預測，發現BCL2L2的3′-UTR區可與miR-497不完全結合。Western blot檢測miR-497是否作用于BCL2L2。將轉染了miR-497-mimics或陰性對照的胃癌SGC-7901細胞加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，4℃16 000×g離心15 min吸取上清。取30μg轉染了miR-497-mimics或陰性對照的胃癌SGC-7901細胞總蛋白加入5×SDS上樣緩沖液100℃變性5 min，5%濃縮膠、10%分離膠80 V恒壓電泳，250 mA恒流轉至PVDF膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，BCL2L2和GAPDH一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后ECL發光液顯影。
1.5 MTT法檢測miR-497-mimics轉染后SGC-7901細胞對5-Fu化療敏感性的改變
取對數生長期的胃癌SGC-7901細胞轉染miR-497-mimics及陰性對照后分別加入96孔板中，每孔100μL，1×104個細胞。每組加入5-FU使終濃度分別為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00μg/mL，每組細胞每個濃度設3個復孔。5% CO2孵箱中培養48 h后，每孔中加入MTT（5 mg/mL）20μL，繼續培養4 h棄去培養液，再加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，微量振蕩約10 min，于自動酶標儀450 nm處測定各孔吸光度（A）值。根據公式“抑制率=（1-實驗組平均A值/對照組平均A值）×100%”計算抑制率，再根據抑制率計算半數抑制濃度（IC50）。
1.6 統計學方法
用SPSS 13.0行統計學分析，miR-497在組織中表達結果用均數±標準差表示，在細胞中的表達用中位數表示，用Wilcoxon秩和檢驗分析miR-497在癌組織和癌旁組織中的差異。Western blot結果采用Graphpad Prism軟件進行數據統計分析和作圖。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 RT-PCR反應效果及特異性
RT-PCR檢測時，樣本中miR-497 cDNA呈指數增長擴增達平臺期，其擴增曲線為一組典型的S型曲線（圖 1A）。溶解曲線中可見溶解溫度均一，峰形單一銳利，反映特異性良好，無非特異擴增、引物二聚體及發夾結構的出現（圖 1B）。
圖1
樣本中miR-497 RT-PCR的反應效果。1A：miR-497擴增曲線；1B：miR-497溶解曲線
Figure1.
RT-PCR reaction of miR-497 in samples. 1A:Amplification curves of miR-497;1B:Dissociation curves of miR-497
2.2 胃癌組織中miR-497 mRNA表達結果
結果見圖 2。胃癌組織中miR-497 mRNA表達較癌旁組織明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.01）。
圖2
miR-497在胃癌組織和癌旁組織中的表達結果。與癌旁組織比較，* P < 0.01??圖 3?miR-497 mRNA在SGC-7901轉染細胞系中的表達結果。1：陰性對照細胞株；2：miR-497-mimics細胞株。與陰性對照細胞株比較，* P < 0.05
Figure2.
Expression of miR-497 in gastric cancer and adjacent to cancer tissues．Compared with adjacent to cancer tissues, * P < 0.01??Figure 3Expression of miR-497 mRNA in transfected SGC-7901 cell line. 1:Negative control cell line; 2:miR-497-mimics cell line. Compared with negative control cell line, * P < 0.05
2.3 RT-PCR法檢測SGC-7901細胞中miR-497-mimics及陰性對照轉染效率
轉染了mimics的SGC-7901細胞中miR-497表達量明顯高于轉染了陰性對照的SGC-7901細胞，差異有統計學意義（P < 0.05），形成miR-497瞬時轉染細胞。見圖 3。
2.4 miR-497與靶基因BCL2L2結合降低其表達
為了進一步闡述miR-497在胃癌中的作用機制，我們用生物信息學軟件預測，發現BCL2L2的3′-UTR區可與miR-497不完全結合（圖 4A）。RT-PCR檢測結果見轉染miR-497-mimics組與陰性對照組BCL2L2 mRNA表達無明顯差別（圖 4B）；Western blot結果見BCL2L2蛋白在陰性對照組細胞中表達明顯強于miR-497-mimics細胞（圖 4C）。
圖4
miR-497下游靶基因BCL2L2表達結果。4A：miR-497與BCL2L2 3′-UTR結合位點。4B：陰性對照及miR-497-mimics轉染后BCL2L2 mRNA的表達。1：陰性對照細胞株；2：miR-497-mimics細胞株。4C：Western blot檢測陰性對照及miR-497-mimics轉染后BCL2L2蛋白的表達。1和3：陰性對照；2和4：miR-497-mimics
Figure4.
Expressions of downtream target gene BCL2L2 of miR-497. 4A:Predicted miR-497 binding sites within BCL2L2 3′-UTR. 4B:Expressions of BCL2L2 mRNA in negative control and miR-497-mimics transfected SGC-7901 cell line. 1:negative control cell line; 2:miR-497-mimics cell line.4C:Expression of BCL2L2 protein in negative control and miR-497-mimics transfected SGC-7901 cell line. 1 and 3:negative control cell line; 2 and 4:miR-497-mimics cell line
2.5 SGC-7901細胞轉染miR-497-mimics及陰性對照后對5-FU化療的敏感性
轉染miR-497-mimics后的胃癌SGC-7901細胞對5-FU的IC50值為（11.45±0.79）μg/mL，明顯低于轉染陰性對照后的胃癌SGC-7901細胞的（24.97±1.31）μg/mL，差異有統計學意義（P=0.004 6）。結果提示，miR-497過表達可提高胃癌SGC-7901細胞對5-FU的敏感性。
3 討論
miRNA是一類具有調控基因表達的小片段非編碼RNA，主要通過與靶基因的mRNA 3′-UTR結合，導致靶基因的mRNA被降解或者翻譯抑制[8-9]。新近研究[10-11]顯示，在大多數哺乳動物中，miRNA與腫瘤發生相關。腫瘤本質上就是一類多基因表達異常的疾病，通過原癌基因的激活和抑癌基因的失活，使細胞逃離正常的生長機制從而導致癌變，多種miRNA在各種腫瘤組織和細胞中的表達水平均有不同程度的上調或下調，提示腫瘤發生與miRNA表達之間有一定的相關性[9, 12]。
miR-497位于人類染色體17p13.1。近來研究[13-14]發現，在結直腸癌及乳腺癌中可通過下調CCNE1抑制腫瘤細胞增殖及轉移，在乳腺癌中發現miR-497下調后降低CHEK1的表達，在結直腸癌中可下調胰島素樣生長因子-1受體表達發揮其抑癌作用。在本研究中，RT-PCR檢測到胃癌組織相較于癌旁組織中的miR-497表達降低，提示miR-497下調也可能參與了胃癌細胞的始發及演進。
通過PicTar、TargetScan、miRanda等生物信息學軟件預測，發現BCL2L2的3′-UTR區可與miR-497不完全結合。BCL2L2是BCL2家族的一分子，與細胞凋亡及細胞生長有關，有可能對腫瘤細胞的遷移和侵襲也有重要作用[15-16]。為了進一步研究二者的關系，我們轉染miR-497進入SGC-7901細胞上調它的表達，發現轉染miR-497-mimics組的細胞中BCL2L2 mRNA的表達較陰性對照細胞沒有變化，而BCL2L2蛋白明顯下調，提示miR-497可作用于BCL2L2，抑制BCL2L2 mRNA的翻譯而調控蛋白的表達。
臨床上胃癌患者術后需5-FU為主的化療以殺滅殘存癌細胞，降低遠處轉移率及術后復發率，延長生存時間，提高5年生存率[17-18]。但胃癌耐藥日益增多，影響化療效果，如何降低化療耐藥性是胃癌研究的一大熱點[19-20]。本研究中，miR-497過表達后，與陰性對照組相比，IC50值下調，化療敏感性明顯提高。提示miR-497可提高化療敏感性，但其具體作用機制尚需進一步實驗研究。
總之，本研究發現，miR-497在胃癌中的表達降低，可部分降低下游BCL2L2的表達；在細胞水平，發現其過表達可提高胃癌細胞對5-FU化療的敏感性。這一結果豐富了胃癌相關miRNA理論，為從分子水平理解胃癌的病因、尋找理想的標志物并探索基因治療提供了有用的靶點。
