引用本文： 黃功成, 舒禮良, 黃辰, 朱效華, 魏廷舉, 徐敬. 探討CYP2C9及VKORC高活性對華法林抗凝的影響及對策. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2014, 21(5): 609-613. doi: 10.7507/1007-4848.20140174 復制
心臟機械瓣置換術后需要終身接受抗凝治療，華法林（warfarin）是臨床上應用最廣泛的口服抗凝藥，主要用于預防及治療深靜脈血栓、肺栓塞、腦梗塞、心房顫動及并發血栓形成、心臟瓣膜置換術后及其他血栓性疾病[1-4]。然而，華法林治療窗窄、個體差異大，且易受其他因素影響（藥物、飲食等）[4-8]。劑量過小不能達到滿意的抗凝效果，劑量過大可能會導致致命性出血。而細胞色素P450 2C9酶（CYP2C9）及維生素K環氧化物還原酶（VKORC）的基因多態性會影響華法林的用藥劑量，在應用華法林前，檢測患者的基因多態性對于其在臨床安全有效地應用十分必要。我們對40例CYP2C9及VKORC高活性心瓣膜置換術患者術后抗凝及并發癥發生進行了分析。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
2010年2月至2013年5月期間行心瓣膜置換術患者40例，其中男18例、女22例，年齡40～51（45.18±2.93）歲。行二尖瓣置換術（MVR）18例，二尖瓣置換+三尖瓣成形術（TVP）14例，雙瓣膜置換術（DVR）8例。所有患者均無心房顫動病史，均使用同一廠家生產的機械瓣。根據術前是否行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，分為兩組，A組：20例，術前未行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測；B組：20例，術前已行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，19例為CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）陽性，VKORC1-1639 GA陽性；1例為CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）陽性，VKORC1-1639 GG陽性；兩組患者的臨床資料見表 1。
表1
兩組患者的臨床資料［（1.2 方法
1.2.1 用藥方法
A組：術前未行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，術后第2 d給予常規推薦劑量華法林2.5 mg/d，后根據國際標準化比值（INR）值調整華法林用量，統計達到預期值時的用藥時間及并發癥發生情況，于術后3個月查CYP2C9和VKORC1基因多態性。B組：術前已行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，CYP2C9和VKORC1基因均為高活性，根據公式[參考藥理學公式（www.warfarindosing.org），包括VKORC1和CYP2C9基因型、年齡、性別、體重、身高、目標INR值、胺碘酮使用情況、吸煙史及華法林應用指征等因素]計算出華法林推薦劑量，同時給予阿司匹林100 mg/d及低分子肝素0.4 ml/d，后根據INR值調整華法林用量，待INR達到預期值后停用阿司匹林及低分子肝素，統計達到預期值時的用藥時間及并發癥發生情況。
1.2.2 基因的檢測方法
采用聚合酶鏈反應（PCR）-芯片雜交法檢測基因，試劑盒（上海百傲科技有限公司，產品編號：YZB/國4789-2012）采用從人外周血細胞中提取的基因組脫氧核糖核酸（DNA），用CYP2C9、VKORC1基因特異引物經PCR擴增后，將帶生物素標記的擴增產物與固定在醛基基片上的CYP2C9、VKORC1基因型檢測探針進行特異雜交反應，并通過酶促顯色反應，使特異性雜交信號呈現出顏色，通過對芯片進行掃描，得到樣品DNA擴增產物與每個基因位點的野生型和突變型探針雜交形成的雜交圖像；經軟件分析該圖像，判斷待檢樣品的基因型。
根據基因型檢測結果確定華法林起始劑量時，可參考美國食品藥品監督管理局（FDA）認可的不同基因型華法林起始劑量（mg/d）[9]；見表 2。
表2
不同基因型華法林起始劑量（mg/d）
1.3 隨訪
術后隨訪3～12個月，出院后，每月1次電話隨訪，記錄每次復查INR值、并發癥發生及恢復情況，并根據INR值及臨床癥狀、治療情況給出建議華法林用量及復查時機。
1.4 統計學分析
所有數據均用SPSS 21.0統計軟件進行統計處理，計量資料采用均數±標準差（
2 結果
A組患者術后常規給予華法林2.5 mg/d，根據INR值調整華法林用量，其中2例于術后第8 d、第12?d出現不同程度的言語不清，行頭顱CT示：腦梗死，經積極治療后，隨訪6個月，1例癥狀明顯好轉，1例仍表現為右側肢體共濟失調；2例術后第9 d、第16 d出現下肢疼痛，彩色超聲波示：腘動脈血栓；1例術后第22 d發生肺栓塞；1例術后第12 d復查彩色超聲心動圖示：人工瓣膜瓣環血栓形成；14例分別于第15～20?d達到預期INR值，無明顯血栓并發癥。術后3個月行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，其中17例為CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）陽性，VKORC1-1639 GA陽性；3例為CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）陽性，VKORC1-1639 GG陽性。B組患者術后第2 d給予華法林推薦量的同時給予阿司匹林（100 mg/d）及低分子肝素（0.4 ml/d），分別于第5～9?d達到華法林預期值，后停用阿司匹林及低分子肝素；隨訪6個月無明顯血栓并發癥，僅1例出現鼻腔出血并發癥，經鼻孔填塞后好轉。兩組患者的隨訪結果見表 3。
表3
兩組患者的隨訪結果［例（%）/（3 討論
人工機械瓣膜置換術后患者均需終身服用抗凝藥，目前國內一般用口服華法林抗凝治療[10]。但與抗凝治療有關的出血及血栓形成是心瓣膜置換術后常見且可危及生命的并發癥[11]，如卡瓣，肢體栓塞、腦梗死，甚至發生猝死[10, 12]，華法林過量又易導致出血[10, 13]。而將不同患者的華法林劑量調整到既安全又有效的范圍，是長期以來臨床用藥上一個非常棘手的問題。
華法林是由S-對映體和R-對映體組成的消旋化合物，其中，S-華法林抗凝活性是R-華法林抗凝活性的3～5倍，提供了華法林70％的抗凝活性[14-15]。兩種對映體在體內被不同的細胞色素P450（cytoch-rome P450，CYP）同工酶通過羧基化代謝成非活性產物。S-華法林85％以上由CYP2C9代謝為無活性的6-羥化產物和7-羥化產物；而R-華法林主要經CYP3A4、1A1、lA2代謝[16]，對華法林劑量影響最大的是CYP2C9。
華法林通過抑制VKORC，阻止了維生素K的循環應用，使凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白C和S無法羧化而停留在沒有抗凝活性的前體階段，從而達到抗凝的目的。VKORC是維生素K依賴性凝血因子生成的限速酶。因此，臨床上主要應用對CYP2C9及VKORC的檢測來評估華法林用量。CYP2C9與VKORCl基因型分布有明顯的種族差異。Yang等[17]進行的分析顯示，亞洲人群中VKORCl-1639AA、AG及GG基因型頻率分別為0.804，0.183和0.013，而高加索人群分別為0.163，0.489和0.367。這也是我國與西方國家華法林用量的差異所在。雖然CYP2C9及VKORC高活性在我國只占極少，但對于心瓣膜置換術后給予華法林用量卻至關重要。
2008年，美國胸科醫師協會（ACCP）指南[18-19]中推薦心臟機械瓣膜置換術后INR的控制范圍為2.0～3.5，其中主動脈瓣置換術后INR為2.0～3.0，二尖瓣置換術后INR為2.5～3.5。目前一些國外研究建議INR控制范圍低于指南推薦的范圍[19-24]。關于中國人機械瓣膜置換術后患者合適的INR控制范圍一直存在爭議，一般認為中國人心瓣膜置換術后INR控制在1.6～2.6是合理的[25-27]。我們設置的預期INR值為1.5～2.5。而不同瓣位的心臟機械瓣置換術后患者的相對安全INR范圍不同。
本組CYP2C9和VKORC1高活性患者心瓣膜置換術后的抗凝情況，其中術前行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測患者，根據上述公式計算出華法林推薦量，后根據INR值調整用量，術后血栓并發癥發生率與未行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測者給予常規推薦華法林劑量相比差異有統計學意義。術前未行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，術后1個月內有6例出現抗凝并發癥，發生率高達30%，明顯高于文獻報道。我們認為其原因：（1）此研究主要討論CYP2C9及VKORC高活性患者，患者本身就對華法林抗凝不敏感，與敏感者相比易發生血栓栓塞；（2）VKORC高活性患者VKORCl-1639AG及GG基因型頻率為0.183和0.013，遠低于VKORCl-1639AA基因型頻率的0.804，屬于少數人群；（3）本組并發癥的發生率只代表CYP2C9和VKORC高活性患者（只占人群極少部分），因此與人群相比要高。因此，我們認為術前行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測有其必要性，對于我國大多數人其表現為CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）陽性，VKORC1-1639 AA陽性，達到治療窗時間短，術后栓塞并發癥的發生相對較少，而對那些CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）陽性，VKORC1-1639 GA/GG陽性者則需要的華法林劑量大、時間長，才能達到預期INR值，這個過程中極易發生血栓形成并發癥，應提高警惕。根據我們的經驗，對于CYP2C9及VKORC高活性患者術后給予華法林的同時加阿司匹林（100 mg/d）及低分子肝素（0.4?ml/d），待INR達到預期值后停用阿司匹林及低分子肝素，有其必要性。可以減少心瓣膜置換術后栓塞的發生及達到華法林治療窗的時間。根據臨床經驗行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，所計算出來的華法林推薦量部分與臨床實際觀察不符，實際應用華法林量不能完全依賴計算結果，因為華法林同樣受飲食、藥物等其他因素的影響。還要根據檢測的INR值來調整用量，但是檢測結果為CYP2C9及VKORC高活性者，預示著華法林用量大，達標值（INR）用時長，有很高的預測性，可以提示我們在加強抗凝的同時應用阿司匹林和肝素。有研究認為，術后早期以肝素作為華法林起效之前的抗凝治療，進行華法林和肝素聯合使用，安全性較單純口服華法林高?[28-29]。與我們的研究結果相一致。
因此，術前檢測VKORCl和CYP2C9基因多態性可以預測華法林用量，并根據結果調整抗凝方案，有助于減少心瓣膜置換術后抗凝治療所引起的栓塞并發癥。
心臟機械瓣置換術后需要終身接受抗凝治療，華法林（warfarin）是臨床上應用最廣泛的口服抗凝藥，主要用于預防及治療深靜脈血栓、肺栓塞、腦梗塞、心房顫動及并發血栓形成、心臟瓣膜置換術后及其他血栓性疾病[1-4]。然而，華法林治療窗窄、個體差異大，且易受其他因素影響（藥物、飲食等）[4-8]。劑量過小不能達到滿意的抗凝效果，劑量過大可能會導致致命性出血。而細胞色素P450 2C9酶（CYP2C9）及維生素K環氧化物還原酶（VKORC）的基因多態性會影響華法林的用藥劑量，在應用華法林前，檢測患者的基因多態性對于其在臨床安全有效地應用十分必要。我們對40例CYP2C9及VKORC高活性心瓣膜置換術患者術后抗凝及并發癥發生進行了分析。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
2010年2月至2013年5月期間行心瓣膜置換術患者40例，其中男18例、女22例，年齡40～51（45.18±2.93）歲。行二尖瓣置換術（MVR）18例，二尖瓣置換+三尖瓣成形術（TVP）14例，雙瓣膜置換術（DVR）8例。所有患者均無心房顫動病史，均使用同一廠家生產的機械瓣。根據術前是否行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，分為兩組，A組：20例，術前未行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測；B組：20例，術前已行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，19例為CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）陽性，VKORC1-1639 GA陽性；1例為CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）陽性，VKORC1-1639 GG陽性；兩組患者的臨床資料見表 1。
表1
兩組患者的臨床資料［（1.2 方法
1.2.1 用藥方法
A組：術前未行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，術后第2 d給予常規推薦劑量華法林2.5 mg/d，后根據國際標準化比值（INR）值調整華法林用量，統計達到預期值時的用藥時間及并發癥發生情況，于術后3個月查CYP2C9和VKORC1基因多態性。B組：術前已行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，CYP2C9和VKORC1基因均為高活性，根據公式[參考藥理學公式（www.warfarindosing.org），包括VKORC1和CYP2C9基因型、年齡、性別、體重、身高、目標INR值、胺碘酮使用情況、吸煙史及華法林應用指征等因素]計算出華法林推薦劑量，同時給予阿司匹林100 mg/d及低分子肝素0.4 ml/d，后根據INR值調整華法林用量，待INR達到預期值后停用阿司匹林及低分子肝素，統計達到預期值時的用藥時間及并發癥發生情況。
1.2.2 基因的檢測方法
采用聚合酶鏈反應（PCR）-芯片雜交法檢測基因，試劑盒（上海百傲科技有限公司，產品編號：YZB/國4789-2012）采用從人外周血細胞中提取的基因組脫氧核糖核酸（DNA），用CYP2C9、VKORC1基因特異引物經PCR擴增后，將帶生物素標記的擴增產物與固定在醛基基片上的CYP2C9、VKORC1基因型檢測探針進行特異雜交反應，并通過酶促顯色反應，使特異性雜交信號呈現出顏色，通過對芯片進行掃描，得到樣品DNA擴增產物與每個基因位點的野生型和突變型探針雜交形成的雜交圖像；經軟件分析該圖像，判斷待檢樣品的基因型。
根據基因型檢測結果確定華法林起始劑量時，可參考美國食品藥品監督管理局（FDA）認可的不同基因型華法林起始劑量（mg/d）[9]；見表 2。
表2
不同基因型華法林起始劑量（mg/d）
1.3 隨訪
術后隨訪3～12個月，出院后，每月1次電話隨訪，記錄每次復查INR值、并發癥發生及恢復情況，并根據INR值及臨床癥狀、治療情況給出建議華法林用量及復查時機。
1.4 統計學分析
所有數據均用SPSS 21.0統計軟件進行統計處理，計量資料采用均數±標準差（
2 結果
A組患者術后常規給予華法林2.5 mg/d，根據INR值調整華法林用量，其中2例于術后第8 d、第12?d出現不同程度的言語不清，行頭顱CT示：腦梗死，經積極治療后，隨訪6個月，1例癥狀明顯好轉，1例仍表現為右側肢體共濟失調；2例術后第9 d、第16 d出現下肢疼痛，彩色超聲波示：腘動脈血栓；1例術后第22 d發生肺栓塞；1例術后第12 d復查彩色超聲心動圖示：人工瓣膜瓣環血栓形成；14例分別于第15～20?d達到預期INR值，無明顯血栓并發癥。術后3個月行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，其中17例為CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）陽性，VKORC1-1639 GA陽性；3例為CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）陽性，VKORC1-1639 GG陽性。B組患者術后第2 d給予華法林推薦量的同時給予阿司匹林（100 mg/d）及低分子肝素（0.4 ml/d），分別于第5～9?d達到華法林預期值，后停用阿司匹林及低分子肝素；隨訪6個月無明顯血栓并發癥，僅1例出現鼻腔出血并發癥，經鼻孔填塞后好轉。兩組患者的隨訪結果見表 3。
表3
兩組患者的隨訪結果［例（%）/（3 討論
人工機械瓣膜置換術后患者均需終身服用抗凝藥，目前國內一般用口服華法林抗凝治療[10]。但與抗凝治療有關的出血及血栓形成是心瓣膜置換術后常見且可危及生命的并發癥[11]，如卡瓣，肢體栓塞、腦梗死，甚至發生猝死[10, 12]，華法林過量又易導致出血[10, 13]。而將不同患者的華法林劑量調整到既安全又有效的范圍，是長期以來臨床用藥上一個非常棘手的問題。
華法林是由S-對映體和R-對映體組成的消旋化合物，其中，S-華法林抗凝活性是R-華法林抗凝活性的3～5倍，提供了華法林70％的抗凝活性[14-15]。兩種對映體在體內被不同的細胞色素P450（cytoch-rome P450，CYP）同工酶通過羧基化代謝成非活性產物。S-華法林85％以上由CYP2C9代謝為無活性的6-羥化產物和7-羥化產物；而R-華法林主要經CYP3A4、1A1、lA2代謝[16]，對華法林劑量影響最大的是CYP2C9。
華法林通過抑制VKORC，阻止了維生素K的循環應用，使凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白C和S無法羧化而停留在沒有抗凝活性的前體階段，從而達到抗凝的目的。VKORC是維生素K依賴性凝血因子生成的限速酶。因此，臨床上主要應用對CYP2C9及VKORC的檢測來評估華法林用量。CYP2C9與VKORCl基因型分布有明顯的種族差異。Yang等[17]進行的分析顯示，亞洲人群中VKORCl-1639AA、AG及GG基因型頻率分別為0.804，0.183和0.013，而高加索人群分別為0.163，0.489和0.367。這也是我國與西方國家華法林用量的差異所在。雖然CYP2C9及VKORC高活性在我國只占極少，但對于心瓣膜置換術后給予華法林用量卻至關重要。
2008年，美國胸科醫師協會（ACCP）指南[18-19]中推薦心臟機械瓣膜置換術后INR的控制范圍為2.0～3.5，其中主動脈瓣置換術后INR為2.0～3.0，二尖瓣置換術后INR為2.5～3.5。目前一些國外研究建議INR控制范圍低于指南推薦的范圍[19-24]。關于中國人機械瓣膜置換術后患者合適的INR控制范圍一直存在爭議，一般認為中國人心瓣膜置換術后INR控制在1.6～2.6是合理的[25-27]。我們設置的預期INR值為1.5～2.5。而不同瓣位的心臟機械瓣置換術后患者的相對安全INR范圍不同。
本組CYP2C9和VKORC1高活性患者心瓣膜置換術后的抗凝情況，其中術前行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測患者，根據上述公式計算出華法林推薦量，后根據INR值調整用量，術后血栓并發癥發生率與未行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測者給予常規推薦華法林劑量相比差異有統計學意義。術前未行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，術后1個月內有6例出現抗凝并發癥，發生率高達30%，明顯高于文獻報道。我們認為其原因：（1）此研究主要討論CYP2C9及VKORC高活性患者，患者本身就對華法林抗凝不敏感，與敏感者相比易發生血栓栓塞；（2）VKORC高活性患者VKORCl-1639AG及GG基因型頻率為0.183和0.013，遠低于VKORCl-1639AA基因型頻率的0.804，屬于少數人群；（3）本組并發癥的發生率只代表CYP2C9和VKORC高活性患者（只占人群極少部分），因此與人群相比要高。因此，我們認為術前行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測有其必要性，對于我國大多數人其表現為CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）陽性，VKORC1-1639 AA陽性，達到治療窗時間短，術后栓塞并發癥的發生相對較少，而對那些CYP2C9*1/*1（*2CC/*3AA）陽性，VKORC1-1639 GA/GG陽性者則需要的華法林劑量大、時間長，才能達到預期INR值，這個過程中極易發生血栓形成并發癥，應提高警惕。根據我們的經驗，對于CYP2C9及VKORC高活性患者術后給予華法林的同時加阿司匹林（100 mg/d）及低分子肝素（0.4?ml/d），待INR達到預期值后停用阿司匹林及低分子肝素，有其必要性。可以減少心瓣膜置換術后栓塞的發生及達到華法林治療窗的時間。根據臨床經驗行CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測，所計算出來的華法林推薦量部分與臨床實際觀察不符，實際應用華法林量不能完全依賴計算結果，因為華法林同樣受飲食、藥物等其他因素的影響。還要根據檢測的INR值來調整用量，但是檢測結果為CYP2C9及VKORC高活性者，預示著華法林用量大，達標值（INR）用時長，有很高的預測性，可以提示我們在加強抗凝的同時應用阿司匹林和肝素。有研究認為，術后早期以肝素作為華法林起效之前的抗凝治療，進行華法林和肝素聯合使用，安全性較單純口服華法林高?[28-29]。與我們的研究結果相一致。
因此，術前檢測VKORCl和CYP2C9基因多態性可以預測華法林用量，并根據結果調整抗凝方案，有助于減少心瓣膜置換術后抗凝治療所引起的栓塞并發癥。
