引用本文： 高毅明, 趙春英. 人平衡型核苷載體在乳腺癌細胞中的表達情況及其對5-FU藥效的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(5): 599-602. doi: 10.7507/1007-9424.20140144 復制
乳腺癌是危害全世界婦女健康的首要惡性腫瘤之一，在肺癌、結直腸癌、乳腺癌及前列腺癌中每8例死亡病例中就有1例為乳腺癌[1]。目前治療有手術、放化療、靶向治療等綜合性治療方法。乳腺癌新輔助化療可使不可手術的局部晚期乳腺癌患者獲得手術治療的機會，同時化療使腫瘤縮小后可提高保乳手術率[2]。但是，部分病例不能通過新輔助化療達到病情緩解，化療耐藥是新輔助化療目前所面臨的主要問題[3]。新輔助化療常用的吉西他濱、希羅達等藥物發揮作用的終產物需要通過細胞膜上的核苷載體進入細胞發揮作用[4]，猜想核苷載體在乳腺癌細胞膜上的表達量及其活性將影響新輔助化療的作用效果。迄今發現兩類核苷載體，即人平衡型核苷載體（human equilibrative nucleoside transporters，hENTs）和Na+離子依賴的主動轉運載體（human concentrative nucleoside transporters，hCNTs）[5-7]，而以hENTs的表達最多，其作用最大，可能是細胞膜上對核苷類藥物轉運的主要通道[8-10]。我們選取常用的核苷類化療藥物5-FU作為研究藥物，觀察4種乳腺癌細胞株的增殖情況，研究hENTs的表達是否與核苷類化療藥效有直接相關關系，為臨床新輔助化療選擇敏感藥物提供基礎理論依據，避免因化療藥不敏感而延誤病情。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及藥物
四甲基偶氮唑藍（MTT）購自Amresco公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，TRIzol試劑（批號：167022024）購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒（批號：DRR019A）為TaKaRa公司產品。5-FU（批號：1224）等標準品均由美國Sigma公司生產，5-FU用培養液配成儲備液（250 g/L），pH調至7.2，過濾，4℃保存備用。
1.2 細胞培養
乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468由上海中醫藥大學基礎醫學院提供；SK-BR-3、MCF-7細胞株于上海研生生化試劑有限公司購買。乳腺癌細胞株培養用DMEM培養基。培養基中含10%滅活小牛血清、青霉素10×104 U/L、鏈霉素100 mg/L。細胞在濕度為95%、溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養箱內培養。
1.3 RT-PCR半定量檢測細胞株hENTs mRNA的表達
①取50 mL培養瓶中長滿瓶壁80%以上的乳腺癌細胞進行實驗，按TRIzol試劑一步法[5]提取總RNA，并用凝膠電泳檢測RNA的完整性（28 s、18 s、5 s亞基條帶清晰，28 s與18 s熒光強度之比為2:1，無降解雜帶），測定RNA濃度并調整各細胞株RNA濃度基本一致。②根據基因庫編碼合成引物，其中hENT1及hENT2引物由上海生物工程有限公司設計并合成。hENT1、hENT2及β-actin的引物序列：hENT1上游引物為5′-AGCAGGCAAAGAGG-AATCTGGAGT-3′，下游引物為5′-GAAGGCAAAG-GCAGCCATGAAGAA-3′，擴增片段長度為436 bp；hENT2上游引物為5′-TCCCAGGCCCAAGCTCAG-GA-3′，下游引物為5′-GGAACCGCAGGCAGACC-AGC-3′，擴增片段長度為430 bp；β-actin上游引物為5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，下游引物為5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGCT-3′，擴增片段長度為270 bp。將所合成的各核苷載體、β-actin上下游引物用0.1% DEPC水溶解。根據引物分子量的不同，計算加DEPC水的量，使其終濃度均為2 pmol/μL。③以1μg各個細胞株RNA為模板，按TaKaRa公司試劑盒所提供的方法進行RT-PCR，用β-actin作為內參。RT-PCR共同反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸7 min。PCR產物即進行電泳。④反應產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離（電壓100 V，時間40 min），Image-Master VDS掃描分析儀測定各顯色帶灰度，并計算其與內參的相對比值。上述實驗重復3次。
1.4 MTT法檢測5-FU對各乳腺癌細胞株的細胞毒性
①將進入對數生長期的4種乳腺癌細胞接種于96孔板中，按細胞5 000個/孔待細胞貼壁后（24 h）進行細胞毒性實驗。②根據預實驗結果，本實驗5-FU濃度序列為0 ng/L、1.28×104 ng/L、6.40×104 ng/L、3.20×105 ng/L、1.60×106 ng/L、8.00×106 ng/L、4.00×107 ng/L、2.00×108 ng/L。為減除背景，每組均另設空白對照孔和正常對照孔。每個5-FU濃度設3個復孔。按上述濃度分別加入含相應濃度藥物的培養液培養48 h，然后每孔加入MTT液20μL（5 mg/mL），繼續培養4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 200μL，終止反應，將96孔板移入平板振蕩器，水平振蕩10 min，使MTT還原產物完全溶解，用DG-3022A型酶聯免疫檢測儀于570 nm波長處測定每孔吸光度（A）值。細胞增殖率=（A實驗孔-A空白對照）/（A正常對照-A空白對照）。上述實驗均重復3次。繪制細胞生長曲線，5-FU的半數抑制濃度（IC50）用GraphPad Prism 4 Demo軟件（Version 6.01）計算。
1.5 統計學方法
采用統計軟件SPSS 11.0對數據進行分析，采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 RNA電泳檢測完整性
所抽提的RNA經檢測其A260/A280值均在1.7～1.9之間，純度較好，將RNA濃度調整至1.0μg/μL。RNA電泳可見3條帶，分別為28 s、18 s、5 s亞基，28 s與18 s熒光強度之比為2:1，說明RNA完整。
2.2 乳腺癌細胞株中hENTs mRNA的表達水平
結果見表 1。從表 1可見，hENT1 mRNA在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3細胞中表達量相近，差異無統計學意義（P > 0.05）；但其在這三者中的表達明顯高于其在MCF-7細胞中的表達，分別為MCF-7細胞的2.3、2.0及2.1倍，差異均有統計學意義（P < 0.05）。hENT2 mRNA在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3細胞中有表達，但三者之間差異無統計學意義（P > 0.05），而在MCF-7中未見表達。各細胞株中hENT1的表達量明高于hENT2的表達量，差異有統計學意義（P < 0.05）。
表1
hENTs mRNA在4種細胞株中的表達量（n=3，2.3 5-FU抑制乳腺癌細胞株增殖的MTT結果
4種乳腺癌細胞株對5-FU的細胞毒性反應不一，MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3、MCF-7細胞的IC50分別為（863±22.6）×103 ng/L、（973±30.1）×103 ng/L、（899±24.5）×103 ng/L、（1 236±20.6）×103 ng/L。前3種細胞之間差異無統計學意義（P > 0.05），但均分別明顯低于MCF-7細胞，差異有統計學意義（P < 0.05）。
2.4 4種乳腺癌細胞株中hENTs mRNA的表達與5-FU毒性的關系
結合RT-PCR結果，在5-FU IC50較低的3個細胞株（MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3）中，hENT1高表達（與MCF-7中比較，差異有統計學意義，P < 0.05），hENT2有表達（MCF-7中未見表達）；IC50較高的MCF-7細胞株則低表達hENT1，hENT2未見表達，提示hENTs的表達高低影響5-FU的細胞毒性。
3 討論
目前乳腺癌的治療包括手術、放化療、內分泌治療、分子靶向治療在內的綜合性治療[11-12]。化療在綜合性治療中有不可替代的作用，化療敏感藥物的正確選擇可以明顯改善預后[13-15]，因此，尋找預測藥物是否敏感的生物分子將為臨床用藥提供指導。乳腺癌化療中常用的希羅達、吉西他濱等核苷類化療藥物需在人體內代謝成核苷類似物，經腫瘤細胞膜表面的核苷載體進入細胞發揮作用[16-17]。所以細胞膜表面核苷載體可能是預測核苷類化療藥物是否敏感的生物分子。
hENTs在正常細胞及腫瘤細胞表達有明顯差異[18]，且在同組織腫瘤細胞的不同分化類型之間有差異[19-21]。本研究中選取4種乳腺癌細胞株進行研究，通過測量hENTs的mRNA量間接反映hENTs的表達情況，在細胞分子水平上證實乳腺癌細胞膜表達hENTs，且在4種細胞株中hENTs表達有差異，特別在MCF-7細胞中表達較少。在4種細胞株中，hENT1的表達量明顯高于hENT2，提示hENT1為主要通道，可能起主要作用，與相關文獻[10, 22]報道相符。
5-FU作為經典的核苷類化療藥物，臨床上仍在廣為應用。5-FU借助細胞膜核苷載體的轉運進入腫瘤細胞[23]，被代謝成一磷酸脫氧氟尿嘧啶核苷和三磷酸氟尿嘧啶核苷，前者抑制胸苷酸合成酶的活性，后者以偽代謝物的形式摻入到RNA中，產生細胞毒性。本研究中證實5-FU對乳腺癌細胞株有毒性作用，且在4種細胞株之間毒性反應不一，其IC50各組之間有差異。主要表現在MCF-7細胞株中，5-FU的IC50較高，可能與MCF-7細胞株細胞膜上hENTs表達量少于另3種細胞株有關。因此細胞膜hENTs表達量及其活性可能影響5-FU的療效。
已有針對胰腺癌病理組織測定hENT1來預測吉西他濱療效的報道[24]，但胰腺癌為腹腔內器官，術前較難獲得病理分型，乳腺癌為體表實體腫瘤，較其他腫瘤容易獲取術前腫瘤的病理類型及免疫組織化學分型。若在術前檢測腫瘤組織hENTs的表達情況，可指導臨床新輔助化療能否選取核苷類化療藥物，避免因化療不敏感而延誤病情，也可根據術后病理結果，選擇敏感的核苷類化療藥物行輔助化療。
本實驗為進一步在乳腺癌組織中檢測hENTs提供細胞學基礎，對臨床指導核苷類化療藥物的選擇有重要的意義。
乳腺癌是危害全世界婦女健康的首要惡性腫瘤之一，在肺癌、結直腸癌、乳腺癌及前列腺癌中每8例死亡病例中就有1例為乳腺癌[1]。目前治療有手術、放化療、靶向治療等綜合性治療方法。乳腺癌新輔助化療可使不可手術的局部晚期乳腺癌患者獲得手術治療的機會，同時化療使腫瘤縮小后可提高保乳手術率[2]。但是，部分病例不能通過新輔助化療達到病情緩解，化療耐藥是新輔助化療目前所面臨的主要問題[3]。新輔助化療常用的吉西他濱、希羅達等藥物發揮作用的終產物需要通過細胞膜上的核苷載體進入細胞發揮作用[4]，猜想核苷載體在乳腺癌細胞膜上的表達量及其活性將影響新輔助化療的作用效果。迄今發現兩類核苷載體，即人平衡型核苷載體（human equilibrative nucleoside transporters，hENTs）和Na+離子依賴的主動轉運載體（human concentrative nucleoside transporters，hCNTs）[5-7]，而以hENTs的表達最多，其作用最大，可能是細胞膜上對核苷類藥物轉運的主要通道[8-10]。我們選取常用的核苷類化療藥物5-FU作為研究藥物，觀察4種乳腺癌細胞株的增殖情況，研究hENTs的表達是否與核苷類化療藥效有直接相關關系，為臨床新輔助化療選擇敏感藥物提供基礎理論依據，避免因化療藥不敏感而延誤病情。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及藥物
四甲基偶氮唑藍（MTT）購自Amresco公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，TRIzol試劑（批號：167022024）購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒（批號：DRR019A）為TaKaRa公司產品。5-FU（批號：1224）等標準品均由美國Sigma公司生產，5-FU用培養液配成儲備液（250 g/L），pH調至7.2，過濾，4℃保存備用。
1.2 細胞培養
乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468由上海中醫藥大學基礎醫學院提供；SK-BR-3、MCF-7細胞株于上海研生生化試劑有限公司購買。乳腺癌細胞株培養用DMEM培養基。培養基中含10%滅活小牛血清、青霉素10×104 U/L、鏈霉素100 mg/L。細胞在濕度為95%、溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養箱內培養。
1.3 RT-PCR半定量檢測細胞株hENTs mRNA的表達
①取50 mL培養瓶中長滿瓶壁80%以上的乳腺癌細胞進行實驗，按TRIzol試劑一步法[5]提取總RNA，并用凝膠電泳檢測RNA的完整性（28 s、18 s、5 s亞基條帶清晰，28 s與18 s熒光強度之比為2:1，無降解雜帶），測定RNA濃度并調整各細胞株RNA濃度基本一致。②根據基因庫編碼合成引物，其中hENT1及hENT2引物由上海生物工程有限公司設計并合成。hENT1、hENT2及β-actin的引物序列：hENT1上游引物為5′-AGCAGGCAAAGAGG-AATCTGGAGT-3′，下游引物為5′-GAAGGCAAAG-GCAGCCATGAAGAA-3′，擴增片段長度為436 bp；hENT2上游引物為5′-TCCCAGGCCCAAGCTCAG-GA-3′，下游引物為5′-GGAACCGCAGGCAGACC-AGC-3′，擴增片段長度為430 bp；β-actin上游引物為5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，下游引物為5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGCT-3′，擴增片段長度為270 bp。將所合成的各核苷載體、β-actin上下游引物用0.1% DEPC水溶解。根據引物分子量的不同，計算加DEPC水的量，使其終濃度均為2 pmol/μL。③以1μg各個細胞株RNA為模板，按TaKaRa公司試劑盒所提供的方法進行RT-PCR，用β-actin作為內參。RT-PCR共同反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸7 min。PCR產物即進行電泳。④反應產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離（電壓100 V，時間40 min），Image-Master VDS掃描分析儀測定各顯色帶灰度，并計算其與內參的相對比值。上述實驗重復3次。
1.4 MTT法檢測5-FU對各乳腺癌細胞株的細胞毒性
①將進入對數生長期的4種乳腺癌細胞接種于96孔板中，按細胞5 000個/孔待細胞貼壁后（24 h）進行細胞毒性實驗。②根據預實驗結果，本實驗5-FU濃度序列為0 ng/L、1.28×104 ng/L、6.40×104 ng/L、3.20×105 ng/L、1.60×106 ng/L、8.00×106 ng/L、4.00×107 ng/L、2.00×108 ng/L。為減除背景，每組均另設空白對照孔和正常對照孔。每個5-FU濃度設3個復孔。按上述濃度分別加入含相應濃度藥物的培養液培養48 h，然后每孔加入MTT液20μL（5 mg/mL），繼續培養4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 200μL，終止反應，將96孔板移入平板振蕩器，水平振蕩10 min，使MTT還原產物完全溶解，用DG-3022A型酶聯免疫檢測儀于570 nm波長處測定每孔吸光度（A）值。細胞增殖率=（A實驗孔-A空白對照）/（A正常對照-A空白對照）。上述實驗均重復3次。繪制細胞生長曲線，5-FU的半數抑制濃度（IC50）用GraphPad Prism 4 Demo軟件（Version 6.01）計算。
1.5 統計學方法
采用統計軟件SPSS 11.0對數據進行分析，采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 RNA電泳檢測完整性
所抽提的RNA經檢測其A260/A280值均在1.7～1.9之間，純度較好，將RNA濃度調整至1.0μg/μL。RNA電泳可見3條帶，分別為28 s、18 s、5 s亞基，28 s與18 s熒光強度之比為2:1，說明RNA完整。
2.2 乳腺癌細胞株中hENTs mRNA的表達水平
結果見表 1。從表 1可見，hENT1 mRNA在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3細胞中表達量相近，差異無統計學意義（P > 0.05）；但其在這三者中的表達明顯高于其在MCF-7細胞中的表達，分別為MCF-7細胞的2.3、2.0及2.1倍，差異均有統計學意義（P < 0.05）。hENT2 mRNA在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3細胞中有表達，但三者之間差異無統計學意義（P > 0.05），而在MCF-7中未見表達。各細胞株中hENT1的表達量明高于hENT2的表達量，差異有統計學意義（P < 0.05）。
表1
hENTs mRNA在4種細胞株中的表達量（n=3，2.3 5-FU抑制乳腺癌細胞株增殖的MTT結果
4種乳腺癌細胞株對5-FU的細胞毒性反應不一，MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3、MCF-7細胞的IC50分別為（863±22.6）×103 ng/L、（973±30.1）×103 ng/L、（899±24.5）×103 ng/L、（1 236±20.6）×103 ng/L。前3種細胞之間差異無統計學意義（P > 0.05），但均分別明顯低于MCF-7細胞，差異有統計學意義（P < 0.05）。
2.4 4種乳腺癌細胞株中hENTs mRNA的表達與5-FU毒性的關系
結合RT-PCR結果，在5-FU IC50較低的3個細胞株（MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3）中，hENT1高表達（與MCF-7中比較，差異有統計學意義，P < 0.05），hENT2有表達（MCF-7中未見表達）；IC50較高的MCF-7細胞株則低表達hENT1，hENT2未見表達，提示hENTs的表達高低影響5-FU的細胞毒性。
3 討論
目前乳腺癌的治療包括手術、放化療、內分泌治療、分子靶向治療在內的綜合性治療[11-12]。化療在綜合性治療中有不可替代的作用，化療敏感藥物的正確選擇可以明顯改善預后[13-15]，因此，尋找預測藥物是否敏感的生物分子將為臨床用藥提供指導。乳腺癌化療中常用的希羅達、吉西他濱等核苷類化療藥物需在人體內代謝成核苷類似物，經腫瘤細胞膜表面的核苷載體進入細胞發揮作用[16-17]。所以細胞膜表面核苷載體可能是預測核苷類化療藥物是否敏感的生物分子。
hENTs在正常細胞及腫瘤細胞表達有明顯差異[18]，且在同組織腫瘤細胞的不同分化類型之間有差異[19-21]。本研究中選取4種乳腺癌細胞株進行研究，通過測量hENTs的mRNA量間接反映hENTs的表達情況，在細胞分子水平上證實乳腺癌細胞膜表達hENTs，且在4種細胞株中hENTs表達有差異，特別在MCF-7細胞中表達較少。在4種細胞株中，hENT1的表達量明顯高于hENT2，提示hENT1為主要通道，可能起主要作用，與相關文獻[10, 22]報道相符。
5-FU作為經典的核苷類化療藥物，臨床上仍在廣為應用。5-FU借助細胞膜核苷載體的轉運進入腫瘤細胞[23]，被代謝成一磷酸脫氧氟尿嘧啶核苷和三磷酸氟尿嘧啶核苷，前者抑制胸苷酸合成酶的活性，后者以偽代謝物的形式摻入到RNA中，產生細胞毒性。本研究中證實5-FU對乳腺癌細胞株有毒性作用，且在4種細胞株之間毒性反應不一，其IC50各組之間有差異。主要表現在MCF-7細胞株中，5-FU的IC50較高，可能與MCF-7細胞株細胞膜上hENTs表達量少于另3種細胞株有關。因此細胞膜hENTs表達量及其活性可能影響5-FU的療效。
已有針對胰腺癌病理組織測定hENT1來預測吉西他濱療效的報道[24]，但胰腺癌為腹腔內器官，術前較難獲得病理分型，乳腺癌為體表實體腫瘤，較其他腫瘤容易獲取術前腫瘤的病理類型及免疫組織化學分型。若在術前檢測腫瘤組織hENTs的表達情況，可指導臨床新輔助化療能否選取核苷類化療藥物，避免因化療不敏感而延誤病情，也可根據術后病理結果，選擇敏感的核苷類化療藥物行輔助化療。
本實驗為進一步在乳腺癌組織中檢測hENTs提供細胞學基礎，對臨床指導核苷類化療藥物的選擇有重要的意義。
