引用本文： 趙偉, 陳銳, 劉芮菡, 常帥, 譙瞧, 劉俊松, 張振良, 車向明. 沉默信息調節因子1對胃癌侵襲的影響及其機理研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(4): 425-431. doi: 10.7507/1007-9424.20140104 復制
常用的胃癌治療方法是以手術為主的綜合治療，而胃癌轉移和術后復發是導致治療效果差和生存期縮短的重要因素。沉默信息調節因子1（SIRT1）是人體內的一種多功能蛋白，與細胞增殖、炎癥、能量代謝等過程密切相關[1-2]。研究[3-4]發現，SIRT1蛋白在腫瘤的發生和發展過程中起著重要的作用，其參與了腫瘤細胞增殖、新生血管生成、腫瘤代謝等生物學行為過程，但SIRT1蛋白是發揮促癌作用還是抑癌作用尚無定論，其具體機理需進一步深入研究[5]。血管內皮生長因子A（VEGF-A）是已知最強的促進腫瘤內外血管生長的細胞因子，與腫瘤的轉移和復發密切相關[6]。本實驗以SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白作為研究對象，觀察SIRT1蛋白對VEGF-A蛋白表達及胃癌細胞侵襲能力的影響。
1 資料和方法
1.1 研究對象
收集2000年1月至2004年12月期間西安交通大學醫學院第一附屬醫院普通外科經手術治療的胃癌患者68例，其中隨訪資料完整者46例。患者既往無其他腫瘤病史，術前均未行放化療等其他治療，術后標本均經病理組織學檢查證實為胃癌。46例患者中男32例，女14例；年齡31～85歲、（59±10.8）歲；腫瘤直徑15～140 mm、（58±31.4）mm；組織學分級參考Broders分級法分為4級：Ⅰ級2例，Ⅱ級14例，Ⅲ級16例，Ⅳ級14例；組織學分類：分化型腺癌38例，未分化癌7例，印戒細胞癌1例。胃癌TNM分期采用美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）2010年第7版胃癌TNM分期標準，其中Ⅰ期7例，Ⅱ期14例，Ⅲ期14例，Ⅳ期11例。選擇能取胃癌組織和腫瘤邊緣以遠5 cm以上的正常胃黏膜的病例（59例），打亂病理號后，選擇前15例標本用于實驗。
1.2 主要材料與儀器
GES-1人正常胃黏膜細胞株（西安交通大學醫學院第一附屬醫院轉化中心），SGC7901人胃癌細胞株（第四軍醫大學消化內科實驗室）。特異性SIRT1-siRNA由上海吉瑪生物有限公司合成，陽性序列上游：5′-CCAAGCAGCUAAGAGUAAUTT-3′，下游：3′-AUUACUCUUAGCUGCUUGGTT-5′；陰性序列上游：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-TT-3′，下游：3′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5′。細胞培養基RMPI 1640和胎牛血清（FBS）購自美國Hyc-lon公司，兔抗人SIRT1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗人VEGF-A多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；PV-6000免疫組化相關試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Lipof-ectamineTM 2000，Thermo Fisher轉染試劑盒（中國賽默飛世爾科技公司），BCA試劑盒（陜西西安先鋒科技公司）。BIODOC-IT全自動凝膠成像系統（美國UVP公司）；IX50熒光倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；SHEL-LAB1815TC CO2培養箱（美國SHEL-LAB公司）。
1.3 方法
1.3.1 免疫組化染色SP法及評分
將胃癌和正常胃黏膜組織的石蠟切片常規脫蠟至水，微波抗原修復，均以PBS溶液代替一抗作為陰性對照；同時參考抗體說明書里面的文章，因陽性對照取自人肺組織，考慮本實驗也為人標本，故未設置陽性對照。具體操作均按試劑盒說明書進行。兔抗人SIRT1多克隆抗體的工作濃度為1：50，陽性染色為細胞核或細胞質存在不均質棕色顆粒；兔抗人VEGF-A多克隆抗體的工作濃度為1：50，陽性染色為細胞漿或細胞核中存在粗細不一的黃色或棕黃色顆粒。所有切片閱片均采取單盲法，由兩位西安交通大學醫學院病理系的老師分別閱片，不一致時由筆者按照評分標準作出選擇。閱片時隨機觀察切片中的5個高倍（400倍）視野，每個視野下計算著色細胞總數（與陰性對照相比，凡著色細胞均默認為陽性細胞），計算陽性細胞所占比例（取平均值）。其中陽性細胞所占百分率≥25%為陽性，＜25%為陰性。陽性細胞呈淡黃色或陽性細胞率介于25%～50%為弱陽性（+），陽性細胞呈棕黃色或陽性細胞率介于51%～75%為中度陽性（++），陽性細胞呈深棕黃色或陽性細胞率大于75%為強陽性（+++）[7]。（+）～（+++）合并為陽性。
1.3.2 細胞分組及siRNA干擾
取對數生長期的GES-1細胞和SGC7901細胞分別接種于50 mL細胞培養瓶中培養72 h（培養液為含10% FBS的RMPI 1640培養基，在37℃、5% CO2條件下于細胞培養箱中培養），待瓶底細胞長至80%～90%融合時，加入預先配置的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，然后4℃超速離心（12 000 r/min，r=10 cm，15 min），取上清，分裝于-80℃冰箱內保存。另取對數生長期的SGC7901細胞按2×105個/孔接種于6孔板，并分為4組：空白對照組、空脂質體組、SIRT1-siRNA陰性序列組（siRNA陰性組，）和SIRT1-siRNA陽性序列組（siRNA陽性組）。空白對照組細胞不做處理，空脂質體組在細胞貼壁生長至70%左右融合時加入與100 nmol/L siRNA濃度相同的空脂質體；siRNA陰性組（將陽性的序列隨機打亂組合而成，以排除序列中堿基對的干擾）及siRNA陽性組在細胞貼壁生長至70%左右融合時加入脂質體進行轉染。4組細胞均不加抗生素，轉染8 h后更換細胞培養液，繼續培養至72 h后收集總蛋白。脂質體/siRNA的比例和轉染操作步驟嚴格按照操作說明書進行，每組重復實驗3次，每次實驗設3個復孔。
1.3.3 Western blot法檢測SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達
4組細胞轉染72 h后（GES-1細胞和SGC7901細胞也進行了蛋白檢測），收集細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取25μg樣品上樣于十二烷基硫酸鈉-上樣緩沖液（SDS-PAGE），電泳至溴酚藍跑到膠底部。將其轉至硝酸纖維酯膜（PVDF膜）上，以5%脫脂奶粉于4℃過夜封閉；分別加入SIRT1（1：500）、VEGF-A（1：200）及β-actin（1：1 000）一抗，37℃搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min；分別加入二抗（山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗的稀釋比例均為1：2 000），37℃搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min；采用化學發光試劑（ECL）發光，采用UVP進行圖像采集，以IPP-6系統分別計算SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白與內參β-actin灰度值的比值，每組重復實驗3次，每次實驗設3個復孔。
1.3.4 細胞侵襲實驗
在24孔Transwell上室的聚碳酸酯膜（膜孔徑為8μm）上涂1 g/L的基質膠70μL，使之在微孔濾膜上重組為基底膜結構（37℃、60 min）。4組細胞轉染8 h后更換培養液，繼續培養48 h，收集4組細胞，以RMPI 1640培養液（不加FBS）進行饑餓處理，使得細胞狀態一致。調整細胞濃度為l×109個/L。取細胞懸液200μL接種于Transwell上室內，下室加入含20%FBS的RMPI1640培養液500μL，在37℃、5%CO2條件下培養24 h后，將濾膜上層細胞用棉簽抹去，濾膜以甲醇固定，然后用結晶紫染色15 min。在200倍光鏡下隨機選擇膜上的6個不同視野，計算穿過膜的細胞數，求平均值。每組重復實驗3次。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0統計軟件包進行統計學分析。計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；計數資料分析采用χ2檢驗；生存曲線繪制及比較采用Kaplan-Meier法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白在胃癌組織中的表達及其臨床意義
46例胃癌患者中，SIRT1和VEGF-A蛋白的表達陽性率分別為65.2%（30/46）及58.7%（27/46），見表 1；在15例正常胃黏膜組織中，SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達陽性率分別為33.3%（5/15）及20.0%（3/15）。腫瘤組織中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達陽性率均較正常胃黏膜組織高（χ2=4.702，P=0.030；χ2=6.777，P=0.009），見圖 1。胃癌組織中SIRT1蛋白表達和VEGF-A蛋白表達之間并無明顯相關性（rc=0.129，P=0.393）。胃癌組織中SIRT1蛋白的表達與腫瘤直徑、T分期、淋巴結轉移及TNM分期均有關（P < 0.05），腫瘤越大、浸潤深度越深、出現淋巴結轉移及TNM分期越晚者其表達上調。胃癌組織中VEGF-A蛋白的表達與淋巴結轉移和TNM分期均有關（P < 0.05），出現淋巴結轉移和TNM分期晚者VEGF-A蛋白表達上調（表 1）。
表1
胃癌組織中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白表達與其臨床病理特征的關系（例）
Table1.
Relationship of clinicopathological features and expressions of SIRT1 and VEGF-A proteins in gastric cancer tissues (case)
2.2 SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白表達與胃癌患者預后的關系
本組患者均獲訪，隨訪時間截止到2007年10月10日。本組患者的生存時間為1～91個月，中位生存時間32.7個月。采用Kaplan-Meier法分析SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白表達與患者預后的關系。SIRT1蛋白陽性表達患者的中位生存時間為16個月，陰性表達患者為86個月，兩者的生存曲線比較其差異有統計學意義（χ2=10.704，P=0.001），提示SIRT1蛋白陰性表達胃癌患者的生存情況較好，見圖 2A。VEGF-A蛋白陽性表達患者的中位生存時間為17個月，陰性患者為53個月，兩者的生存曲線比較差異無統計學意義（χ2=2.853，P=0.091），見圖 2B。SIRT1及VEGF-A蛋白均呈陽性表達者的中位生存時間為11個月，SIRT1及VEGF-A蛋白任一表達陰性者為27個月，SIRT1及VEGF-A蛋白均呈陰性表達者為59個月，三者的生存曲線比較其差異有統計學意義（χ2=10.318，P=0.006），見圖 2C。提示SIRT1和VEGF-A蛋白表達均呈陽性表達者的總體生存情況差于SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白均呈陰性表達或任一蛋白表達陰性者。
圖1
正常胃黏膜組織和胃癌組織中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的免疫組化染色結果（SP×400）。1A：SIRT1蛋白在正常胃黏膜組織中的表達；1B：SIRT1蛋白在胃癌組織中的表達；1C：VEGF-A蛋白在正常胃黏膜組織中的表達；1D：VEGF-A蛋白在胃癌組織中的表達??圖 2不同SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白表達情況胃癌患者的生存曲線。2A：不同SIRT1蛋白表達情況胃癌患者的生存曲線；2B：不同VEGF-A蛋白表達情況胃癌患者的生存曲線；2C：不同SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白表達情況胃癌患者的生存曲線??圖 3 GES-1和SCG7901細胞株中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的電泳結果。3A：SIRT1蛋白；3B：VEGF-A蛋白??圖 4 4組SGC7901細胞中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的電泳結果。1：空白對照組；2：空脂質體組；3：siRNA陰性組；4：siRNA陽性組；??圖 5 4組SCG7901細胞的細胞侵襲實驗結果（結晶紫染色 ×200）。5A：空白對照組；5B：空脂質體組；5C：siRNA陰性組；5D：siRNA陽性組
Figure1.
The immunohistochemical staining results of SIR1 protein and VEGF-A protein in gastric cancer tissues and normal gastric tissues(SP×400).1A: The expression of SIRT1 protein in the normal gastric tissues; 1B: The expression of SIRT1 protein in the gastric cancer tissues; 1C: The expression of VEGF-A protein in the normal gastric tissues; 1D: The expression of VEGF-A protein in the gastric cancer tissues??Figure 2 Survival curves of different expressions of SIRT1 protein and VEGR-A protein.2A: Survival curves of different expressions of SIRT1 protein in patientswith gastric cancer; 2B: Survival curves of different expressions of VEGF-A protein in patients with gastric cancer; 2C: Survival curves of differentexpressions of SIRT1 protein and VEGF-A protein in patients with gastric cancer??Figure 3 The expressions of SIRT1 protein and VEGF-Aprotein in cell lines of GES-1 and SGC7901.3A: SIRT1 protein; 3B: VEGF-A protein??Figure 4 The expressions of SIRT1 protein and VEGF-Aprotein in SGC7901 cells of 4 groups.1: Blank control group; 2: Empty liposomes group; 3: siRNA negative group; 4: siRNA positive group?? Figure 5 Specific inhibited the expression of SIRT1 in SGC7901 cells resultet in the invasive ability change(crystal violet staining×200).5A:Blank control group; 5B: Empty liposomes group; 5C: siRNA negative group; 5D: siRNA positive group
2.3 GES-1和SCG7901細胞株中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達結果
采用Western blot法檢測GES-1和SGC7901細胞株中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達，結果發現，SGC7901細胞株中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的相對表達量分別是0.488 5±0.168 1和0.159 4±0.018 7，GES-1細胞株分別是0.091 2±0.016 5和0.028 5±0.003 8，SGC7901細胞株中該2種蛋白的相對表達量均較高（P=0.010，P=0.020），見圖 3。
2.4 4組SGC7901細胞中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達結果
空白對照組的SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達水平分別為1.00和1.00，空脂質體組分別為0.95和1.04，siRNA陰性組分別為1.05和1.10，siRNA陽性組分別為0.05和0.35。siRNA陽性組SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達水平均最低（P=0.012，P=0.020），見圖 4。提示特異性SIRT1-siRNA能夠明顯降低SGC7901細胞中SIRT1蛋白的表達水平，且特異性抑制SIRT1基因表達后VEGF-A蛋白的表達水平也明顯下降。
2.5 細胞侵襲實驗結果
Transwell細胞侵襲實驗結果（圖 5）顯示，穿過聚碳酸脂膜的細胞數空白對照組為（86±8）個，空脂質體組為（77±7）個，siRNA陰性組為（80±8）個，siRNA陽性組為（26±5）個，4組之間比較差異有統計學意義（P=0.000）。其中，siRNA陽性組低于空白對照組、空脂質體組及siRNA陰性組（P < 0.001），而后3組間比較差異無統計學意義（P > 0.050）。
3 討論
胃癌的侵襲和轉移是影響患者預后的重要因素，因其機理復雜，改善或逆轉侵襲和轉移方法的效果往往不佳。目前認為，血管生成是其中的一種重要機理，其涉及多種基因和蛋白的異常表達、生物學行為改變等。研究[8-9]表明，VEGF蛋白在胃癌組織中的過表達與其侵襲和轉移密切相關。其機理為，通過對毛細血管芽生的誘導及對內皮細胞遷移、分化、增生和血管管腔形成的調控，來促進腫瘤血管的生成[10]。VEGF-A蛋白即傳統意義上的VEGF蛋白，是目前已知最強的促血管生長因子。研究[10-11]表明，VEGF-A蛋白與經典抑癌基因p53的關系密切，野生型p53基因可以下調腫瘤組織中VEGF-A蛋白的表達而減少腫瘤新生血管的產生[11]，而突變型p53基因在胃癌組織中的表達與VEGF-A蛋白的高表達具有強相關性[12]。本實驗結果顯示，VEGF-A蛋白在胃癌組織中呈高表達，且其表達與淋巴結轉移和TNM分期相關，這與傅玉峰等[13]對胃癌的研究一致，提示VEGF-A蛋白與胃癌的侵襲和轉移密切相關。
SIRT1蛋白是人類sirtuins家族的重要成員之一，其能夠通過脫乙酰基及甲基化修飾作用調控組蛋白、通過脫乙酰作用調控非組蛋白、通過甲基化作用修飾DNA等，參與腫瘤的生長、增殖、侵襲、耐藥等多種病理過程[14-15]。但是SIRT1基因在腫瘤中的作用尚無定論，對其是促癌基因還是抑癌基因存在較大的爭議，其中在胃腸道腫瘤中的作用爭議最大[16]。研究[17-19]表明，SIRT1蛋白能夠使p53脫乙酰基，從而阻斷p53依賴的轉錄和凋亡過程，進而在腫瘤中起到促癌基因的作用。乳腺癌缺失基因1（deleted in breast cancer1，DBC1）和SIRT1基因在胃癌中的表達與胃癌的發生及發展均呈正相關關系，且其與p53的表達密切相關[20]。因此，SIRT1基因在胃癌中的角色更傾向于是促癌基因。本實驗結果顯示，SIRT1蛋白在胃癌組織中高表達，且其表達與腫瘤直徑、T分期、淋巴結轉移及TNM分期相關，陽性表達SIRT1蛋白的患者其中位生存時間明顯縮短。該結果提示，SIRT1蛋白在胃癌中主要表現為促癌的作用，其很可能參與了胃癌的侵襲、轉移等生物學行為。但有研究[21]表明，SIRT1蛋白在胃癌組織中的表達較癌旁組織明顯降低，且高表達患者的生存時間延長。其原因可能為，SIRT1能夠去乙酰化促腫瘤因子如β連環蛋白（β-cetanin）、核轉錄因子-κB（NF-κB）等的活性而促進腫瘤細胞的凋亡[22]。另外，SIRT1基因與p53、癌高甲基化1（hypermethylated in cancer 1，HIC1）基因等促癌基因之間存在一個環形通路，高表達的去乙酰化p53可以負反饋調節SIRT1蛋白的表達[23]。因此，SIRT1基因的確切作用仍需進一步探討。
通過siRNA小干擾技術，本實驗成功地抑制了SGC7901胃癌細胞株中SIRT1蛋白的表達，且VEGF-A蛋白的表達也明顯下調。Sun等[24]通過siRNA小干擾技術干擾了SGC7901胃癌細胞株中VEGF-A基因的表達后發現，SIRT1蛋白的表達隨之下調，表明胃癌組織中SIRT1蛋白的表達與VEGF-A蛋白的表達密切相關。通過聯合分析SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白表達對胃癌患者生存的影響發現，SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白均呈陽性表達時，其中位生存時間較單一陽性或均陰性者明顯縮短，這提示SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白對胃癌的惡性生物學行為有促進作用。其可能的機理是，SIRT1基因通過脫乙酰化p53，抑制p53的表達和活性，進而促進VEGF-A蛋白的表達。另外有研究[25]顯示，SIRT1基因通過去乙酰化轉錄因子1（FOXO1），抑制細胞衰老，進而促進內皮細胞增殖與血管發生。此外，SIRT1蛋白能夠通過增強一氧化氮合酶（eNOS）的功能，導致氮氧化合物水平增高，而氮氧化合物水平增高使腫瘤血管數目增加，營養加強[26]。通過細胞侵襲實驗發現，抑制SIRT1基因表達之后，SGC7901胃癌細胞的侵襲能力明顯減弱，這說明SIRT1基因可能促進了胃癌細胞的侵襲。
胃癌侵襲和轉移的機理復雜，如果能夠有效地改善或預防胃癌的侵襲、轉移和復發，則能夠明顯提高胃癌的治療效果，從而延長患者的生存時間。本實驗通過分析SIRT1蛋白與VEGF-A蛋白和胃癌細胞侵襲能力的關系，提示SIRT1蛋白可能通過促進VEGF-A蛋白的表達而促進胃癌的侵襲和轉移。這為胃癌的臨床治療提供了新的思路和治療靶點。但是，胃癌組織石蠟標本中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達無明顯相關性，這可能因樣本量較小所致；且SIRT1基因對VEGF-A蛋白的作用及其信號通路尚不清楚，需要進一步開展大樣本研究加以探索。
常用的胃癌治療方法是以手術為主的綜合治療，而胃癌轉移和術后復發是導致治療效果差和生存期縮短的重要因素。沉默信息調節因子1（SIRT1）是人體內的一種多功能蛋白，與細胞增殖、炎癥、能量代謝等過程密切相關[1-2]。研究[3-4]發現，SIRT1蛋白在腫瘤的發生和發展過程中起著重要的作用，其參與了腫瘤細胞增殖、新生血管生成、腫瘤代謝等生物學行為過程，但SIRT1蛋白是發揮促癌作用還是抑癌作用尚無定論，其具體機理需進一步深入研究[5]。血管內皮生長因子A（VEGF-A）是已知最強的促進腫瘤內外血管生長的細胞因子，與腫瘤的轉移和復發密切相關[6]。本實驗以SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白作為研究對象，觀察SIRT1蛋白對VEGF-A蛋白表達及胃癌細胞侵襲能力的影響。
1 資料和方法
1.1 研究對象
收集2000年1月至2004年12月期間西安交通大學醫學院第一附屬醫院普通外科經手術治療的胃癌患者68例，其中隨訪資料完整者46例。患者既往無其他腫瘤病史，術前均未行放化療等其他治療，術后標本均經病理組織學檢查證實為胃癌。46例患者中男32例，女14例；年齡31～85歲、（59±10.8）歲；腫瘤直徑15～140 mm、（58±31.4）mm；組織學分級參考Broders分級法分為4級：Ⅰ級2例，Ⅱ級14例，Ⅲ級16例，Ⅳ級14例；組織學分類：分化型腺癌38例，未分化癌7例，印戒細胞癌1例。胃癌TNM分期采用美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）2010年第7版胃癌TNM分期標準，其中Ⅰ期7例，Ⅱ期14例，Ⅲ期14例，Ⅳ期11例。選擇能取胃癌組織和腫瘤邊緣以遠5 cm以上的正常胃黏膜的病例（59例），打亂病理號后，選擇前15例標本用于實驗。
1.2 主要材料與儀器
GES-1人正常胃黏膜細胞株（西安交通大學醫學院第一附屬醫院轉化中心），SGC7901人胃癌細胞株（第四軍醫大學消化內科實驗室）。特異性SIRT1-siRNA由上海吉瑪生物有限公司合成，陽性序列上游：5′-CCAAGCAGCUAAGAGUAAUTT-3′，下游：3′-AUUACUCUUAGCUGCUUGGTT-5′；陰性序列上游：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-TT-3′，下游：3′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5′。細胞培養基RMPI 1640和胎牛血清（FBS）購自美國Hyc-lon公司，兔抗人SIRT1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗人VEGF-A多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；PV-6000免疫組化相關試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Lipof-ectamineTM 2000，Thermo Fisher轉染試劑盒（中國賽默飛世爾科技公司），BCA試劑盒（陜西西安先鋒科技公司）。BIODOC-IT全自動凝膠成像系統（美國UVP公司）；IX50熒光倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；SHEL-LAB1815TC CO2培養箱（美國SHEL-LAB公司）。
1.3 方法
1.3.1 免疫組化染色SP法及評分
將胃癌和正常胃黏膜組織的石蠟切片常規脫蠟至水，微波抗原修復，均以PBS溶液代替一抗作為陰性對照；同時參考抗體說明書里面的文章，因陽性對照取自人肺組織，考慮本實驗也為人標本，故未設置陽性對照。具體操作均按試劑盒說明書進行。兔抗人SIRT1多克隆抗體的工作濃度為1：50，陽性染色為細胞核或細胞質存在不均質棕色顆粒；兔抗人VEGF-A多克隆抗體的工作濃度為1：50，陽性染色為細胞漿或細胞核中存在粗細不一的黃色或棕黃色顆粒。所有切片閱片均采取單盲法，由兩位西安交通大學醫學院病理系的老師分別閱片，不一致時由筆者按照評分標準作出選擇。閱片時隨機觀察切片中的5個高倍（400倍）視野，每個視野下計算著色細胞總數（與陰性對照相比，凡著色細胞均默認為陽性細胞），計算陽性細胞所占比例（取平均值）。其中陽性細胞所占百分率≥25%為陽性，＜25%為陰性。陽性細胞呈淡黃色或陽性細胞率介于25%～50%為弱陽性（+），陽性細胞呈棕黃色或陽性細胞率介于51%～75%為中度陽性（++），陽性細胞呈深棕黃色或陽性細胞率大于75%為強陽性（+++）[7]。（+）～（+++）合并為陽性。
1.3.2 細胞分組及siRNA干擾
取對數生長期的GES-1細胞和SGC7901細胞分別接種于50 mL細胞培養瓶中培養72 h（培養液為含10% FBS的RMPI 1640培養基，在37℃、5% CO2條件下于細胞培養箱中培養），待瓶底細胞長至80%～90%融合時，加入預先配置的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，然后4℃超速離心（12 000 r/min，r=10 cm，15 min），取上清，分裝于-80℃冰箱內保存。另取對數生長期的SGC7901細胞按2×105個/孔接種于6孔板，并分為4組：空白對照組、空脂質體組、SIRT1-siRNA陰性序列組（siRNA陰性組，）和SIRT1-siRNA陽性序列組（siRNA陽性組）。空白對照組細胞不做處理，空脂質體組在細胞貼壁生長至70%左右融合時加入與100 nmol/L siRNA濃度相同的空脂質體；siRNA陰性組（將陽性的序列隨機打亂組合而成，以排除序列中堿基對的干擾）及siRNA陽性組在細胞貼壁生長至70%左右融合時加入脂質體進行轉染。4組細胞均不加抗生素，轉染8 h后更換細胞培養液，繼續培養至72 h后收集總蛋白。脂質體/siRNA的比例和轉染操作步驟嚴格按照操作說明書進行，每組重復實驗3次，每次實驗設3個復孔。
1.3.3 Western blot法檢測SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達
4組細胞轉染72 h后（GES-1細胞和SGC7901細胞也進行了蛋白檢測），收集細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取25μg樣品上樣于十二烷基硫酸鈉-上樣緩沖液（SDS-PAGE），電泳至溴酚藍跑到膠底部。將其轉至硝酸纖維酯膜（PVDF膜）上，以5%脫脂奶粉于4℃過夜封閉；分別加入SIRT1（1：500）、VEGF-A（1：200）及β-actin（1：1 000）一抗，37℃搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min；分別加入二抗（山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗的稀釋比例均為1：2 000），37℃搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min；采用化學發光試劑（ECL）發光，采用UVP進行圖像采集，以IPP-6系統分別計算SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白與內參β-actin灰度值的比值，每組重復實驗3次，每次實驗設3個復孔。
1.3.4 細胞侵襲實驗
在24孔Transwell上室的聚碳酸酯膜（膜孔徑為8μm）上涂1 g/L的基質膠70μL，使之在微孔濾膜上重組為基底膜結構（37℃、60 min）。4組細胞轉染8 h后更換培養液，繼續培養48 h，收集4組細胞，以RMPI 1640培養液（不加FBS）進行饑餓處理，使得細胞狀態一致。調整細胞濃度為l×109個/L。取細胞懸液200μL接種于Transwell上室內，下室加入含20%FBS的RMPI1640培養液500μL，在37℃、5%CO2條件下培養24 h后，將濾膜上層細胞用棉簽抹去，濾膜以甲醇固定，然后用結晶紫染色15 min。在200倍光鏡下隨機選擇膜上的6個不同視野，計算穿過膜的細胞數，求平均值。每組重復實驗3次。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0統計軟件包進行統計學分析。計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；計數資料分析采用χ2檢驗；生存曲線繪制及比較采用Kaplan-Meier法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白在胃癌組織中的表達及其臨床意義
46例胃癌患者中，SIRT1和VEGF-A蛋白的表達陽性率分別為65.2%（30/46）及58.7%（27/46），見表 1；在15例正常胃黏膜組織中，SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達陽性率分別為33.3%（5/15）及20.0%（3/15）。腫瘤組織中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達陽性率均較正常胃黏膜組織高（χ2=4.702，P=0.030；χ2=6.777，P=0.009），見圖 1。胃癌組織中SIRT1蛋白表達和VEGF-A蛋白表達之間并無明顯相關性（rc=0.129，P=0.393）。胃癌組織中SIRT1蛋白的表達與腫瘤直徑、T分期、淋巴結轉移及TNM分期均有關（P < 0.05），腫瘤越大、浸潤深度越深、出現淋巴結轉移及TNM分期越晚者其表達上調。胃癌組織中VEGF-A蛋白的表達與淋巴結轉移和TNM分期均有關（P < 0.05），出現淋巴結轉移和TNM分期晚者VEGF-A蛋白表達上調（表 1）。
表1
胃癌組織中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白表達與其臨床病理特征的關系（例）
Table1.
Relationship of clinicopathological features and expressions of SIRT1 and VEGF-A proteins in gastric cancer tissues (case)
2.2 SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白表達與胃癌患者預后的關系
本組患者均獲訪，隨訪時間截止到2007年10月10日。本組患者的生存時間為1～91個月，中位生存時間32.7個月。采用Kaplan-Meier法分析SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白表達與患者預后的關系。SIRT1蛋白陽性表達患者的中位生存時間為16個月，陰性表達患者為86個月，兩者的生存曲線比較其差異有統計學意義（χ2=10.704，P=0.001），提示SIRT1蛋白陰性表達胃癌患者的生存情況較好，見圖 2A。VEGF-A蛋白陽性表達患者的中位生存時間為17個月，陰性患者為53個月，兩者的生存曲線比較差異無統計學意義（χ2=2.853，P=0.091），見圖 2B。SIRT1及VEGF-A蛋白均呈陽性表達者的中位生存時間為11個月，SIRT1及VEGF-A蛋白任一表達陰性者為27個月，SIRT1及VEGF-A蛋白均呈陰性表達者為59個月，三者的生存曲線比較其差異有統計學意義（χ2=10.318，P=0.006），見圖 2C。提示SIRT1和VEGF-A蛋白表達均呈陽性表達者的總體生存情況差于SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白均呈陰性表達或任一蛋白表達陰性者。
圖1
正常胃黏膜組織和胃癌組織中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的免疫組化染色結果（SP×400）。1A：SIRT1蛋白在正常胃黏膜組織中的表達；1B：SIRT1蛋白在胃癌組織中的表達；1C：VEGF-A蛋白在正常胃黏膜組織中的表達；1D：VEGF-A蛋白在胃癌組織中的表達??圖 2不同SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白表達情況胃癌患者的生存曲線。2A：不同SIRT1蛋白表達情況胃癌患者的生存曲線；2B：不同VEGF-A蛋白表達情況胃癌患者的生存曲線；2C：不同SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白表達情況胃癌患者的生存曲線??圖 3 GES-1和SCG7901細胞株中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的電泳結果。3A：SIRT1蛋白；3B：VEGF-A蛋白??圖 4 4組SGC7901細胞中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的電泳結果。1：空白對照組；2：空脂質體組；3：siRNA陰性組；4：siRNA陽性組；??圖 5 4組SCG7901細胞的細胞侵襲實驗結果（結晶紫染色 ×200）。5A：空白對照組；5B：空脂質體組；5C：siRNA陰性組；5D：siRNA陽性組
Figure1.
The immunohistochemical staining results of SIR1 protein and VEGF-A protein in gastric cancer tissues and normal gastric tissues(SP×400).1A: The expression of SIRT1 protein in the normal gastric tissues; 1B: The expression of SIRT1 protein in the gastric cancer tissues; 1C: The expression of VEGF-A protein in the normal gastric tissues; 1D: The expression of VEGF-A protein in the gastric cancer tissues??Figure 2 Survival curves of different expressions of SIRT1 protein and VEGR-A protein.2A: Survival curves of different expressions of SIRT1 protein in patientswith gastric cancer; 2B: Survival curves of different expressions of VEGF-A protein in patients with gastric cancer; 2C: Survival curves of differentexpressions of SIRT1 protein and VEGF-A protein in patients with gastric cancer??Figure 3 The expressions of SIRT1 protein and VEGF-Aprotein in cell lines of GES-1 and SGC7901.3A: SIRT1 protein; 3B: VEGF-A protein??Figure 4 The expressions of SIRT1 protein and VEGF-Aprotein in SGC7901 cells of 4 groups.1: Blank control group; 2: Empty liposomes group; 3: siRNA negative group; 4: siRNA positive group?? Figure 5 Specific inhibited the expression of SIRT1 in SGC7901 cells resultet in the invasive ability change(crystal violet staining×200).5A:Blank control group; 5B: Empty liposomes group; 5C: siRNA negative group; 5D: siRNA positive group
2.3 GES-1和SCG7901細胞株中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達結果
采用Western blot法檢測GES-1和SGC7901細胞株中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達，結果發現，SGC7901細胞株中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的相對表達量分別是0.488 5±0.168 1和0.159 4±0.018 7，GES-1細胞株分別是0.091 2±0.016 5和0.028 5±0.003 8，SGC7901細胞株中該2種蛋白的相對表達量均較高（P=0.010，P=0.020），見圖 3。
2.4 4組SGC7901細胞中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達結果
空白對照組的SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達水平分別為1.00和1.00，空脂質體組分別為0.95和1.04，siRNA陰性組分別為1.05和1.10，siRNA陽性組分別為0.05和0.35。siRNA陽性組SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達水平均最低（P=0.012，P=0.020），見圖 4。提示特異性SIRT1-siRNA能夠明顯降低SGC7901細胞中SIRT1蛋白的表達水平，且特異性抑制SIRT1基因表達后VEGF-A蛋白的表達水平也明顯下降。
2.5 細胞侵襲實驗結果
Transwell細胞侵襲實驗結果（圖 5）顯示，穿過聚碳酸脂膜的細胞數空白對照組為（86±8）個，空脂質體組為（77±7）個，siRNA陰性組為（80±8）個，siRNA陽性組為（26±5）個，4組之間比較差異有統計學意義（P=0.000）。其中，siRNA陽性組低于空白對照組、空脂質體組及siRNA陰性組（P < 0.001），而后3組間比較差異無統計學意義（P > 0.050）。
3 討論
胃癌的侵襲和轉移是影響患者預后的重要因素，因其機理復雜，改善或逆轉侵襲和轉移方法的效果往往不佳。目前認為，血管生成是其中的一種重要機理，其涉及多種基因和蛋白的異常表達、生物學行為改變等。研究[8-9]表明，VEGF蛋白在胃癌組織中的過表達與其侵襲和轉移密切相關。其機理為，通過對毛細血管芽生的誘導及對內皮細胞遷移、分化、增生和血管管腔形成的調控，來促進腫瘤血管的生成[10]。VEGF-A蛋白即傳統意義上的VEGF蛋白，是目前已知最強的促血管生長因子。研究[10-11]表明，VEGF-A蛋白與經典抑癌基因p53的關系密切，野生型p53基因可以下調腫瘤組織中VEGF-A蛋白的表達而減少腫瘤新生血管的產生[11]，而突變型p53基因在胃癌組織中的表達與VEGF-A蛋白的高表達具有強相關性[12]。本實驗結果顯示，VEGF-A蛋白在胃癌組織中呈高表達，且其表達與淋巴結轉移和TNM分期相關，這與傅玉峰等[13]對胃癌的研究一致，提示VEGF-A蛋白與胃癌的侵襲和轉移密切相關。
SIRT1蛋白是人類sirtuins家族的重要成員之一，其能夠通過脫乙酰基及甲基化修飾作用調控組蛋白、通過脫乙酰作用調控非組蛋白、通過甲基化作用修飾DNA等，參與腫瘤的生長、增殖、侵襲、耐藥等多種病理過程[14-15]。但是SIRT1基因在腫瘤中的作用尚無定論，對其是促癌基因還是抑癌基因存在較大的爭議，其中在胃腸道腫瘤中的作用爭議最大[16]。研究[17-19]表明，SIRT1蛋白能夠使p53脫乙酰基，從而阻斷p53依賴的轉錄和凋亡過程，進而在腫瘤中起到促癌基因的作用。乳腺癌缺失基因1（deleted in breast cancer1，DBC1）和SIRT1基因在胃癌中的表達與胃癌的發生及發展均呈正相關關系，且其與p53的表達密切相關[20]。因此，SIRT1基因在胃癌中的角色更傾向于是促癌基因。本實驗結果顯示，SIRT1蛋白在胃癌組織中高表達，且其表達與腫瘤直徑、T分期、淋巴結轉移及TNM分期相關，陽性表達SIRT1蛋白的患者其中位生存時間明顯縮短。該結果提示，SIRT1蛋白在胃癌中主要表現為促癌的作用，其很可能參與了胃癌的侵襲、轉移等生物學行為。但有研究[21]表明，SIRT1蛋白在胃癌組織中的表達較癌旁組織明顯降低，且高表達患者的生存時間延長。其原因可能為，SIRT1能夠去乙酰化促腫瘤因子如β連環蛋白（β-cetanin）、核轉錄因子-κB（NF-κB）等的活性而促進腫瘤細胞的凋亡[22]。另外，SIRT1基因與p53、癌高甲基化1（hypermethylated in cancer 1，HIC1）基因等促癌基因之間存在一個環形通路，高表達的去乙酰化p53可以負反饋調節SIRT1蛋白的表達[23]。因此，SIRT1基因的確切作用仍需進一步探討。
通過siRNA小干擾技術，本實驗成功地抑制了SGC7901胃癌細胞株中SIRT1蛋白的表達，且VEGF-A蛋白的表達也明顯下調。Sun等[24]通過siRNA小干擾技術干擾了SGC7901胃癌細胞株中VEGF-A基因的表達后發現，SIRT1蛋白的表達隨之下調，表明胃癌組織中SIRT1蛋白的表達與VEGF-A蛋白的表達密切相關。通過聯合分析SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白表達對胃癌患者生存的影響發現，SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白均呈陽性表達時，其中位生存時間較單一陽性或均陰性者明顯縮短，這提示SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白對胃癌的惡性生物學行為有促進作用。其可能的機理是，SIRT1基因通過脫乙酰化p53，抑制p53的表達和活性，進而促進VEGF-A蛋白的表達。另外有研究[25]顯示，SIRT1基因通過去乙酰化轉錄因子1（FOXO1），抑制細胞衰老，進而促進內皮細胞增殖與血管發生。此外，SIRT1蛋白能夠通過增強一氧化氮合酶（eNOS）的功能，導致氮氧化合物水平增高，而氮氧化合物水平增高使腫瘤血管數目增加，營養加強[26]。通過細胞侵襲實驗發現，抑制SIRT1基因表達之后，SGC7901胃癌細胞的侵襲能力明顯減弱，這說明SIRT1基因可能促進了胃癌細胞的侵襲。
胃癌侵襲和轉移的機理復雜，如果能夠有效地改善或預防胃癌的侵襲、轉移和復發，則能夠明顯提高胃癌的治療效果，從而延長患者的生存時間。本實驗通過分析SIRT1蛋白與VEGF-A蛋白和胃癌細胞侵襲能力的關系，提示SIRT1蛋白可能通過促進VEGF-A蛋白的表達而促進胃癌的侵襲和轉移。這為胃癌的臨床治療提供了新的思路和治療靶點。但是，胃癌組織石蠟標本中SIRT1蛋白和VEGF-A蛋白的表達無明顯相關性，這可能因樣本量較小所致；且SIRT1基因對VEGF-A蛋白的作用及其信號通路尚不清楚，需要進一步開展大樣本研究加以探索。
