引用本文： 俞遠林, 姜波健, 陸瑞褀, 王守練, 俞繼衛. 膽囊癌CD133陽性細胞侵襲機制的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(2): 156-161. doi: 10.7507/1007-9424.20140036 復制
膽囊癌為膽管系統最常見的惡性腫瘤，其惡性程度高，轉移快，因而預后極差[1]。近年來發現，腫瘤起始細胞（tumor initiating cells，TICs）被認為是腫瘤發生、發展及轉移的根源[2]。本課題組[3]的前期實驗發現，膽囊癌CD133陽性細胞具有TICs部分特征。腫瘤侵襲是腫瘤轉移的關鍵環節，膽囊癌血行轉移極快，因而探索膽囊癌侵襲能力尤為必要。本研究旨在探究膽囊癌CD133陽性細胞的侵襲能力及其產生機制。
1 材料和方法
1.1 細胞和主要實驗試劑
人膽囊癌細胞株GBC-SD，中國科學院上海細胞生物學研究所，中國。胎牛血清，Hyclone公司，美國；DMEM培養基，吉諾生物醫藥科技有限公司，中國。山羊抗小鼠FITC標記的熒光二抗，北京鼎國生物有限責任公司，中國。CXCR4兔抗人多克隆抗體，Abcam公司，英國。CD133分選試劑盒、CD133鼠抗人單克隆抗體，Miltenyi公司，德國。辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，Jackson公司，美國。人重組基質細胞源性因子-1α（SDF-1α），PeproTech公司，美國。AMD3100，Sigma公司，美國。Trizol試劑和PCR試劑盒，Takara公司，日本。CXCR4引物和CD133引物，上海生工生物工程技術服務有限公司，中國。
1.2 細胞培養、免疫磁珠分選及實驗分組
膽囊癌GBC-SD細胞分別放于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM和RPMI1640培養基中，置37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中，每2～3 d傳代1次。收集傳代3～5次的GBC-SD細胞，調整細胞密度至1×107個/mL，用300μL緩沖液重懸，按操作步驟經MiniMACS分離柱分選，用無血清含20 ng/mL EGF及10 ng/mL bFGF的DMEM重懸，分選出CD133陽性細胞及CD133陰性細胞。實驗分為3組：①空白對照組，不加任何藥物的GBC-SD細胞；②SDF-1α組，100 ng/mL SDF-1α刺激細胞2 h；③AMD3100組，CXCR4特異性抑制劑AMD3100（40μmol/L）預處理細胞30 min [4]。
1.3 三種方法檢測CD133陽性細胞和CD133陰性細胞中CXCR4的表達
1.3.1 細胞免疫熒光法
取對數生長期的GBC-SD細胞接種于24孔板，每孔細胞數5×104個，4%冰多聚甲醛固定20 min，1% BSA封閉30 min，CD133鼠抗人單克隆抗體（1：11），4℃孵育過夜，加入山羊抗小鼠FITC標記的熒光二抗（1：200），采用DAPI行細胞核染色，PBS代替一抗作為陰性對照，置于熒光顯微鏡下觀察CD133陽性細胞和CD133陰性細胞中CXCR4的表達。
1.3.2 免疫蛋白印跡法（Western blot）
用100μL裂解液作用于1×105個胰酶消化后的GBC-SD細胞，冰上裂解30 min，獲取該組細胞的蛋白，每次均取15μL上樣量在10%分離膠、5%濃縮膠上面進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，經電轉膜儀轉至PVDF膜。然后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用5%脫脂奶粉稀釋的兔抗人CXCR4抗體（1：1 000）及CD133鼠抗人單克隆抗體（1：200），4℃輕搖過夜，用吐溫-20三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（TBST）振洗，洗3次，每次10 min，分別加HRP標記的山羊抗兔（1：2 000）和山羊抗鼠IgG二抗（1：2 000），室溫下孵育2 h，再用TBST振洗2次，每次10 min；去除吐溫的TBST振洗1次，每次10 min。加增強化學發光（ECL）底物顯色，曝光洗片。取膠片于掃描儀上獲取圖像，圖像分析軟件進行半定量分析，實驗重復3次取平均值[5]。
1.3.3 半定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）
Trizol法提取總RNA，取500 ng總RNA逆轉錄為cDNA，反應體系為42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min，總量為10μL。行PCR反應，CXCR4上游引物為5′-ATCATCTTCTTAACTGGCATTGTG-3′，下游引物為5′-GCTGTAGAGGTTGACTGTGTA-G-3′，產物長度228 bp，退火溫度為53℃；CD133上游引物為5′-TTACGGCACTCTTCACCT-3′，下游引物為5′-TAT-TCCACAAGCAGCAAA-3′，產物長度172 bp，退火溫度為57℃；GAPDH作為內參，上游引物為5′-A-CGGATTTGGTCGTATTGGGCG-3′，下游引物為5′-CTCCTGGA AGATGGTGATGG-3′，產物長度197 bp，退火溫度為55℃。取5μL CD133 PCR產物，2μL GAPDH PCR產物，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并保存圖像，應用凝膠成像系統及凝膠圖像分析軟件行半定量分析CD133和CXCR4產物與對應的GAPDH產物的灰度值。目的mRNA表達水平以目的mRNA擴增條帶灰度值與GAPDH mRNA擴增條帶灰度值比值表示，實驗重復3次，取平均值[5]。
1.4 Transwell小室檢測GBC-SD細胞的侵襲能力
將基質膠以1：1比例用無血清DMEM培養液稀釋后，取50μL鋪于Transwell上室中，置于37℃培養箱中，待上室的基質膠凝結。收集對數生長期GBC-SD細胞，以無血清DMEM培養基重懸，取無血清DMEM培養基重懸的GBC-SD細胞100μL加入Transwell上室中，調整細胞濃度為（1～5）×105個/孔，下室中加入含有20%胎牛血清的DMEM完全培養基，于37℃培養箱培養24 h后，取出Transwell小室，用棉簽擦去上室中的基質膠及細胞，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，在顯微鏡下平移非重疊觀察9個視野，計數其中的穿膜細胞數，并計算平均數，實驗結果最終以平均穿膜細胞數表示細胞的侵襲能力。
1.5 Transwell小室檢測GBC-SD細胞的遷移能力
收集各組對數生長期GBC-SD細胞，以無血清DMEM培養基重懸，取無血清DMEM培養基重懸的GBC-SD細胞100μL加入Transwell上室中，調整細胞濃度為（1～5）×105個/孔，下室中加入含有20%胎牛血清的DMEM完全培養基，37℃培養箱培養24 h后，取出Transwell小室，用棉簽擦去上室的細胞，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，在顯微鏡下平移非重疊觀察9個視野，計數其中的穿膜細胞數，并計算平均數，實驗結果最終以平均穿膜細胞數表示細胞的遷移能力。
1.6 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的侵襲能力檢測結果
CD133陽性細胞的穿膜細胞數為23.78±8.74，明顯多于CD133陰性細胞的穿膜細胞數（6.56±3.09），差異有統計學意義（P=0.000 7）。
2.2 定位與定量檢測CD133陽性細胞和CD133陰性細胞中CXCR4表達結果
①細胞免疫熒光法檢測發現，CD133陽性細胞中CXCR4蛋白表達強于CD133陰性細胞，且CXCR4蛋白主要定位于細胞膜（圖 1）。②RT-PCR法檢測的定性結果見圖 2A；半定量結果：CD133陽性細胞中CXCR4 mRNA相對灰度值為0.642 4±0.020 4，明顯高于CD133陰性細胞的0.335 9±0.043 2（P=0.004）。③Western blot法檢測的定性結果見圖 2B；半定量結果：CD133陽性細胞中CXCR4蛋白相對灰度值為0.765 0±0.106 6，明顯高于CD133陰性細胞的0.409 4±0.019 5（P=0.013）。
圖1
CD133陽性細胞和CD133陰性細胞中CXCR4蛋白表達結果（免疫熒光法×200）。1A：CD133陽性細胞；1B：CD133陰性細胞??圖 2 CD133陽性細胞和CD133陰性細胞CXCR4 mRNA和蛋白表達結果。2A：CXCR4 mRNA表達電泳圖。1：Marker；2：CD133陽性細胞；3：CD133陰性細胞。2B：CXCR4蛋白表達條帶圖。1：CD133陽性細胞；2：CD133陰性細胞
Figure1.
Results of CXCR4 protein in CD133 positive cells and CD133 negative cells (Immunofluorescence×200). 1A: CD133 positive cells; 1B: CD133 negative cells??Figure 2 Results of CXCR4 mRNA and protein in CD133 positive cells and CD133 negative cells. 2A: Electrophoretogram expression of CXCR4 mRNA. 1: Marker; 2: CD133 positive cells; 3: CD133 negative cells. 2B: Histogram expression of CXCR4 protein. 1: CD133 positive cells; 2: CD133 negative cells
2.3 SDF-1α、AMD3100處理后CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的侵襲能力檢測結果
Transwell法染色結果見圖 3。在CD133陽性細胞中的穿膜細胞數：與空白對照組（23.78±8.74）相比，SDF-1α組（62.89±15.27）明顯增加（P=0.000 6），AMD3100組（10.33±2.00）明顯減少（P=0.000 2）；在CD133陰性細胞中的穿膜細胞數：與空白對照組（6.59±3.09）相比，SDF-1α組（6.89±4.23）無明顯變化（P=0.41），AMD3100組（6.11±2.67）亦無明顯變化（P=0.38）。
圖3
Transwell法檢測各組CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的侵襲能力（倒置顯微鏡×200）??圖 4 Transwell法檢測各組CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的遷移能力（倒置顯微鏡×200）。3A、4A：空白對照組的CD133陽性細胞；3B、4B：SDF-1α組的CD133陽性細胞；3C、4C：AMD3100組的CD133陽性細胞；3D、4D：空白對照組的CD133陰性細胞；3E、4E：SDF-1α組的CD133陰性細胞；3F、4F：AMD3100組的CD133陰性細胞
Figure3.
Invasive abilities of CD133 positive cells and CD133 negative cells in each group by Transwell (Inverted microscope×200)??Figure 4 Migration abilities of CD133 positive cells and CD133 negative cells in each group by Transwell (Inverted microscope×200). 3A and 4A:CD133 positive cells in control group; 3B and 4B:CD133 positive cells in SDF-1αgroup; 3C and 4C:CD133 positive cells in AMD3100 group; 3D and 4D: CD133 negative cells in control group; 3E and 4E:CD133 negative cells in SDF-1αgroup; 3F and 4F:CD133 negative cells in AMD3100 group
2.4 SDF-1α、AMD3100處理后CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的遷移能力檢測結果
Transwell法染色結果見圖 4。在CD133陽性細胞中，與空白對照組（35.56±10.97）相比，SDF-1α組（74.56±15.80）穿膜細胞數明顯增加（P=0.000 3），AMD3100組（12.67±2.40）穿膜細胞數明顯減少（P=0.000 2）；在CD133陰性細胞中，與空白對照組（9.56±1.74）相比，SDF-1α組（9.78±2.04）穿膜細胞數無明顯變化（P=0.43），AMD3100組（9.54±1.74）穿膜細胞數亦無明顯變化（P=0.42）。
2.5 SDF-1α、AMD3100處理后GBC-SD細胞中CD133 mRNA和CD133蛋白表達結果
①RT-PCR檢測的定性結果見圖 5A；半定量結果：與空白對照組（0.450 0±0.024 3）相比，SDF-1α組（0.626 5±0.048 7）的CD133 mRNA表達明顯增加（P=0.004），AMD3100組（0.359 3±0.047 3）的CD133 mRNA表達明顯下降（P=0.011）。②Western blot檢測的定性結果見圖 5B；半定量結果：與空白照組（0.440 9±0.013 0）相比，SDF-1α組（0.508 9±0.020 7）的CD133蛋白表達明顯增加（P=0.016），而AMD3100組（0.317 7±0.013 7）的CD133蛋白表達明顯下降（P=0.004）。
圖5
各組GBC-SD細胞中CD133 mRNA和蛋白表達變化。5A：CD133 mRNA表達電泳圖。1：Marker；2：空白對照組；3：SDF-1α組；4：AMD3100組。5B：CD133蛋白表達條帶圖。1：空白對照組；2：SDF-1α組；3：AMD3100組
Figure5.
CD133 mRNA and protein expressions in GBC-SD cells. 5A: Electrophoretogram expression of CD133 mRNA. 1: Marker; 2: Control group; 3: SDF-1αgroup; 4: AMD3100 group. 5B: Histogram expression of CD133 protein. 1: Control group; 2: SDF-1αgroup; 3: AMD3100 group
3 討論
腫瘤發生大致有兩種解釋模型，一種是傳統的隨機模型，另一種是TICs模型。有別于隨機模型，TICs模型認為腫瘤是內部呈現異質性的等級結構，然而決定腫瘤無限增殖、自我更新及多向分化的關鍵僅為其中的一部分細胞即TICs。同時，TICs在啟動腫瘤侵襲和轉移過程中發揮著至關重要的作用[2]。
CD133是一種5次跨膜蛋白，起初作為造血干細胞的標志物。近年來發現，CD133已經作為TICs的表面標志物在多種實體腫瘤中得到論證[6-9]。基于本課題組[3]的前期實驗，我們從膽囊癌中成功分離出CD133陽性細胞，并發現CD133陽性細胞具有TICs的基本特性。本實驗中檢測了膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞的侵襲能力，發現CD133陽性細胞的侵襲能力明顯強于CD133陰性細胞。然而，解釋TICs發動侵襲的機制有多種，因而，本研究重點在于探究膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞侵襲的發生機制。
SDF-1α/CXCR4軸是由趨化因子SDF-1α與其特異性受體CXCR4相互作用而構成的一個與細胞間信息傳遞及細胞遷移有密切關系的偶聯分子對。研究[10-12]發現，SDF-1α/CXCR4軸參與啟動多種惡性腫瘤的侵襲和轉移過程。另有文獻[13-14]報道，CXCR4高表達與膽囊癌淋巴結浸潤和轉移呈正相關，并可作為監測預后的獨立因素。也有研究[15]發現，SDF-1α/CXCR4軸在乳腺癌、前列腺癌、肺癌及胰腺癌的遷移、侵襲和轉移過程中發揮關鍵作用。本實驗從定位和定量的層面發現，膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞的CXCR4表達明顯強于CD133陰性細胞；進一步研究SDF-1α刺激SDF-1α/CXCR4軸后，發現CD133陽性細胞的遷移和侵襲能力增強，而CD133陰性細胞無變化；AMD3100阻斷SDF-1α/CXCR4軸后，CD133陽性細胞的遷移和侵襲能力下調，而CD133陰性細胞無變化。以上結果提示，膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞可能通過富集CXCR4以啟動侵襲過程。
Ping等[16]報道，SDF-1α/CXCR4軸可通過PI3K/Akt信號通路刺激神經膠質瘤干細胞CD133表達上調，進而促進血管生成。本課題組[17]前期研究發現，在胃癌中，SDF-1α/CXCR4軸參與調控CD133的表達。本實驗發現，SDF-1α或AMD3100分別處理GBC-SD細胞后，CD133 mRNA和蛋白水平表達分別上調或下調，由此推測，SDF-1α/CXCR4軸可能涉及調控膽囊癌GBC-SD細胞中CD133的表達，從而維持其TICs的基本特性。在結腸癌研究[18]中發現，CXCR4和CD133聯合表達呈現較強的轉移能力。細胞分子生物學行為的調控往往是雙向的、多點的、網狀的。本實驗發現，膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞富集CXCR4，而SDF-1α/CXCR4軸又調控CD133的表達，推測CD133與CXCR4可能是互為依存的雙向調控關系。
綜上所述，膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞的侵襲能力的獲得可能是通過富集CXCR4發生的。相互地，SDF-1α/CXCR4軸也參與調控CD133的表達。本研究進一步闡述了膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞侵襲發生機制。然而，更為深入的分子生物學機制仍尚有待探討與研究。
膽囊癌為膽管系統最常見的惡性腫瘤，其惡性程度高，轉移快，因而預后極差[1]。近年來發現，腫瘤起始細胞（tumor initiating cells，TICs）被認為是腫瘤發生、發展及轉移的根源[2]。本課題組[3]的前期實驗發現，膽囊癌CD133陽性細胞具有TICs部分特征。腫瘤侵襲是腫瘤轉移的關鍵環節，膽囊癌血行轉移極快，因而探索膽囊癌侵襲能力尤為必要。本研究旨在探究膽囊癌CD133陽性細胞的侵襲能力及其產生機制。
1 材料和方法
1.1 細胞和主要實驗試劑
人膽囊癌細胞株GBC-SD，中國科學院上海細胞生物學研究所，中國。胎牛血清，Hyclone公司，美國；DMEM培養基，吉諾生物醫藥科技有限公司，中國。山羊抗小鼠FITC標記的熒光二抗，北京鼎國生物有限責任公司，中國。CXCR4兔抗人多克隆抗體，Abcam公司，英國。CD133分選試劑盒、CD133鼠抗人單克隆抗體，Miltenyi公司，德國。辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，Jackson公司，美國。人重組基質細胞源性因子-1α（SDF-1α），PeproTech公司，美國。AMD3100，Sigma公司，美國。Trizol試劑和PCR試劑盒，Takara公司，日本。CXCR4引物和CD133引物，上海生工生物工程技術服務有限公司，中國。
1.2 細胞培養、免疫磁珠分選及實驗分組
膽囊癌GBC-SD細胞分別放于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM和RPMI1640培養基中，置37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中，每2～3 d傳代1次。收集傳代3～5次的GBC-SD細胞，調整細胞密度至1×107個/mL，用300μL緩沖液重懸，按操作步驟經MiniMACS分離柱分選，用無血清含20 ng/mL EGF及10 ng/mL bFGF的DMEM重懸，分選出CD133陽性細胞及CD133陰性細胞。實驗分為3組：①空白對照組，不加任何藥物的GBC-SD細胞；②SDF-1α組，100 ng/mL SDF-1α刺激細胞2 h；③AMD3100組，CXCR4特異性抑制劑AMD3100（40μmol/L）預處理細胞30 min [4]。
1.3 三種方法檢測CD133陽性細胞和CD133陰性細胞中CXCR4的表達
1.3.1 細胞免疫熒光法
取對數生長期的GBC-SD細胞接種于24孔板，每孔細胞數5×104個，4%冰多聚甲醛固定20 min，1% BSA封閉30 min，CD133鼠抗人單克隆抗體（1：11），4℃孵育過夜，加入山羊抗小鼠FITC標記的熒光二抗（1：200），采用DAPI行細胞核染色，PBS代替一抗作為陰性對照，置于熒光顯微鏡下觀察CD133陽性細胞和CD133陰性細胞中CXCR4的表達。
1.3.2 免疫蛋白印跡法（Western blot）
用100μL裂解液作用于1×105個胰酶消化后的GBC-SD細胞，冰上裂解30 min，獲取該組細胞的蛋白，每次均取15μL上樣量在10%分離膠、5%濃縮膠上面進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，經電轉膜儀轉至PVDF膜。然后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用5%脫脂奶粉稀釋的兔抗人CXCR4抗體（1：1 000）及CD133鼠抗人單克隆抗體（1：200），4℃輕搖過夜，用吐溫-20三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（TBST）振洗，洗3次，每次10 min，分別加HRP標記的山羊抗兔（1：2 000）和山羊抗鼠IgG二抗（1：2 000），室溫下孵育2 h，再用TBST振洗2次，每次10 min；去除吐溫的TBST振洗1次，每次10 min。加增強化學發光（ECL）底物顯色，曝光洗片。取膠片于掃描儀上獲取圖像，圖像分析軟件進行半定量分析，實驗重復3次取平均值[5]。
1.3.3 半定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）
Trizol法提取總RNA，取500 ng總RNA逆轉錄為cDNA，反應體系為42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min，總量為10μL。行PCR反應，CXCR4上游引物為5′-ATCATCTTCTTAACTGGCATTGTG-3′，下游引物為5′-GCTGTAGAGGTTGACTGTGTA-G-3′，產物長度228 bp，退火溫度為53℃；CD133上游引物為5′-TTACGGCACTCTTCACCT-3′，下游引物為5′-TAT-TCCACAAGCAGCAAA-3′，產物長度172 bp，退火溫度為57℃；GAPDH作為內參，上游引物為5′-A-CGGATTTGGTCGTATTGGGCG-3′，下游引物為5′-CTCCTGGA AGATGGTGATGG-3′，產物長度197 bp，退火溫度為55℃。取5μL CD133 PCR產物，2μL GAPDH PCR產物，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并保存圖像，應用凝膠成像系統及凝膠圖像分析軟件行半定量分析CD133和CXCR4產物與對應的GAPDH產物的灰度值。目的mRNA表達水平以目的mRNA擴增條帶灰度值與GAPDH mRNA擴增條帶灰度值比值表示，實驗重復3次，取平均值[5]。
1.4 Transwell小室檢測GBC-SD細胞的侵襲能力
將基質膠以1：1比例用無血清DMEM培養液稀釋后，取50μL鋪于Transwell上室中，置于37℃培養箱中，待上室的基質膠凝結。收集對數生長期GBC-SD細胞，以無血清DMEM培養基重懸，取無血清DMEM培養基重懸的GBC-SD細胞100μL加入Transwell上室中，調整細胞濃度為（1～5）×105個/孔，下室中加入含有20%胎牛血清的DMEM完全培養基，于37℃培養箱培養24 h后，取出Transwell小室，用棉簽擦去上室中的基質膠及細胞，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，在顯微鏡下平移非重疊觀察9個視野，計數其中的穿膜細胞數，并計算平均數，實驗結果最終以平均穿膜細胞數表示細胞的侵襲能力。
1.5 Transwell小室檢測GBC-SD細胞的遷移能力
收集各組對數生長期GBC-SD細胞，以無血清DMEM培養基重懸，取無血清DMEM培養基重懸的GBC-SD細胞100μL加入Transwell上室中，調整細胞濃度為（1～5）×105個/孔，下室中加入含有20%胎牛血清的DMEM完全培養基，37℃培養箱培養24 h后，取出Transwell小室，用棉簽擦去上室的細胞，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，在顯微鏡下平移非重疊觀察9個視野，計數其中的穿膜細胞數，并計算平均數，實驗結果最終以平均穿膜細胞數表示細胞的遷移能力。
1.6 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的侵襲能力檢測結果
CD133陽性細胞的穿膜細胞數為23.78±8.74，明顯多于CD133陰性細胞的穿膜細胞數（6.56±3.09），差異有統計學意義（P=0.000 7）。
2.2 定位與定量檢測CD133陽性細胞和CD133陰性細胞中CXCR4表達結果
①細胞免疫熒光法檢測發現，CD133陽性細胞中CXCR4蛋白表達強于CD133陰性細胞，且CXCR4蛋白主要定位于細胞膜（圖 1）。②RT-PCR法檢測的定性結果見圖 2A；半定量結果：CD133陽性細胞中CXCR4 mRNA相對灰度值為0.642 4±0.020 4，明顯高于CD133陰性細胞的0.335 9±0.043 2（P=0.004）。③Western blot法檢測的定性結果見圖 2B；半定量結果：CD133陽性細胞中CXCR4蛋白相對灰度值為0.765 0±0.106 6，明顯高于CD133陰性細胞的0.409 4±0.019 5（P=0.013）。
圖1
CD133陽性細胞和CD133陰性細胞中CXCR4蛋白表達結果（免疫熒光法×200）。1A：CD133陽性細胞；1B：CD133陰性細胞??圖 2 CD133陽性細胞和CD133陰性細胞CXCR4 mRNA和蛋白表達結果。2A：CXCR4 mRNA表達電泳圖。1：Marker；2：CD133陽性細胞；3：CD133陰性細胞。2B：CXCR4蛋白表達條帶圖。1：CD133陽性細胞；2：CD133陰性細胞
Figure1.
Results of CXCR4 protein in CD133 positive cells and CD133 negative cells (Immunofluorescence×200). 1A: CD133 positive cells; 1B: CD133 negative cells??Figure 2 Results of CXCR4 mRNA and protein in CD133 positive cells and CD133 negative cells. 2A: Electrophoretogram expression of CXCR4 mRNA. 1: Marker; 2: CD133 positive cells; 3: CD133 negative cells. 2B: Histogram expression of CXCR4 protein. 1: CD133 positive cells; 2: CD133 negative cells
2.3 SDF-1α、AMD3100處理后CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的侵襲能力檢測結果
Transwell法染色結果見圖 3。在CD133陽性細胞中的穿膜細胞數：與空白對照組（23.78±8.74）相比，SDF-1α組（62.89±15.27）明顯增加（P=0.000 6），AMD3100組（10.33±2.00）明顯減少（P=0.000 2）；在CD133陰性細胞中的穿膜細胞數：與空白對照組（6.59±3.09）相比，SDF-1α組（6.89±4.23）無明顯變化（P=0.41），AMD3100組（6.11±2.67）亦無明顯變化（P=0.38）。
圖3
Transwell法檢測各組CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的侵襲能力（倒置顯微鏡×200）??圖 4 Transwell法檢測各組CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的遷移能力（倒置顯微鏡×200）。3A、4A：空白對照組的CD133陽性細胞；3B、4B：SDF-1α組的CD133陽性細胞；3C、4C：AMD3100組的CD133陽性細胞；3D、4D：空白對照組的CD133陰性細胞；3E、4E：SDF-1α組的CD133陰性細胞；3F、4F：AMD3100組的CD133陰性細胞
Figure3.
Invasive abilities of CD133 positive cells and CD133 negative cells in each group by Transwell (Inverted microscope×200)??Figure 4 Migration abilities of CD133 positive cells and CD133 negative cells in each group by Transwell (Inverted microscope×200). 3A and 4A:CD133 positive cells in control group; 3B and 4B:CD133 positive cells in SDF-1αgroup; 3C and 4C:CD133 positive cells in AMD3100 group; 3D and 4D: CD133 negative cells in control group; 3E and 4E:CD133 negative cells in SDF-1αgroup; 3F and 4F:CD133 negative cells in AMD3100 group
2.4 SDF-1α、AMD3100處理后CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的遷移能力檢測結果
Transwell法染色結果見圖 4。在CD133陽性細胞中，與空白對照組（35.56±10.97）相比，SDF-1α組（74.56±15.80）穿膜細胞數明顯增加（P=0.000 3），AMD3100組（12.67±2.40）穿膜細胞數明顯減少（P=0.000 2）；在CD133陰性細胞中，與空白對照組（9.56±1.74）相比，SDF-1α組（9.78±2.04）穿膜細胞數無明顯變化（P=0.43），AMD3100組（9.54±1.74）穿膜細胞數亦無明顯變化（P=0.42）。
2.5 SDF-1α、AMD3100處理后GBC-SD細胞中CD133 mRNA和CD133蛋白表達結果
①RT-PCR檢測的定性結果見圖 5A；半定量結果：與空白對照組（0.450 0±0.024 3）相比，SDF-1α組（0.626 5±0.048 7）的CD133 mRNA表達明顯增加（P=0.004），AMD3100組（0.359 3±0.047 3）的CD133 mRNA表達明顯下降（P=0.011）。②Western blot檢測的定性結果見圖 5B；半定量結果：與空白照組（0.440 9±0.013 0）相比，SDF-1α組（0.508 9±0.020 7）的CD133蛋白表達明顯增加（P=0.016），而AMD3100組（0.317 7±0.013 7）的CD133蛋白表達明顯下降（P=0.004）。
圖5
各組GBC-SD細胞中CD133 mRNA和蛋白表達變化。5A：CD133 mRNA表達電泳圖。1：Marker；2：空白對照組；3：SDF-1α組；4：AMD3100組。5B：CD133蛋白表達條帶圖。1：空白對照組；2：SDF-1α組；3：AMD3100組
Figure5.
CD133 mRNA and protein expressions in GBC-SD cells. 5A: Electrophoretogram expression of CD133 mRNA. 1: Marker; 2: Control group; 3: SDF-1αgroup; 4: AMD3100 group. 5B: Histogram expression of CD133 protein. 1: Control group; 2: SDF-1αgroup; 3: AMD3100 group
3 討論
腫瘤發生大致有兩種解釋模型，一種是傳統的隨機模型，另一種是TICs模型。有別于隨機模型，TICs模型認為腫瘤是內部呈現異質性的等級結構，然而決定腫瘤無限增殖、自我更新及多向分化的關鍵僅為其中的一部分細胞即TICs。同時，TICs在啟動腫瘤侵襲和轉移過程中發揮著至關重要的作用[2]。
CD133是一種5次跨膜蛋白，起初作為造血干細胞的標志物。近年來發現，CD133已經作為TICs的表面標志物在多種實體腫瘤中得到論證[6-9]。基于本課題組[3]的前期實驗，我們從膽囊癌中成功分離出CD133陽性細胞，并發現CD133陽性細胞具有TICs的基本特性。本實驗中檢測了膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞的侵襲能力，發現CD133陽性細胞的侵襲能力明顯強于CD133陰性細胞。然而，解釋TICs發動侵襲的機制有多種，因而，本研究重點在于探究膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞侵襲的發生機制。
SDF-1α/CXCR4軸是由趨化因子SDF-1α與其特異性受體CXCR4相互作用而構成的一個與細胞間信息傳遞及細胞遷移有密切關系的偶聯分子對。研究[10-12]發現，SDF-1α/CXCR4軸參與啟動多種惡性腫瘤的侵襲和轉移過程。另有文獻[13-14]報道，CXCR4高表達與膽囊癌淋巴結浸潤和轉移呈正相關，并可作為監測預后的獨立因素。也有研究[15]發現，SDF-1α/CXCR4軸在乳腺癌、前列腺癌、肺癌及胰腺癌的遷移、侵襲和轉移過程中發揮關鍵作用。本實驗從定位和定量的層面發現，膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞的CXCR4表達明顯強于CD133陰性細胞；進一步研究SDF-1α刺激SDF-1α/CXCR4軸后，發現CD133陽性細胞的遷移和侵襲能力增強，而CD133陰性細胞無變化；AMD3100阻斷SDF-1α/CXCR4軸后，CD133陽性細胞的遷移和侵襲能力下調，而CD133陰性細胞無變化。以上結果提示，膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞可能通過富集CXCR4以啟動侵襲過程。
Ping等[16]報道，SDF-1α/CXCR4軸可通過PI3K/Akt信號通路刺激神經膠質瘤干細胞CD133表達上調，進而促進血管生成。本課題組[17]前期研究發現，在胃癌中，SDF-1α/CXCR4軸參與調控CD133的表達。本實驗發現，SDF-1α或AMD3100分別處理GBC-SD細胞后，CD133 mRNA和蛋白水平表達分別上調或下調，由此推測，SDF-1α/CXCR4軸可能涉及調控膽囊癌GBC-SD細胞中CD133的表達，從而維持其TICs的基本特性。在結腸癌研究[18]中發現，CXCR4和CD133聯合表達呈現較強的轉移能力。細胞分子生物學行為的調控往往是雙向的、多點的、網狀的。本實驗發現，膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞富集CXCR4，而SDF-1α/CXCR4軸又調控CD133的表達，推測CD133與CXCR4可能是互為依存的雙向調控關系。
綜上所述，膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞的侵襲能力的獲得可能是通過富集CXCR4發生的。相互地，SDF-1α/CXCR4軸也參與調控CD133的表達。本研究進一步闡述了膽囊癌GBC-SD細胞中CD133陽性細胞侵襲發生機制。然而，更為深入的分子生物學機制仍尚有待探討與研究。
