引用本文： 李威, 姜波健, 俞繼衛. CD44與CD133蛋白在胃癌組織中的表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(1): 21-28. doi: 10.7507/1007-9424.20140005 復制
在世界范圍內胃癌是最常見的腫瘤之一，死亡率高，其發生、發展、浸潤、轉移以及復發的機理仍不明確[1]。雖然根治性切除是治愈的唯一辦法，但總體術后5年生存率在多數國家僅為20%～25%。對伴有遠處轉移和廣泛淋巴結轉移的胃癌患者，仍缺乏有效的治療手段[2]。
近年來，腫瘤干細胞理論使人們對腫瘤有了新的認識。研究[3]發現，胃腸道腫瘤或是一種干細胞疾病，可由干細胞突變而來。干細胞在腫瘤的發生、發展進程中實現自我更新和無限分化與增殖。腫瘤干細胞不僅能啟動腫瘤發生，還參與腫瘤細胞的侵襲和轉移。因此，對腫瘤干細胞來說，識別其特異性細胞表面標志物的研究已成為熱點。CD44及CD133是近期研究較多的腫瘤標志物。研究[4]發現，兩者極可能在胃腸癌干細胞參與腫瘤侵襲、轉移機理中起重要作用。目前，已有研究[5]證明，在大多數的腦腫瘤、前列腺癌、肺癌、腸癌等組織中，均可以檢測到有CD133+細胞和CD44+細胞的表達。然而，CD44與CD133可否作為胃癌腫瘤干細胞標志物仍存有爭議[6]，但也有研究[7]表明，CD133+細胞和CD44+細胞具有腫瘤干細胞的多種生物學特征。本研究應用免疫組化染色方法檢測了人胃癌原發病灶中CD133和CD44蛋白的表達，以分析相關臨床病理因素對其表達的影響，進而分析CD133和CD44蛋白的表達與胃癌臨床病理特征以及患者預后的關系。
1 資料和方法
1.1 病例資料和組織樣本來源
經倫理委員審批后同意，選取上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院普外一科2007年7月年至2010年5月期間收治并獲得隨訪的100例胃腺癌患者作為研究對象，男68例，女32例；年齡34～83歲，中位年齡59歲；均行胃癌根治術（D2、R0）；隨訪截止時間為2013年5月30日，失訪率為0。新鮮標本獲取經患者及其家屬知情同意，取自切除的胃癌病灶或配對的距原發灶邊緣5 cm以上并獲得病理學檢查證實的正常胃黏膜組織；術中嚴格遵循無瘤原則，避免擠壓。所有患者術前均未行放療或化療。為減少手術因素影響，術后3個月內死亡患者未納入該研究，排除年齡大于85歲以上高齡患者，所有入選者隨訪時間不少于3年。全部患者的臨床病理資料根據日本胃癌學會胃癌治療規范第12版標準[8]進行綜合評估。
1.2 主要試劑
鼠抗人CD133單克隆抗體（德國美天旎Miltenyi Biotec公司），鼠抗人CD44單克隆抗體（美國Abcam公司），ABC試劑及二抗購自中國上海碧云天公司，其他所需試劑及染料如雙氧水、蒸餾水、PBS、二甲苯、枸櫞酸、蘇木精等免疫組化配套試劑均由上海市第三人民醫院病理科提供。
1.3 胃癌組織中CD133及CD44蛋白表達的檢測
1.3.1 檢測方法
采用免疫組化SABC法。將用10%甲醛固定、石蠟包埋的胃癌組織標本切片（每份標本行4μm連續貼鄰切片）置58～60℃烤箱中60 min，固定標本。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。30% H2O2＋蒸餾水10份混合，室溫處理10 min以除去內源性過氧化物酶，將切片浸入pH 6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中，放于微波爐，中火3 min行抗原修復。隨后用PBS沖洗3次；滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫20 min后，甩去多余液體，不洗。滴加一抗，CD44單克隆抗體稀釋度為1∶200，CD133單克隆抗體稀釋度為1∶40。滴注一抗后，4℃過夜。PBS沖洗后滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，5～10 min。PBS沖洗后滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC），37℃20 min，PBS沖洗后用二氨基聯苯胺（DAB）染色，取1 mL蒸餾水，加試劑盒中DAB顯色劑ABC試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫下顯色，鏡下控制反應時間20 min。蘇木精復染1 min。脫水、透明、封片。以試劑公司提供的已知陽性切片作為陽性對照，以PBS替代一抗作為陰性對照。
1.3.2 結果判定標準CD44及CD133蛋白表達
陽性細胞，其細胞膜染色均呈棕黃色。由兩個病理科醫師在未知臨床病理資料下讀取結果，并協商取得統一。結果判斷標準：有棕褐色或棕黃色著色者為陽性。每張組織切片隨機選5個高倍視野，計數500個細胞，其陽性細胞數＜5%者判為陰性，≥5%為陽性，其中5%～25%為弱陽性，25%～50%為中陽性，＞50%為強陽性。
1.4 統計學方法
采用SPSS 21.0軟件行統計學處理。CD44和CD133蛋白的表達與胃癌臨床病理特征間的關系行Pearson χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier方法；生存率的統計分析采用log-rank方法；影響預后的多因素分析采用Cox風險回歸方法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 胃癌組織中CD133及CD44蛋白表達檢測結果
CD44及CD133蛋白在胃癌組織中均有廣泛表達，光鏡下見CD44和CD133蛋白主要定位表達于細胞膜，細胞漿可見少量CD44和CD133蛋白表達；而距胃癌原發灶邊緣5 cm以上的正常胃黏膜組織中CD44和CD133蛋白表達為陰性（圖 1）。本組100例胃癌患者中59例（59.0%）CD44蛋白呈陽性表達，49例（49.0%）CD133蛋白呈陽性表達。
圖1
示胃癌原發灶及正常胃黏膜組織中CD44和CD133蛋白的表達。1A：胃癌組織中CD44蛋白呈陽性表達（SABC法×400）；1B：正常胃黏膜組織中CD44蛋白呈陰性表達（SABC法×100）；1C：胃癌組織中CD133蛋白呈陽性表達（SABC法×400）；1D：正常胃黏膜組織中CD133蛋白呈陰性表達（SABC法×100）
Figure1.
Expressions of CD44 and CD133 protein in gastric cancer and normal gastric mucosa tissues. 1A:Positive expression of CD44 in gastric cancer tissues (SABC×400); 1B:Negative expression of CD44 in normal gastric mucosa tissues (SABC×100);1C:Positive expression of CD133 in gastric cancer tissues (SABC×400);1D:Negative expression of CD133 in normal gastric mucosa tissues (SABC×100)
2.2 胃癌組織中CD44及CD133蛋白表達與胃癌臨床病理特征間的關系
結果見表 1。由表 1可見，胃癌組織中CD44及CD133蛋白的表達與胃癌患者的年齡和性別無關（P＞0.05），但與腫瘤大小、組織學分級、血管浸潤、淋巴管浸潤、腫瘤T分期、N分期以及pTNM分期均有關（P＜0.05），其中，腫瘤直徑越大、組織學分級越高、有血管浸潤、有淋巴管浸潤、有淋巴結轉移、腫瘤浸潤得越深以及pTNM分期越高，其CD44和CD133蛋白表達陽性率越高。
表1
胃癌組織中CD44和CD133蛋白的表達與胃癌患者的臨床病理特征的關系
Table1.
Relationship between the expressions of CD44 and CD133 protein and clinicopathologic features of patients with gastric cancer
CD44及CD133蛋白呈雙陽性表達與胃癌臨床病理特征的關系結果見表 2。由表 2可見，兩者呈雙陽性表達與患者的年齡及性別、腫瘤組織學分級以及血管浸潤無關，但與腫瘤大小、淋巴管浸潤、腫瘤T分期、N分期以及pTNM分期有關。其中，腫瘤直徑越大（P=0.010），有淋巴管浸潤（P=0.003），有淋巴結轉移（P=0.045），腫瘤的浸潤越深（P=0.041），pTNM分期越高（P=0.049），CD44+ CD133+雙陽性表達率越高。
表2
CD44及CD133蛋白雙陽性表達和胃癌患者臨床病理特征的關系
Table2.
Relationship between co-expression of CD44 and CD133 protein and clinicopathologic features of patients with gastric cancer
2.3 CD44蛋白與CD133蛋白表達的關系
Spearman等級相關分析示CD44蛋白與CD133蛋白表達呈正相關關系（r=0.207，P=0.039）。
2.4 生存分析結果
本組患者均獲3～5年隨訪，平均48個月。單因素分析顯示，CD44陽性表達（P=0.005）、CD133陽性表達（P=0.002）及CD44+ CD133+雙陽性表達（P＜0.001）與患者的3年生存率均有關，經log-rank法檢驗各組3年生存率差異具有統計學意義（P＜0.05）；與單一的CD44或CD133陽性表達相比，CD44和CD133雙陽性表達提示預后更差（P＜0.001），見圖 2。
圖2
CD44和CD133蛋白單獨表達以及共同表達與胃癌患者術后生存的關系。2A：CD44+者與CD44-者比較；2B：CD133+者與CD133-者比較；2C：CD44+CD133+者與其他患者比較，其他組包括CD44-CD133-、CD44+CD133-以及CD44-和CD133+者
Figure2.
Relationship between the survival postoperative patients of gastric cancer with expression of CD44 protein or CD133 protein or Co-expression of them. 2A:CD44+vs. CD44-; 2B:CD133+vs. CD133-; 2C:CD44+CD133+vs. Other group; Other group include the CD44-CD133-, CD44+CD133-, and CD44-CD133+ patients
胃癌組織中CD44及CD133雙陽性表達的log-istic回歸分析提示，CD44與CD133蛋白雙陽性表達是淋巴結轉移（P=0.038）的獨立危險因素（表 3）。Cox風險回歸多因素生存分析顯示，淋巴結轉移（P=0.006）及CD44和CD133雙陽性表達（P=0.003）為影響患者術后生存的獨立預后因素（表 4）。
表3
胃癌組織中CD44及CD133蛋白雙陽性表達與胃癌患者臨床病理特征關系的logistic回歸分析結果
Table3.
Results of logistic regression analysis for relationship between co-expression of CD44 and CD133 and clinicopathologic features of patients with gastric cancer
表4
Cox回歸模型多因素生存分析結果
Table4.
Results of Cox proportional hazards model for survival analysis
3 討論
腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織中的極少部分具有干細胞性質的細胞群體，具有自我更新能力和多向分化潛能。腫瘤干細胞學說認為，腫瘤干細胞是腫瘤形成及其不斷生長的根源[9]。腫瘤干細胞最先發現在急性粒細胞白血病中。Bonnet等[10]成功分離出CD34+CD38-表型的急性髓細胞白血病（AML）細胞，并驗證了極少量腫瘤干細胞在NOD/SCID小鼠體內的致瘤過程。研究腫瘤干細胞特異性以及相關的細胞表面標志物已成為近年的研究熱點，而其中CD44與CD133是備受關注的腫瘤特異性標志物。CD133抗原是一個相對分子量為120×103的5次跨膜糖蛋白，包括細胞膜外的氨基末端、2個短的細胞內環和2個長的細胞外環以及細胞內的羧基末端，主要分布在細胞膜突部分。CD133在不同的腫瘤組織或胚胎組織中的表達情況不同，主要特異性表達于組織干細胞群或腫瘤干細胞亞群中[11]。CD44分子作為一種細胞黏附分子，其正常功能是介導淋巴細胞的歸巢、淋巴細胞向炎癥部位和黏膜相關淋巴組織歸位、黏附細胞外基質等[12]。研究[13]發現，兩者極可能在胃腸癌干細胞參與腫瘤侵襲以及轉移機理中起重要作用，并與腫瘤的發生、侵襲、轉移、耐藥以及復發有密切關系。因此，深入了解CD44與CD133的分子生物學特性，對尋求有效的抗癌治療尤其是對腫瘤干細胞的靶向治療具有深遠的意義。
對于這兩種腫瘤干細胞標志物，有文獻[14-15]報道稱CD44與CD133可作為結直腸癌腫瘤干細胞良好的標志物，并且聯合兩者能更好地分選和純化結直腸癌腫瘤干細胞。研究[16]發現，CD44與CD133在結直腸癌伴早期肝轉移的患者中的表達明顯高于不伴肝轉移組，且經單因素與多因素生存分析表明，CD133與CD44的共表達程度與患者預后情況呈負相關，通過對患者的年齡、Dukes分期及淋巴結轉移的多因素分析發現，CD133與CD44共表達是影響患者預后的獨立因素，提示CD133與CD44在結腸癌伴早期肝轉移的腫瘤細胞中的共表達可作為判斷結腸癌早期肝轉移的重要腫瘤標志物。研究[17-18]顯示，CD44可作為非典型WNT信號通路的靶向基因，密切聯系并參與腫瘤細胞生物學進程（如浸潤、轉移）及病理學過程。本課題組前期研究[19]發現，CXCR4能通過PI3K/Akt通路上調腫瘤起始細胞標志物CD133的表達；而CD133+細胞能促進胃癌增殖和侵襲能力的增強[20]。本實驗應用免疫組化方法檢測胃癌組織中CD44及CD133的表達，發現兩者表達陽性率在有淋巴結轉移組顯著高于無淋巴結轉移組，且兩者的陽性表達提示胃癌腫瘤分期較晚、患者預后差，是影響胃癌患者預后的獨立因素。有研究[21-22]發現，多種腫瘤干細胞標志物的組合可進一步識別腫瘤干細胞表型，并可分離一種甚至多種致瘤亞群。因此，對CD44及CD133兩種腫瘤干細胞標志物在胃癌腫瘤組織中的生物學功能、兩者間共表達可能存在的交互作用的機理及其與臨床病理特征的關系的研究備受矚目。
本實驗檢測了CD44及CD133這兩種腫瘤干細胞標志物在胃癌組織中的表達與分布情況。CD44陽性細胞細胞膜染色，CD133陽性細胞頂端膜染色，兩者細胞漿均不染色。本實驗檢測胃癌組織中有59.0%的CD44以及49.0%的CD133呈陽性表達，這兩種標志物主要高表達于癌巢區域，且其表達陽性率與腫瘤大小、組織學分級、血管浸潤、淋巴管浸潤、淋巴結轉移以及腫瘤TMN分期均有關（P＜0.05），即腫瘤直徑越大、組織學分級越高、有血管浸潤、有淋巴管浸潤、有淋巴結轉移以及腫瘤浸潤越深，其CD44和CD133表達陽性率越高。Cox回歸分析發現，有淋巴結轉移者以及CD44和CD133共表達提示患者的預后較差。該結果與國外相關文獻[23-25]報道結果相一致。同時經Spearman等級相關分析發現，CD44蛋白的表達與CD133蛋白的表達呈正相關關系（r=0.207，P=0.039），提示CD44與CD133的表達可能存在一定的協同作用，通過某種機理將兩者聯合起來，從而促使腫瘤細胞的黏附力降低，遷移率提高，從而提高了腫瘤的侵襲與轉移潛能。因此，兩者的聯合作用促進了腫瘤的浸潤與轉移。另外，與CD44或CD133單一預測因素相比，該兩種標志物的共表達或更可能是一獨立的預后判斷因素。
綜上所述，對CD44及CD133蛋白在癌組織中共表達的檢測可能是預判腫瘤復發和轉移的可行方法，并對胃癌轉移和復發的機理研究提供初步的臨床數據分析，進而為尋找新的靶向治療提供新的潛在靶點。
在世界范圍內胃癌是最常見的腫瘤之一，死亡率高，其發生、發展、浸潤、轉移以及復發的機理仍不明確[1]。雖然根治性切除是治愈的唯一辦法，但總體術后5年生存率在多數國家僅為20%～25%。對伴有遠處轉移和廣泛淋巴結轉移的胃癌患者，仍缺乏有效的治療手段[2]。
近年來，腫瘤干細胞理論使人們對腫瘤有了新的認識。研究[3]發現，胃腸道腫瘤或是一種干細胞疾病，可由干細胞突變而來。干細胞在腫瘤的發生、發展進程中實現自我更新和無限分化與增殖。腫瘤干細胞不僅能啟動腫瘤發生，還參與腫瘤細胞的侵襲和轉移。因此，對腫瘤干細胞來說，識別其特異性細胞表面標志物的研究已成為熱點。CD44及CD133是近期研究較多的腫瘤標志物。研究[4]發現，兩者極可能在胃腸癌干細胞參與腫瘤侵襲、轉移機理中起重要作用。目前，已有研究[5]證明，在大多數的腦腫瘤、前列腺癌、肺癌、腸癌等組織中，均可以檢測到有CD133+細胞和CD44+細胞的表達。然而，CD44與CD133可否作為胃癌腫瘤干細胞標志物仍存有爭議[6]，但也有研究[7]表明，CD133+細胞和CD44+細胞具有腫瘤干細胞的多種生物學特征。本研究應用免疫組化染色方法檢測了人胃癌原發病灶中CD133和CD44蛋白的表達，以分析相關臨床病理因素對其表達的影響，進而分析CD133和CD44蛋白的表達與胃癌臨床病理特征以及患者預后的關系。
1 資料和方法
1.1 病例資料和組織樣本來源
經倫理委員審批后同意，選取上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院普外一科2007年7月年至2010年5月期間收治并獲得隨訪的100例胃腺癌患者作為研究對象，男68例，女32例；年齡34～83歲，中位年齡59歲；均行胃癌根治術（D2、R0）；隨訪截止時間為2013年5月30日，失訪率為0。新鮮標本獲取經患者及其家屬知情同意，取自切除的胃癌病灶或配對的距原發灶邊緣5 cm以上并獲得病理學檢查證實的正常胃黏膜組織；術中嚴格遵循無瘤原則，避免擠壓。所有患者術前均未行放療或化療。為減少手術因素影響，術后3個月內死亡患者未納入該研究，排除年齡大于85歲以上高齡患者，所有入選者隨訪時間不少于3年。全部患者的臨床病理資料根據日本胃癌學會胃癌治療規范第12版標準[8]進行綜合評估。
1.2 主要試劑
鼠抗人CD133單克隆抗體（德國美天旎Miltenyi Biotec公司），鼠抗人CD44單克隆抗體（美國Abcam公司），ABC試劑及二抗購自中國上海碧云天公司，其他所需試劑及染料如雙氧水、蒸餾水、PBS、二甲苯、枸櫞酸、蘇木精等免疫組化配套試劑均由上海市第三人民醫院病理科提供。
1.3 胃癌組織中CD133及CD44蛋白表達的檢測
1.3.1 檢測方法
采用免疫組化SABC法。將用10%甲醛固定、石蠟包埋的胃癌組織標本切片（每份標本行4μm連續貼鄰切片）置58～60℃烤箱中60 min，固定標本。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。30% H2O2＋蒸餾水10份混合，室溫處理10 min以除去內源性過氧化物酶，將切片浸入pH 6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中，放于微波爐，中火3 min行抗原修復。隨后用PBS沖洗3次；滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫20 min后，甩去多余液體，不洗。滴加一抗，CD44單克隆抗體稀釋度為1∶200，CD133單克隆抗體稀釋度為1∶40。滴注一抗后，4℃過夜。PBS沖洗后滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，5～10 min。PBS沖洗后滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC），37℃20 min，PBS沖洗后用二氨基聯苯胺（DAB）染色，取1 mL蒸餾水，加試劑盒中DAB顯色劑ABC試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫下顯色，鏡下控制反應時間20 min。蘇木精復染1 min。脫水、透明、封片。以試劑公司提供的已知陽性切片作為陽性對照，以PBS替代一抗作為陰性對照。
1.3.2 結果判定標準CD44及CD133蛋白表達
陽性細胞，其細胞膜染色均呈棕黃色。由兩個病理科醫師在未知臨床病理資料下讀取結果，并協商取得統一。結果判斷標準：有棕褐色或棕黃色著色者為陽性。每張組織切片隨機選5個高倍視野，計數500個細胞，其陽性細胞數＜5%者判為陰性，≥5%為陽性，其中5%～25%為弱陽性，25%～50%為中陽性，＞50%為強陽性。
1.4 統計學方法
采用SPSS 21.0軟件行統計學處理。CD44和CD133蛋白的表達與胃癌臨床病理特征間的關系行Pearson χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier方法；生存率的統計分析采用log-rank方法；影響預后的多因素分析采用Cox風險回歸方法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 胃癌組織中CD133及CD44蛋白表達檢測結果
CD44及CD133蛋白在胃癌組織中均有廣泛表達，光鏡下見CD44和CD133蛋白主要定位表達于細胞膜，細胞漿可見少量CD44和CD133蛋白表達；而距胃癌原發灶邊緣5 cm以上的正常胃黏膜組織中CD44和CD133蛋白表達為陰性（圖 1）。本組100例胃癌患者中59例（59.0%）CD44蛋白呈陽性表達，49例（49.0%）CD133蛋白呈陽性表達。
圖1
示胃癌原發灶及正常胃黏膜組織中CD44和CD133蛋白的表達。1A：胃癌組織中CD44蛋白呈陽性表達（SABC法×400）；1B：正常胃黏膜組織中CD44蛋白呈陰性表達（SABC法×100）；1C：胃癌組織中CD133蛋白呈陽性表達（SABC法×400）；1D：正常胃黏膜組織中CD133蛋白呈陰性表達（SABC法×100）
Figure1.
Expressions of CD44 and CD133 protein in gastric cancer and normal gastric mucosa tissues. 1A:Positive expression of CD44 in gastric cancer tissues (SABC×400); 1B:Negative expression of CD44 in normal gastric mucosa tissues (SABC×100);1C:Positive expression of CD133 in gastric cancer tissues (SABC×400);1D:Negative expression of CD133 in normal gastric mucosa tissues (SABC×100)
2.2 胃癌組織中CD44及CD133蛋白表達與胃癌臨床病理特征間的關系
結果見表 1。由表 1可見，胃癌組織中CD44及CD133蛋白的表達與胃癌患者的年齡和性別無關（P＞0.05），但與腫瘤大小、組織學分級、血管浸潤、淋巴管浸潤、腫瘤T分期、N分期以及pTNM分期均有關（P＜0.05），其中，腫瘤直徑越大、組織學分級越高、有血管浸潤、有淋巴管浸潤、有淋巴結轉移、腫瘤浸潤得越深以及pTNM分期越高，其CD44和CD133蛋白表達陽性率越高。
表1
胃癌組織中CD44和CD133蛋白的表達與胃癌患者的臨床病理特征的關系
Table1.
Relationship between the expressions of CD44 and CD133 protein and clinicopathologic features of patients with gastric cancer
CD44及CD133蛋白呈雙陽性表達與胃癌臨床病理特征的關系結果見表 2。由表 2可見，兩者呈雙陽性表達與患者的年齡及性別、腫瘤組織學分級以及血管浸潤無關，但與腫瘤大小、淋巴管浸潤、腫瘤T分期、N分期以及pTNM分期有關。其中，腫瘤直徑越大（P=0.010），有淋巴管浸潤（P=0.003），有淋巴結轉移（P=0.045），腫瘤的浸潤越深（P=0.041），pTNM分期越高（P=0.049），CD44+ CD133+雙陽性表達率越高。
表2
CD44及CD133蛋白雙陽性表達和胃癌患者臨床病理特征的關系
Table2.
Relationship between co-expression of CD44 and CD133 protein and clinicopathologic features of patients with gastric cancer
2.3 CD44蛋白與CD133蛋白表達的關系
Spearman等級相關分析示CD44蛋白與CD133蛋白表達呈正相關關系（r=0.207，P=0.039）。
2.4 生存分析結果
本組患者均獲3～5年隨訪，平均48個月。單因素分析顯示，CD44陽性表達（P=0.005）、CD133陽性表達（P=0.002）及CD44+ CD133+雙陽性表達（P＜0.001）與患者的3年生存率均有關，經log-rank法檢驗各組3年生存率差異具有統計學意義（P＜0.05）；與單一的CD44或CD133陽性表達相比，CD44和CD133雙陽性表達提示預后更差（P＜0.001），見圖 2。
圖2
CD44和CD133蛋白單獨表達以及共同表達與胃癌患者術后生存的關系。2A：CD44+者與CD44-者比較；2B：CD133+者與CD133-者比較；2C：CD44+CD133+者與其他患者比較，其他組包括CD44-CD133-、CD44+CD133-以及CD44-和CD133+者
Figure2.
Relationship between the survival postoperative patients of gastric cancer with expression of CD44 protein or CD133 protein or Co-expression of them. 2A:CD44+vs. CD44-; 2B:CD133+vs. CD133-; 2C:CD44+CD133+vs. Other group; Other group include the CD44-CD133-, CD44+CD133-, and CD44-CD133+ patients
胃癌組織中CD44及CD133雙陽性表達的log-istic回歸分析提示，CD44與CD133蛋白雙陽性表達是淋巴結轉移（P=0.038）的獨立危險因素（表 3）。Cox風險回歸多因素生存分析顯示，淋巴結轉移（P=0.006）及CD44和CD133雙陽性表達（P=0.003）為影響患者術后生存的獨立預后因素（表 4）。
表3
胃癌組織中CD44及CD133蛋白雙陽性表達與胃癌患者臨床病理特征關系的logistic回歸分析結果
Table3.
Results of logistic regression analysis for relationship between co-expression of CD44 and CD133 and clinicopathologic features of patients with gastric cancer
表4
Cox回歸模型多因素生存分析結果
Table4.
Results of Cox proportional hazards model for survival analysis
3 討論
腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織中的極少部分具有干細胞性質的細胞群體，具有自我更新能力和多向分化潛能。腫瘤干細胞學說認為，腫瘤干細胞是腫瘤形成及其不斷生長的根源[9]。腫瘤干細胞最先發現在急性粒細胞白血病中。Bonnet等[10]成功分離出CD34+CD38-表型的急性髓細胞白血病（AML）細胞，并驗證了極少量腫瘤干細胞在NOD/SCID小鼠體內的致瘤過程。研究腫瘤干細胞特異性以及相關的細胞表面標志物已成為近年的研究熱點，而其中CD44與CD133是備受關注的腫瘤特異性標志物。CD133抗原是一個相對分子量為120×103的5次跨膜糖蛋白，包括細胞膜外的氨基末端、2個短的細胞內環和2個長的細胞外環以及細胞內的羧基末端，主要分布在細胞膜突部分。CD133在不同的腫瘤組織或胚胎組織中的表達情況不同，主要特異性表達于組織干細胞群或腫瘤干細胞亞群中[11]。CD44分子作為一種細胞黏附分子，其正常功能是介導淋巴細胞的歸巢、淋巴細胞向炎癥部位和黏膜相關淋巴組織歸位、黏附細胞外基質等[12]。研究[13]發現，兩者極可能在胃腸癌干細胞參與腫瘤侵襲以及轉移機理中起重要作用，并與腫瘤的發生、侵襲、轉移、耐藥以及復發有密切關系。因此，深入了解CD44與CD133的分子生物學特性，對尋求有效的抗癌治療尤其是對腫瘤干細胞的靶向治療具有深遠的意義。
對于這兩種腫瘤干細胞標志物，有文獻[14-15]報道稱CD44與CD133可作為結直腸癌腫瘤干細胞良好的標志物，并且聯合兩者能更好地分選和純化結直腸癌腫瘤干細胞。研究[16]發現，CD44與CD133在結直腸癌伴早期肝轉移的患者中的表達明顯高于不伴肝轉移組，且經單因素與多因素生存分析表明，CD133與CD44的共表達程度與患者預后情況呈負相關，通過對患者的年齡、Dukes分期及淋巴結轉移的多因素分析發現，CD133與CD44共表達是影響患者預后的獨立因素，提示CD133與CD44在結腸癌伴早期肝轉移的腫瘤細胞中的共表達可作為判斷結腸癌早期肝轉移的重要腫瘤標志物。研究[17-18]顯示，CD44可作為非典型WNT信號通路的靶向基因，密切聯系并參與腫瘤細胞生物學進程（如浸潤、轉移）及病理學過程。本課題組前期研究[19]發現，CXCR4能通過PI3K/Akt通路上調腫瘤起始細胞標志物CD133的表達；而CD133+細胞能促進胃癌增殖和侵襲能力的增強[20]。本實驗應用免疫組化方法檢測胃癌組織中CD44及CD133的表達，發現兩者表達陽性率在有淋巴結轉移組顯著高于無淋巴結轉移組，且兩者的陽性表達提示胃癌腫瘤分期較晚、患者預后差，是影響胃癌患者預后的獨立因素。有研究[21-22]發現，多種腫瘤干細胞標志物的組合可進一步識別腫瘤干細胞表型，并可分離一種甚至多種致瘤亞群。因此，對CD44及CD133兩種腫瘤干細胞標志物在胃癌腫瘤組織中的生物學功能、兩者間共表達可能存在的交互作用的機理及其與臨床病理特征的關系的研究備受矚目。
本實驗檢測了CD44及CD133這兩種腫瘤干細胞標志物在胃癌組織中的表達與分布情況。CD44陽性細胞細胞膜染色，CD133陽性細胞頂端膜染色，兩者細胞漿均不染色。本實驗檢測胃癌組織中有59.0%的CD44以及49.0%的CD133呈陽性表達，這兩種標志物主要高表達于癌巢區域，且其表達陽性率與腫瘤大小、組織學分級、血管浸潤、淋巴管浸潤、淋巴結轉移以及腫瘤TMN分期均有關（P＜0.05），即腫瘤直徑越大、組織學分級越高、有血管浸潤、有淋巴管浸潤、有淋巴結轉移以及腫瘤浸潤越深，其CD44和CD133表達陽性率越高。Cox回歸分析發現，有淋巴結轉移者以及CD44和CD133共表達提示患者的預后較差。該結果與國外相關文獻[23-25]報道結果相一致。同時經Spearman等級相關分析發現，CD44蛋白的表達與CD133蛋白的表達呈正相關關系（r=0.207，P=0.039），提示CD44與CD133的表達可能存在一定的協同作用，通過某種機理將兩者聯合起來，從而促使腫瘤細胞的黏附力降低，遷移率提高，從而提高了腫瘤的侵襲與轉移潛能。因此，兩者的聯合作用促進了腫瘤的浸潤與轉移。另外，與CD44或CD133單一預測因素相比，該兩種標志物的共表達或更可能是一獨立的預后判斷因素。
綜上所述，對CD44及CD133蛋白在癌組織中共表達的檢測可能是預判腫瘤復發和轉移的可行方法，并對胃癌轉移和復發的機理研究提供初步的臨床數據分析，進而為尋找新的靶向治療提供新的潛在靶點。
