本文簡要歸納總結了側流免疫層析技術在新型冠狀病毒抗原檢測中的應用研究。側流免疫層析技術因其快捷、低成本、操作便攜而廣泛應用于臨床和公共衛生領域。自新型冠狀病毒肺炎疫情暴發以來，該技術已被用于新型冠狀病毒抗原的快速檢測，其中包括普遍采用的膠體金免疫層析法以及基于熒光微球或其他復合納米材料的各類熒光免疫層析法。隨著新型標志物的開發，該技術平臺正由低靈敏度向高靈敏度、由定性檢測向定量檢測等方向發展。
引用本文： 程雨飛, 張龍浩. 側流免疫層析技術在新型冠狀病毒抗原檢測中應用的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2023, 30(5): 779-783. doi: 10.7507/1007-4848.202304002 復制
新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）是由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2，新冠病毒）感染引發的急性呼吸道傳染性疾病，過去3年在全球范圍導致了大規模持續流行。截至2023年3月10日，疫情已導致7.5億人感染、686萬人死亡，疫情防控工作任重道遠[1]。為此，全球已開發了各類診斷方法監測新冠病毒的流行。逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）因其極高的靈敏度，是當前診斷新冠病毒感染的金標準。但在實際實施中該方法需要定點排隊等候采樣，且從取樣至結果分析全流程須由專業醫療團隊借助貴重儀器來完成，耗時長、成本高。便攜式側流免疫層析法（lateral flow immunoassay，LFIA）兼具較高靈敏度、快速、簡便的特點，雖然不及RT-PCR敏感，但憑借特有的現場即時檢測（point-of-care testing，POCT）能力，具有較為突出的應用和研究價值，在疫情中得到廣泛運用。本文將對LFIA技術在新冠病毒抗原檢測中的應用研究進行綜述。
1 新型冠狀病毒抗原快速檢測
新冠病毒屬于RNA病毒，呈球形或橢球形，直徑100 nm左右。該病毒粒子包含1個約30 kb的單鏈核糖核酸（RNA）基因組，共編碼29種蛋白，包括9種附屬蛋白，16種非結構蛋白和4種結構蛋白。其中4種結構蛋白為包膜（membrane，M）蛋白、囊膜（envelope，E）蛋白、刺突（spike，S）蛋白，以及核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白。其中前三者均位于病毒蛋白外殼上，N蛋白則包裹RNA基因組形成核衣殼，并協助其在宿主細胞內轉錄和復制。值得注意的是N蛋白在不同新冠病毒株系中高度保守，更利于抗體結合避免脫靶，且在病毒感染細胞后表達量高，是較為理想的抗原檢測靶標[2-4]。大多數抗原檢測試劑盒是以檢測N蛋白來表征新冠病毒的存在，以保證較高的檢測敏感性、特異性和對病毒變異株較高的兼容性[5-6]。這些抗原檢測一般使用針對N蛋白的單克隆抗體[7]。相對于多克隆抗體，單克隆抗體雖然制備成本更高，但其在復雜混合物樣本中的高特異性優勢十分明顯，可有效減少新冠病毒抗原檢測中的假陽性和交叉反應等影響檢測質量的不確定性因素[7-8]。新冠病毒抗原檢測主要采用快速、低成本、操作便攜的LFIA技術[6]。非專業人士亦可自行操作，通過目視或借助少量便攜式設備即可判讀結果。
2 膠體金免疫層析技術
2.1 膠體金免疫層析技術原理
以膠體金納米顆粒（colloidal gold nanoparticles，AuNPs）為標記的LFIA技術是傳統經典方法，目前仍被普遍采用，該方法化學穩定性及抗光解離性強，且在自然光下辨識度高[8-9]，從采樣至可視化結果判讀可在30 min內完成[10]。LFIA試劑條是由樣品墊、結合墊、層析膜、吸收墊疊加于聚氯乙烯支撐底板上所組成的便攜式卡型裝置。樣品墊為經過處理的玻璃纖維膜，用于快速吸收提取液（待檢液）使其經由毛細管表面擴散作用流至結合墊。結合墊吸附了交聯了AuNPs的抗體（金標抗體），可特異性識別新冠病毒抗原。層析膜通常為硝酸纖維素膜，其上依次固定了一條有另一種特異性結合新冠病毒抗原的抗體位于檢測（test，T）線處，同時還有一種特異性結合金標抗體的抗體（質控抗體）位于更下游的質控（control，C）線處。吸收墊用于吸收剩余溶液以平衡層析膜兩邊壓差，促使提取液沿下游持續定向流動。一般情況下檢測人員使用尼絨拭子拭鼻腔（一般深入鼻道1～2 cm即可）獲取呼吸道樣品，將其溶于提取緩沖液中，并滴上數滴至樣品孔（樣品墊）上，并將試劑條靜置平放以待顯色。流過結合墊的提取液會帶動金標抗體沿下游移動。若樣品中含有新冠病毒，其抗原會同金標抗體特異性結合形成抗原-抗體免疫復合物，當到達T線區，此處固定的另一新冠特異性抗體通過不同表位與新冠抗原結合，形成抗體-抗原-抗體的夾心結構。隨著捕獲量增多，該處膠體金顆粒聚集并逐漸顯現出紅色。下游C線的質控抗體會識別過量的金標抗體進而顯色，該處顯色用于驗證檢測的有效性，不受樣品中是否含新冠病毒的影響。盡管檢測試劑的標記物及檢測設備在不斷更新，但新冠抗原LFIA一般都采用基于該“夾心法”的檢測框架及程序[11-12]。
2.2 膠體金免疫層析技術的應用研究
傳統膠體金LFIA的缺點是檢測靈敏度相對較低，主要推薦用于病毒載量較高的感染者，該領域的研究主要圍繞設計改進型的探針。膠體金納米顆粒的光學性質受其形態影響較大，在一定條件下擴大顆粒尺寸或使用特定形貌的非球狀顆粒均有助于增加其辨識性從而提高測試的敏感性[13-15]。金屬離子在還原劑存在的情況下容易以膠體金為核心，以納米殼層的形式層層生長進而不斷擴大整體尺寸，并隨之放大探針的比色信號。Panferov等[16] 比較了膠體金表面金原位沉積工藝、膠體金表面銀原位沉積工藝，以及新型電蝕輔助金原位沉積工藝對新冠S蛋白受體結合域的LFIA檢測性能的影響。三類工藝均有效提升了檢測靈敏度，并且尤以膠體金表面金原位沉積法最為突出，較相同條件下常規膠體金LFIA的檢測限（limit of detection，LoD）低出500倍左右。研究者基于該工藝開發了一種操作相對簡便的LFIA檢測方法，并采用了穩定性較高的試劑，可在8 min內完成檢測。此外，銅作為一種廉價金屬也受到了廣泛關注，一些研究[17-19]利用膠體金納米顆粒引導的探針表面銅積沉效應提升了部分LFIA方法的靈敏度。Peng等[20] 將此方案用于新冠病毒抗原的膠體金LFIA，在免疫反應后，檢測試劑條被浸泡于含有二價銅離子（Cu2+）及其還原劑抗壞血酸鈉（sodium ascorbate）的增強液中，銅離子以膠體金為核心聚集并還原成銅單質，進而以納米殼層的形式積沉于探針表面，使得探針信號顯著增強。實驗經優化后對新冠病毒抗原達到了0.01 μg/mL的檢測限，并可在20 min內完成檢測。但該信號增強方案在實踐中的推廣應用尚存局限。由于銅與金的晶格常數相差較大，銅納米殼層在探針表面的生長合成過程很容易因晶格失配而不可控。此外，試劑條的浸泡處理工藝易于使額外的銅離子吸附于硝酸纖維素膜上進而導致高背景或假陽性[21]。
在一定條件下，膠體金探針的吸光度會隨著顆粒團聚的增多而增強，但該過程對顆粒間距的控制要求很高，例如在顆粒間距小于10 nm時所引發的等離激元耦合會導致等離子共振光譜紅移繼而降低可見光范圍內的吸光度[22]。Oh等[22] 以一個吸附有鏈霉親和素（streptavidin）的金納米顆粒為核心交聯多個吸附有生物素化的抗體（biotinylated antibodies）的金納米顆粒，進而開發了一種具有約15 nm的恒定顆粒間距的膠體金探針，有效地在穩定顯色光譜的基礎上提升了整體比色信號。使用該探針構建的LFIA對新冠病毒抗原的檢測限達到了比使用同等粒徑大小的常規膠體金LFIA低出數倍的檢測限，在其他冠狀病毒抗原或流感病毒抗原的存在下亦顯示出較好的特異性。
新冠病毒可與其他流感等呼吸系統疾病病毒共同流行并共同感染患者，進而對準確診療產生影響。由于新冠病毒與SARS冠狀病毒（SARS-CoV-1）的N蛋白序列相似，現有新冠抗原檢測試劑較易于對冠狀病毒產生交叉反應[6]。由于目前并非冠狀病毒流行期，新冠抗原試劑整體而言仍具有較高的特異性。即便如此，將待測抗原與其他來源抗原進行有效區分仍然十分重要[23]。鑒于此，Hristov等[24]以新冠病毒、SARS冠狀病毒，以及能引發細支氣管炎的人類冠狀病毒HKU1的S蛋白為抗原檢測靶標，結合相應抗體進行優化并基于在層析膜上設計多條相應檢測線的LFIA試劑條，首次開發了一種能在30 min內在多組分抗原中同時測定新冠病毒、SARS冠狀病毒和人類冠狀病毒HKU1的LFIA。這類基于低成本即時檢測平臺的抗原鑒別技術的進展有助于對具備相似臨床癥狀的呼吸道疾病進行加速診斷并且更好地評估患者風險。
3 基于其他標記物的側流免疫層析技術
3.1 熒光微球標記免疫層析
熒光乳膠粒子受激發光源激發而發出熒光，粒度均一且穩定性高[25]。相較于膠體金免疫層析法，熒光免疫層析法靈敏度高，探針穩定性好，且不易受自然光的干擾，但需要借助熒光免疫分析儀判讀結果。熒光免疫層析已發展成常用的新冠病毒抗原快速檢測手段之一[6]。在疫情暴發初期，Diao等[26]基于羧基化聚苯乙烯熒光探針構建了檢測新冠病毒N蛋白的LFIA試劑條，使用熒光免疫分析儀讀取結果，并通過檢測100份健康鼻拭樣本所獲得的平均熒光信號強度（正負5個標準方差）來確立其陰性閾值（cut-off value）。研究者將其用于一批各醫療中心的239份疑似新冠感染樣本并通過RT-PCR驗證以評估性能。檢測流程亦基于常規LFIA，通過鼻咽拭獲得的樣品經由緩沖液稀釋后滴加100 μL于樣品墊上，然后將試劑條靜置平放，待10 min免疫反應后，將試劑條插入相應的熒光免疫分析儀的讀取接口，分析儀即會自動檢測信號強度并通過對比其芯片內置的截斷值判讀出陽性或陰性。該方法展示出較高的精確性并能較早地篩選出陽性，可用于更大范圍的新冠抗原篩查。在另一項研究中，Zhang等[27] 基于熒光微球標記技術研制了一種抗原快速檢測試劑條，對活化的新冠病毒滴度達到1 000 TCID50/mL，在健康對照和其他呼吸系統疾病患者中的特異性分別為100%和97%。此外，張賽等[28] 基于羧基熒光納米粒子研制了一種LFIA，對熱滅活新冠培養物的檢測達1 600 TCID50/mL，對16類常見呼吸道病原體高濃度樣本均無交叉反應，并且與臨床診斷符合率較高。Mao等[29] 基于LFIA開發了一種通過p-甲苯磺酰（p-toluenesulfonyl）活化稀土熒光微球蛋白的方法，對抗體與熒光探針的交聯效率進行了優化從而提升了對抗原的識別效率。免疫熒光層析試劑卡經優化后對新冠病毒抗原能達到0.01 ng/mL的檢測限，具備高靈敏度、較好的便攜性及相對快的反應速度。
3.2 量子點標記免疫層析
量子點作為一種新型熒光納米材料已被用于LFIA系統中，其具有光穩定性好、激發光譜寬且分布連續、發射光譜窄以及可對信號強度進行量化等優勢。但另一方面，其較小的顆粒直徑尺寸（5～20 nm）及較差的生物相容性相當程度限制了大規模LFIA應用[30-31]。Han等[30] 通過將膠體金與量子點顆粒同時以單層納米殼層的形式吸附于200 nm二氧化硅微球表面組裝了一種既能進行常規可視化膠體金比色檢測又可實施量子點熒光檢測的雙功能探針。單分散二氧化硅微球作為中心載體能有效維持探針在復合溶液中的穩定性，使樣品無需前期處理即可被用于LFIA檢測。使用者依據自身所處條件選擇檢測模式。吸附于二氧化硅表面的20 nm膠體金探針負責發出比色信號，適用于在資源匱乏的情形下對可疑樣本進行快速可視化檢測，而在有外接熒光分析儀等輔助設備的條件下，密集分布于膠體金顆粒間隙中的量子點被激發光源激發后發出熒光發射信號，從而可以實施更精確、靈敏度更高的抗原定量測定。該方法經優化后對新冠抗原比色檢測的檢測限達到了低于同時期常用的膠體金LFIA的10倍左右（量子點熒光檢測為300倍左右）。隨后的大規模臨床測試進一步驗證了其優異的特異性、精確性以及重復性。
3.3 有機分子標記免疫層析
基于熒光乳膠粒子、量子點熒光微球以及銪螯合物等無機顆粒的LFIA熒光探針雖然有其特定優勢，但合成難度大、溶膠穩定性差且毒性強。相較而言，有機小分子熒光探針結構簡單、易于合成且熒光發射信號強、動態范圍寬，但普遍存在斯托克斯位移小、耐光漂白性差以及標記效率較低的劣勢[32]。鑒于此，Seo等[32] 制備了一種具備大斯托克斯位移的單苯熒光分子，經由特制的流程將其以高度濃縮的狀態包覆于聚苯乙烯微珠中，由此開發的LFIA同時彌補了上述兩類探針的劣勢。相較于普通熒光LFIA，采用該探針的LFIA平臺可更有效地屏蔽臨床樣品中生物分子的非特異性雜光，同時其對新冠病毒S蛋白的檢測也展現出了優良的性能，獲得的檢測限趨近于同時期性能相對最優的膠體金LFIA法[24,33-34]。
3.4 基于表面增強拉曼散射的側流免疫層析
基于表面增強拉曼散射（SERS）的LFIA（SERS-LFIA）結合了SERS檢測靈敏度高、特異性強和LFIA便攜、快速、易操作的優勢，已得到越來越廣泛的應用，具有很大的發展前景[35]。Liu等[36] 將約3 nm的金納米顆粒通過種子生長法包覆在四氧化三鐵（Fe3O4）微球表面合成單分散的Fe3O4核-金殼磁性納米顆粒（Fe3O4@Au MNPs）并使用拉曼報告分子二硝基苯甲酸［5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB］進行二次修飾以制備SERS探針，基于此開發了一種能在30 min內同時測定甲型H1N1流感病毒、新冠病毒，以及呼吸道合胞病毒的LFIA。該磁性SERS探針具備無需樣品前處理即可直接捕獲目標病毒的特質，可有效規避樣品中雜質的干擾并提升敏感性。經過優化后，該SERS-LFIA對甲型H1N1流感病毒、新冠病毒以及呼吸道合胞病毒的檢測限分別為85份/mL、8 pg/mL以及8 pg/mL，具有比常規膠體金LFIA高出約100倍的靈敏度。臨床檢驗亦展現出良好的特異性、重復性。
4 總結與展望
基于LFIA的新冠病毒抗原快速檢測技術具有較為突出的應用和研究價值，其中以傳統經典的膠體金LFIA的使用最為廣泛并且發展最為成熟。熒光免疫層析等基于其他標記物的LFIA也具備了一定程度的應用和研究進展并且有其性能方面的優勢，但相關標記物的生產成本及難度普遍偏高，并且需要操作者通過一定的外接設備輔助判讀結果，對于受限于供電或檢測技能等資源匱乏區域的推廣尤其尚存局限。值得注意的是基于量子點及SERS等新興材料的LFIA展現了突出的性能并可能具備相當大的發展潛力。
利益沖突：無。
作者貢獻：程雨飛提出研究設計，收集資料、撰寫初稿、修改文章；張龍浩修改文章。
新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）是由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2，新冠病毒）感染引發的急性呼吸道傳染性疾病，過去3年在全球范圍導致了大規模持續流行。截至2023年3月10日，疫情已導致7.5億人感染、686萬人死亡，疫情防控工作任重道遠[1]。為此，全球已開發了各類診斷方法監測新冠病毒的流行。逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）因其極高的靈敏度，是當前診斷新冠病毒感染的金標準。但在實際實施中該方法需要定點排隊等候采樣，且從取樣至結果分析全流程須由專業醫療團隊借助貴重儀器來完成，耗時長、成本高。便攜式側流免疫層析法（lateral flow immunoassay，LFIA）兼具較高靈敏度、快速、簡便的特點，雖然不及RT-PCR敏感，但憑借特有的現場即時檢測（point-of-care testing，POCT）能力，具有較為突出的應用和研究價值，在疫情中得到廣泛運用。本文將對LFIA技術在新冠病毒抗原檢測中的應用研究進行綜述。
1 新型冠狀病毒抗原快速檢測
新冠病毒屬于RNA病毒，呈球形或橢球形，直徑100 nm左右。該病毒粒子包含1個約30 kb的單鏈核糖核酸（RNA）基因組，共編碼29種蛋白，包括9種附屬蛋白，16種非結構蛋白和4種結構蛋白。其中4種結構蛋白為包膜（membrane，M）蛋白、囊膜（envelope，E）蛋白、刺突（spike，S）蛋白，以及核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白。其中前三者均位于病毒蛋白外殼上，N蛋白則包裹RNA基因組形成核衣殼，并協助其在宿主細胞內轉錄和復制。值得注意的是N蛋白在不同新冠病毒株系中高度保守，更利于抗體結合避免脫靶，且在病毒感染細胞后表達量高，是較為理想的抗原檢測靶標[2-4]。大多數抗原檢測試劑盒是以檢測N蛋白來表征新冠病毒的存在，以保證較高的檢測敏感性、特異性和對病毒變異株較高的兼容性[5-6]。這些抗原檢測一般使用針對N蛋白的單克隆抗體[7]。相對于多克隆抗體，單克隆抗體雖然制備成本更高，但其在復雜混合物樣本中的高特異性優勢十分明顯，可有效減少新冠病毒抗原檢測中的假陽性和交叉反應等影響檢測質量的不確定性因素[7-8]。新冠病毒抗原檢測主要采用快速、低成本、操作便攜的LFIA技術[6]。非專業人士亦可自行操作，通過目視或借助少量便攜式設備即可判讀結果。
2 膠體金免疫層析技術
2.1 膠體金免疫層析技術原理
以膠體金納米顆粒（colloidal gold nanoparticles，AuNPs）為標記的LFIA技術是傳統經典方法，目前仍被普遍采用，該方法化學穩定性及抗光解離性強，且在自然光下辨識度高[8-9]，從采樣至可視化結果判讀可在30 min內完成[10]。LFIA試劑條是由樣品墊、結合墊、層析膜、吸收墊疊加于聚氯乙烯支撐底板上所組成的便攜式卡型裝置。樣品墊為經過處理的玻璃纖維膜，用于快速吸收提取液（待檢液）使其經由毛細管表面擴散作用流至結合墊。結合墊吸附了交聯了AuNPs的抗體（金標抗體），可特異性識別新冠病毒抗原。層析膜通常為硝酸纖維素膜，其上依次固定了一條有另一種特異性結合新冠病毒抗原的抗體位于檢測（test，T）線處，同時還有一種特異性結合金標抗體的抗體（質控抗體）位于更下游的質控（control，C）線處。吸收墊用于吸收剩余溶液以平衡層析膜兩邊壓差，促使提取液沿下游持續定向流動。一般情況下檢測人員使用尼絨拭子拭鼻腔（一般深入鼻道1～2 cm即可）獲取呼吸道樣品，將其溶于提取緩沖液中，并滴上數滴至樣品孔（樣品墊）上，并將試劑條靜置平放以待顯色。流過結合墊的提取液會帶動金標抗體沿下游移動。若樣品中含有新冠病毒，其抗原會同金標抗體特異性結合形成抗原-抗體免疫復合物，當到達T線區，此處固定的另一新冠特異性抗體通過不同表位與新冠抗原結合，形成抗體-抗原-抗體的夾心結構。隨著捕獲量增多，該處膠體金顆粒聚集并逐漸顯現出紅色。下游C線的質控抗體會識別過量的金標抗體進而顯色，該處顯色用于驗證檢測的有效性，不受樣品中是否含新冠病毒的影響。盡管檢測試劑的標記物及檢測設備在不斷更新，但新冠抗原LFIA一般都采用基于該“夾心法”的檢測框架及程序[11-12]。
2.2 膠體金免疫層析技術的應用研究
傳統膠體金LFIA的缺點是檢測靈敏度相對較低，主要推薦用于病毒載量較高的感染者，該領域的研究主要圍繞設計改進型的探針。膠體金納米顆粒的光學性質受其形態影響較大，在一定條件下擴大顆粒尺寸或使用特定形貌的非球狀顆粒均有助于增加其辨識性從而提高測試的敏感性[13-15]。金屬離子在還原劑存在的情況下容易以膠體金為核心，以納米殼層的形式層層生長進而不斷擴大整體尺寸，并隨之放大探針的比色信號。Panferov等[16] 比較了膠體金表面金原位沉積工藝、膠體金表面銀原位沉積工藝，以及新型電蝕輔助金原位沉積工藝對新冠S蛋白受體結合域的LFIA檢測性能的影響。三類工藝均有效提升了檢測靈敏度，并且尤以膠體金表面金原位沉積法最為突出，較相同條件下常規膠體金LFIA的檢測限（limit of detection，LoD）低出500倍左右。研究者基于該工藝開發了一種操作相對簡便的LFIA檢測方法，并采用了穩定性較高的試劑，可在8 min內完成檢測。此外，銅作為一種廉價金屬也受到了廣泛關注，一些研究[17-19]利用膠體金納米顆粒引導的探針表面銅積沉效應提升了部分LFIA方法的靈敏度。Peng等[20] 將此方案用于新冠病毒抗原的膠體金LFIA，在免疫反應后，檢測試劑條被浸泡于含有二價銅離子（Cu2+）及其還原劑抗壞血酸鈉（sodium ascorbate）的增強液中，銅離子以膠體金為核心聚集并還原成銅單質，進而以納米殼層的形式積沉于探針表面，使得探針信號顯著增強。實驗經優化后對新冠病毒抗原達到了0.01 μg/mL的檢測限，并可在20 min內完成檢測。但該信號增強方案在實踐中的推廣應用尚存局限。由于銅與金的晶格常數相差較大，銅納米殼層在探針表面的生長合成過程很容易因晶格失配而不可控。此外，試劑條的浸泡處理工藝易于使額外的銅離子吸附于硝酸纖維素膜上進而導致高背景或假陽性[21]。
在一定條件下，膠體金探針的吸光度會隨著顆粒團聚的增多而增強，但該過程對顆粒間距的控制要求很高，例如在顆粒間距小于10 nm時所引發的等離激元耦合會導致等離子共振光譜紅移繼而降低可見光范圍內的吸光度[22]。Oh等[22] 以一個吸附有鏈霉親和素（streptavidin）的金納米顆粒為核心交聯多個吸附有生物素化的抗體（biotinylated antibodies）的金納米顆粒，進而開發了一種具有約15 nm的恒定顆粒間距的膠體金探針，有效地在穩定顯色光譜的基礎上提升了整體比色信號。使用該探針構建的LFIA對新冠病毒抗原的檢測限達到了比使用同等粒徑大小的常規膠體金LFIA低出數倍的檢測限，在其他冠狀病毒抗原或流感病毒抗原的存在下亦顯示出較好的特異性。
新冠病毒可與其他流感等呼吸系統疾病病毒共同流行并共同感染患者，進而對準確診療產生影響。由于新冠病毒與SARS冠狀病毒（SARS-CoV-1）的N蛋白序列相似，現有新冠抗原檢測試劑較易于對冠狀病毒產生交叉反應[6]。由于目前并非冠狀病毒流行期，新冠抗原試劑整體而言仍具有較高的特異性。即便如此，將待測抗原與其他來源抗原進行有效區分仍然十分重要[23]。鑒于此，Hristov等[24]以新冠病毒、SARS冠狀病毒，以及能引發細支氣管炎的人類冠狀病毒HKU1的S蛋白為抗原檢測靶標，結合相應抗體進行優化并基于在層析膜上設計多條相應檢測線的LFIA試劑條，首次開發了一種能在30 min內在多組分抗原中同時測定新冠病毒、SARS冠狀病毒和人類冠狀病毒HKU1的LFIA。這類基于低成本即時檢測平臺的抗原鑒別技術的進展有助于對具備相似臨床癥狀的呼吸道疾病進行加速診斷并且更好地評估患者風險。
3 基于其他標記物的側流免疫層析技術
3.1 熒光微球標記免疫層析
熒光乳膠粒子受激發光源激發而發出熒光，粒度均一且穩定性高[25]。相較于膠體金免疫層析法，熒光免疫層析法靈敏度高，探針穩定性好，且不易受自然光的干擾，但需要借助熒光免疫分析儀判讀結果。熒光免疫層析已發展成常用的新冠病毒抗原快速檢測手段之一[6]。在疫情暴發初期，Diao等[26]基于羧基化聚苯乙烯熒光探針構建了檢測新冠病毒N蛋白的LFIA試劑條，使用熒光免疫分析儀讀取結果，并通過檢測100份健康鼻拭樣本所獲得的平均熒光信號強度（正負5個標準方差）來確立其陰性閾值（cut-off value）。研究者將其用于一批各醫療中心的239份疑似新冠感染樣本并通過RT-PCR驗證以評估性能。檢測流程亦基于常規LFIA，通過鼻咽拭獲得的樣品經由緩沖液稀釋后滴加100 μL于樣品墊上，然后將試劑條靜置平放，待10 min免疫反應后，將試劑條插入相應的熒光免疫分析儀的讀取接口，分析儀即會自動檢測信號強度并通過對比其芯片內置的截斷值判讀出陽性或陰性。該方法展示出較高的精確性并能較早地篩選出陽性，可用于更大范圍的新冠抗原篩查。在另一項研究中，Zhang等[27] 基于熒光微球標記技術研制了一種抗原快速檢測試劑條，對活化的新冠病毒滴度達到1 000 TCID50/mL，在健康對照和其他呼吸系統疾病患者中的特異性分別為100%和97%。此外，張賽等[28] 基于羧基熒光納米粒子研制了一種LFIA，對熱滅活新冠培養物的檢測達1 600 TCID50/mL，對16類常見呼吸道病原體高濃度樣本均無交叉反應，并且與臨床診斷符合率較高。Mao等[29] 基于LFIA開發了一種通過p-甲苯磺酰（p-toluenesulfonyl）活化稀土熒光微球蛋白的方法，對抗體與熒光探針的交聯效率進行了優化從而提升了對抗原的識別效率。免疫熒光層析試劑卡經優化后對新冠病毒抗原能達到0.01 ng/mL的檢測限，具備高靈敏度、較好的便攜性及相對快的反應速度。
3.2 量子點標記免疫層析
量子點作為一種新型熒光納米材料已被用于LFIA系統中，其具有光穩定性好、激發光譜寬且分布連續、發射光譜窄以及可對信號強度進行量化等優勢。但另一方面，其較小的顆粒直徑尺寸（5～20 nm）及較差的生物相容性相當程度限制了大規模LFIA應用[30-31]。Han等[30] 通過將膠體金與量子點顆粒同時以單層納米殼層的形式吸附于200 nm二氧化硅微球表面組裝了一種既能進行常規可視化膠體金比色檢測又可實施量子點熒光檢測的雙功能探針。單分散二氧化硅微球作為中心載體能有效維持探針在復合溶液中的穩定性，使樣品無需前期處理即可被用于LFIA檢測。使用者依據自身所處條件選擇檢測模式。吸附于二氧化硅表面的20 nm膠體金探針負責發出比色信號，適用于在資源匱乏的情形下對可疑樣本進行快速可視化檢測，而在有外接熒光分析儀等輔助設備的條件下，密集分布于膠體金顆粒間隙中的量子點被激發光源激發后發出熒光發射信號，從而可以實施更精確、靈敏度更高的抗原定量測定。該方法經優化后對新冠抗原比色檢測的檢測限達到了低于同時期常用的膠體金LFIA的10倍左右（量子點熒光檢測為300倍左右）。隨后的大規模臨床測試進一步驗證了其優異的特異性、精確性以及重復性。
3.3 有機分子標記免疫層析
基于熒光乳膠粒子、量子點熒光微球以及銪螯合物等無機顆粒的LFIA熒光探針雖然有其特定優勢，但合成難度大、溶膠穩定性差且毒性強。相較而言，有機小分子熒光探針結構簡單、易于合成且熒光發射信號強、動態范圍寬，但普遍存在斯托克斯位移小、耐光漂白性差以及標記效率較低的劣勢[32]。鑒于此，Seo等[32] 制備了一種具備大斯托克斯位移的單苯熒光分子，經由特制的流程將其以高度濃縮的狀態包覆于聚苯乙烯微珠中，由此開發的LFIA同時彌補了上述兩類探針的劣勢。相較于普通熒光LFIA，采用該探針的LFIA平臺可更有效地屏蔽臨床樣品中生物分子的非特異性雜光，同時其對新冠病毒S蛋白的檢測也展現出了優良的性能，獲得的檢測限趨近于同時期性能相對最優的膠體金LFIA法[24,33-34]。
3.4 基于表面增強拉曼散射的側流免疫層析
基于表面增強拉曼散射（SERS）的LFIA（SERS-LFIA）結合了SERS檢測靈敏度高、特異性強和LFIA便攜、快速、易操作的優勢，已得到越來越廣泛的應用，具有很大的發展前景[35]。Liu等[36] 將約3 nm的金納米顆粒通過種子生長法包覆在四氧化三鐵（Fe3O4）微球表面合成單分散的Fe3O4核-金殼磁性納米顆粒（Fe3O4@Au MNPs）并使用拉曼報告分子二硝基苯甲酸［5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB］進行二次修飾以制備SERS探針，基于此開發了一種能在30 min內同時測定甲型H1N1流感病毒、新冠病毒，以及呼吸道合胞病毒的LFIA。該磁性SERS探針具備無需樣品前處理即可直接捕獲目標病毒的特質，可有效規避樣品中雜質的干擾并提升敏感性。經過優化后，該SERS-LFIA對甲型H1N1流感病毒、新冠病毒以及呼吸道合胞病毒的檢測限分別為85份/mL、8 pg/mL以及8 pg/mL，具有比常規膠體金LFIA高出約100倍的靈敏度。臨床檢驗亦展現出良好的特異性、重復性。
4 總結與展望
基于LFIA的新冠病毒抗原快速檢測技術具有較為突出的應用和研究價值，其中以傳統經典的膠體金LFIA的使用最為廣泛并且發展最為成熟。熒光免疫層析等基于其他標記物的LFIA也具備了一定程度的應用和研究進展并且有其性能方面的優勢，但相關標記物的生產成本及難度普遍偏高，并且需要操作者通過一定的外接設備輔助判讀結果，對于受限于供電或檢測技能等資源匱乏區域的推廣尤其尚存局限。值得注意的是基于量子點及SERS等新興材料的LFIA展現了突出的性能并可能具備相當大的發展潛力。
利益沖突：無。
作者貢獻：程雨飛提出研究設計，收集資料、撰寫初稿、修改文章；張龍浩修改文章。