心肌梗死 （myocardial infarction，MI） 是指由于冠狀動脈血流不足和隨后的氧供應減少導致心肌細胞減少[1-2]。MI是全球心血管疾病致殘和死亡的主要原因之一，因此對人類健康構成嚴重威脅，并將在未來成為世界性的嚴重公共衛生問題[3-4]。此外，其經濟負擔巨大，2010年該疾病給全球經濟造成的損失估計為8 630億美元[5]。在過去的幾十年里，隨著包含纖維蛋白溶解、經皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路移植術在內的再灌注策略，包含抗心力衰竭（心衰）、降脂、抗血栓及抗炎在內的藥物治療和標準化護理等方面的進展，MI的預后顯著改善[6-7]。例如，經皮冠狀動脈介入治療能夠顯著改善左室功能，減少心源性死亡、MI復發以及非計劃性血管重建的發生，有效的抗血栓治療也與缺血事件的大幅減少有關，提高了MI患者存活率[6, 8] 。
然而，大面積梗死患者或未及時接受血運重建的患者發生包括急性二尖瓣反流、室間隔缺損、假性動脈瘤和游離壁破裂在內的機械并發癥的風險增加，并導致患者死亡[9]。由此可見，識別有效的代謝標志物和MI治療靶點能在改善預后中發揮關鍵性作用[10] 。因此，充分了解 MI 的代謝特征顯得尤為迫切。
最近幾年中，更具選擇性和靈敏度的質譜儀推動了代謝組學研究的快速擴展，與蛋白質組學和基因組學相比，代謝組學可以研究基因型的最終表達，因此是最接近最終表型的分析技術[11] 。其可用于分析代謝表型和探索代謝重編程，從而能夠鑒定生物標志物并提供對生理和病理機制進行分析研究[12] 。
本研究通過結扎冠狀動脈左前降支建立小鼠急性心肌梗死（acute MI，AMI）模型，對血清進行靶向代謝組學分析，從代謝組學角度探討心肌細胞缺血狀態后的代謝變化，并進一步分析其相關代謝路徑并構建網絡。這些結果進一步闡明了疾病所涉及的生化機制。
1 材料與方法
1.1 小鼠急性心肌梗死模型的建立
取同批次10周齡雄性C57BL/6小鼠15只［體重15～20 g，實驗動物生產許可證號SCXK（川）2020-0030 ］，隨機分為兩組：假手術對照組（n=5）和AMI模型組（n=10）。在沒有通氣的情況下用戊巴比妥鈉（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠。在胸骨左側做一小皮膚切口，并準備了荷包縫合。在第4肋間開一個小孔，用蚊鉗擴張。手法擠壓外側胸腔使跳動的心臟輕輕彈出，在冠狀動脈左前降支心房下方約3 mm處用7-0絲線快速縫合。當左心室前壁變白時，即可確認結扎成功。結扎后，將心臟放回胸腔內，手動排出胸腔內空氣。扎緊之前荷包縫合，在恢復期對小鼠進行監測。假手術對照組小鼠接受相同的手術操作，但未阻斷其冠狀動脈左前降支。
1.2 UHPLC-QqQ/MS的靶向代謝組學分析
所有小鼠于術后24 h采集血清標本。血清樣本添加了兩個內標的甲醇沉淀。然后收集上清液，干燥后用10 mM醋酸銨在30%水/70%乙酸乙酯+0.2%冰醋酸中重組，其中含有12.6 μM 3C5-15N-L-酪氨酸和34.68 μM 13C1-L-乳酸。將重組樣品分別以正離子和負離子模式加入到UHPLC? MS/MS中，質控樣品采用混合所有血清的混合樣品。
靶向代謝組學分析在Nexera LC-40A UHPLC系統上進行，該系統與AB Sciex三重四極桿（QQQ）5500質譜儀（美國，馬薩諸塞州弗雷明翰）相結合。然后在Waters BEH酰胺柱（2.1×100，1.7 μm，Waters，Milford，MA，USA）上在35℃的溫度下進行色層分離。多反應監測模式用于檢測感興趣的代謝物。本研究從40多條代謝途徑中選擇了238種代謝物進行靶向分析。用Analyst 1.6.3軟件采集數據，用Multiquant 3.0.2軟件（AB Sciex，Framingham，MA）進行分析。
1.3 統計學分析
所有數據已在SPSS驗證正態性分布。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示，組間比較使用SPSSV21軟件 （Chicago，IL，USA）進行非配對t檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。用代謝組學途徑分析（MetaboAnalyst 5.0， http://www.metaboanalyst.ca/）對數據進行自動篩選，并對改變的代謝物進行分析，并與潛在的代謝途徑相關。KEGG數據庫（http://www.kegg.jp/）用于進一步確定這些改變的代謝物在各種代謝途徑中的位置和功能。
1.4 倫理審查
此研究經四川大學華西醫院動物倫理委員會批準，批準號為20220221020。
2 結果
2.1 兩組代謝譜分析
2.1.1 與心肌缺血相關的代謝物
129種代謝物中的50種與心肌缺血相關［fold change（FC）<0.5或>2，P的閾值被設定為0.05，且經偽發現率（FDR）矯正］；見圖1。其包括11種氨基酸（絲氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、D-亮氨酸、胱氨酸、肌氨酸、鳥氨酸、高絲氨酸）、2種甲基化氨基酸（二甲基甘氨酸、1/3-甲基組氨酸）、1種乙酰化氨基酸（N-乙酰甘氨酸）、2種堿基（胞嘧啶、腺嘌呤）、6種核苷（2'-脫氧尿苷、胞苷、腺苷、肌苷、1-甲基鳥苷、黃嘌呤核苷）、9種其他有機酸（杏仁酸、甘油酸、草乙酸、檸康酸、牛磺酸、壬二酸、2-氨基己二酸、2-羥基異戊酸、OH-苯基丙酮酸）、4種有機酸酯（胍基乙酸酯、腺苷酸琥珀酸酯、琥珀酸甲酯、丙二酸甲酯）、2種膽堿類及其相關產物（乙酰膽堿、三甲胺-N-氧化物），1種維生素（煙酸）、3種生物堿（色胺、脫氧肉堿、甜菜堿）及其他9種有機化合物；見表1。
圖1
血清代謝物的總體趨勢火山圖
每個點代表一個血清代謝物，模型組中明顯較高（FC>2）為紅色，較低（FC＜0.5）為藍色；不變的代謝物為灰色
表1
血清中的主要差異代謝物數據分析結果
在129種代謝的火山圖中，位于中央的代謝物代表模型組和對照組的樣本之間豐度相比只有較小的變化，紅點顯著表達上調的代謝物（共14種）。藍點是顯著表達下調的代謝物（共36種），灰點是無顯著差異的代謝物。腺苷在MI模型組的血清樣本中高出202.91倍，而2'-脫氧尿苷（FC=0.046051）、腺苷琥珀酸酯（FC=0.047406）、胞嘧啶（FC=0.047183）在MI模型組的血清樣本的含量最低。
2.1.2 129種代謝物在樣本中的變異系數
變異系數（CV）表示代謝物濃度的個體變異性的度量，從LC-MS數據中獲得每種血清代謝物的濃度，隨后計算CVs。根據其CV的大小分為7個亞組。在50種與心肌缺血相關的血清代謝物中，只有2種—色胺和2-氨基己二酸酯，屬于可變性較小的組（共17種，CV 0.3～0.4）。14種化合物在下一個變異最小的組中（共22 種，CV 0.4～0.5）。27種代謝物的變異性相對較大，CV的范圍為0.5～1.0。7種代謝物—1/3-甲基組氨酸、腺苷琥珀酸酯、甲基丙二酸、2'-脫氧尿苷、胞嘧啶、肌氨酸、黃嘌呤核苷，屬于最不穩定的亞組（共12種，CV>1.0）（圖2）。因此，超過一半的與心肌缺血相關的代謝物（27/50）的CV相對可變（CV 0.5～1.0）。
圖2
129種代謝物根據CV大小可分為7個亞組
紅色代表MI模型組相比對照組顯著上調（FC＞2）的代謝物；藍色代表MI模型組相比對照組顯著下調（FC＜0.5）的代謝物；MI：心肌梗死
2.1.3 主成分分析及建立PLS-DA和OPLS模型
采用主成分分析來降低血清代謝物豐度數據的維數。主成分分析結果顯示，兩組的血清代謝物圖標可以分開，提示在心肌缺血時代謝產物與正常狀態明顯不同（圖3a）。由于樣本量遠遠小于變量，故又建立了PLS-DA模型及OPLS-DA模型并進行了驗證。 圖3b 和圖3c分別清晰展示了PLS-DA評分圖及OPLS-DA評分圖，可以清晰地分離MI模型組和假手術對照組血清樣本的不同。圖3d及圖3e顯示了兩個模型的驗證參數及用CV-ANOVA檢驗的P值，OPLS-DA模型的Q2和R2都>0.5，所有模型的P值均≤0.05，表明模型有效。
圖3
兩組血清代謝物的主成分分析
a：PCA評分圖；b：PLS-DA評分圖；c：OPLS-DA評分圖；a～c評分圖揭示了兩組樣本的聚類性強，組內差異不大；d：PLS-DA模型；e：OPLS-DA模型；d和e的
2.2 與心肌缺血相關的代謝物改變
以驗證的OPLS-DA模型中的vip≥1、FDR≤0.05、組內CV＜0.2差異代謝物的篩選條件。假手術對照組、MI模型組血清中代謝產物變化的統計分析結果見表1。血清中共發現27種代謝物變化，包含氨基酸及其衍生物、有機酸、酯類。這些代謝產物在MI模型組和假手術對照組之間有較大差異。
2.3 心肌缺血相關代謝通路的改變
探索生物途徑可能有助于闡明心肌缺血時的代謝變化。結果表明代謝產物和代謝生物網絡發生了顯著變化；見圖4和表2。基于京都基因和基因組百科全書（KEGG）基于代謝物（impact value>0.2，FDR<0.05）的信號通路分析，篩選出影響最顯著的代謝途徑：（1）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；（2）甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；（3）乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝。為了探討心肌缺血時代謝變化，我們更多關注與特定代謝途徑相關的代謝物。參與氨基酸代謝途徑的代謝物在心肌缺血處理后顯著減低；見圖5。
圖4
心肌缺血時血清代謝物的通路分析概覽
每個圓圈的大小和顏色分別以Impact值和
表2
心肌缺血時涉及的代謝途徑總覽
圖5
在代謝途徑中定位相關代謝物
心肌梗死涉及3個代謝途徑：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝及乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝，檸檬酸循環可能溝通了這3個通路；紅色表示顯著增加，藍色表示減少，綠色表示不變，灰色表示非差異代謝物或未涉及
3 討論
本研究對急性MI小鼠血清進行了基于LC-MS/MS的代謝組學分析。提示在模型組的血清中存在明顯的代謝途徑紊亂和代謝產物改變。進一步分析發現絲氨酸相關代謝途徑參與了AMI的發病過程，并探討了其參與機制。
代謝組學作為一門新興的技術，多在AMI患者或AMI動物模型上開展[13-14]。當在動物模型中誘導MI時，不同方法誘導的MI之間的病理生理學差異有時會被忽視。在評估新的治療策略或評估實驗室之間的比較研究時，這種缺乏區分可能會導致混亂。并且因為代謝組學的高度敏感性，在人類研究中的組內一致性是困難的[4, 13]。而大型動物模型雖然可以更好地概括心臟重構和心律失常導致的缺血性損傷的臨床表現，但嚙齒動物模型，特別是小鼠，可以更深入地剖析MI的細胞和分子機制，尤其適用于高通量分析[15]。故而本研究選擇了C57BL/6小鼠品系，在基因組穩定的背景上，通過改良的快速冠狀動脈結扎手術，使用微創肋間（第4肋間）開胸，不涉及肋骨的切割。與最初的經胸骨切開，切開大約3根肋骨，進入心臟，然后結扎左冠狀動脈的手術入路相比，本研究采用的術式能夠防止因手術引起過度炎癥的發生，最大化避免了掩蓋早期MI引起的炎癥問題[15]。同時對照組小鼠也接受了相同的手術操作，以消除因手術導致的兩組血清代謝物變化不一致。采集血清標本的時間是術后24 h。此外，使用血清樣本而非心臟組織樣本，規避因難以識別的梗死區域導致的正常心臟組織混入樣本，從而影響代謝組學結果的問題。
本研究中，差異代謝物中大部分屬于氨基酸及其衍生物，這些血清代謝物可能是心肌細胞的特異性降解過程的指示物或者是與心肌缺血相關的系統性組織改變。與假手術對照組相比，2種代謝物（色氨、2-氨基己二酸酯）在MI模型組的血清中的含量顯著升高。色胺在MI模型組小鼠血清中的濃度升高了2.1816倍。色胺是一種微量胺類的神經遞質，在血清中的濃度與前體色氨酸的濃度相關，后者被芳香族L-胺基酸類脫羧基酶（aromatic L-amino acid decarboxylase，AADC）代謝成色胺。色胺能夠通過直接刺激α腎上腺素受體和5-羥色胺受體升高血壓[16]。2-氨基己二酸則是線粒體代謝產物，由必需氨基酸賴氨酸的分解代謝產生，具有能夠拮抗由谷氨酸的離子通道型受體，即N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）調節的神經興奮的特性[17-18]。在AMI期間，該受體經D絲氨酸內源性激活后，允許谷氨酸打開陽離子通道，增加交感神經的放電，從而進一步影響心臟功能[2, 19-20]。研究[1]表明，NMDAR受體阻劑美金剛（msemantine）能在MI模型中發揮心臟保護作用，這可能歸因于促炎和氧化應激因子的減少以及隨后心臟重塑的減少。此外，還有研究[21]表明，2-氨基己二酸血清水平的高低與線粒體功能障礙有關，并且與高密度脂蛋白負相關，而膽固醇的代謝在動脈粥樣硬化中起著至關重要的作用，個體中2-氨基己二酸的升高可能通過調節高密度脂蛋白和膽固醇水平而導致心臟代謝風險[17]。在心衰后的心室重構中，它與左室舒張期末內徑有關。
與之呈現相反趨勢的代謝物有13種，其中有3種氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸），這表明其利用增加或消耗增加。氨基酸影響細胞信號傳導、募集和增殖，并且在各種代謝物和相關途徑的生物合成中也具有重要作用[22]。例如，絲氨酸是一種非必需氨基酸，可以經甘氨酸轉化產生，并為單碳代謝提供碳單元，參與多種生理過程和生物途徑[23]。根據旋光度的不同，分為L-絲氨酸和D-絲氨酸，D-絲氨酸是由L-絲氨酸通過一種特定的消旋酶（serine racemase，SR）消旋產生的[20]。在神經系統中，它作為一種自分泌調節劑，由突觸后神經元釋放，可以與自己的NMDAR結合，從而“啟動”受體對突觸處的谷氨酸作出即時反應，促進神經元去極化和興奮[19-20]。蘇氨酸是必需氨基酸的一種，在調節營養代謝、大分子生物合成（參與形成腸黏膜蛋白和分泌的糖蛋白）和維持腸道穩態中起著至關重要的作用[24-26]。酪氨酸有β-腎上腺素受體（ESBAR）內源性敏化的作用，通過與β-腎上腺素受體位點結合，提高腎上腺素激活受體的效率，能對心衰患者心臟起正性肌力的作用[27]。
對生物途徑改變的研究可以進一步探討MI的發病機制。與假手術對照組相比，MI模型小鼠共有幾種常見的代謝紊亂途徑，如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝。而檸檬酸循環（citrate cycle）可能溝通了上述3個通路，而甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝是最受影響的通路。后者為前者提供了重要的能量代謝前體；見圖5[28]。前者不僅是3大營養素（碳水化合物、脂質、氨基酸）的最終代謝途徑，也是碳水化合物、脂質和氨基酸之間代謝聯系的重要樞紐[29]，其在心肌的氧化磷酸化中起核心作用。因此，缺血后的心臟循環活動下降，腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）產生減少，心臟收縮效率降低[30-31]。甘氨酸和絲氨酸可以通過激活心肌細胞中的甘氨酸受體來減少心中肌炎癥，間接抑制心臟成纖維細胞中膠原蛋白的產生，從而改善心肌纖維化，而蘇氨酸則與缺血-再灌注誘導的心肌損傷的改善有關[28-29]。另有研究[32]提到，穩定型心絞痛患者血漿甘氨酸水平與AMI風險呈負相關。
我們認為絲氨酸相關生物途徑可能成為改善AMI患者預后的一個治療靶點。絲氨酸的生物合成更是與線粒體功能和ATP的生產直接相關。有研究[33]表明，鈣調神經磷酸酶Aβ1（Calcineurin，CnAβ1）依賴于通過雷帕霉素靶蛋白途徑（mechanistic target of rapamycin pathway，mTOR）增強了絲氨酸和單碳代謝，從而促使了對包括谷胱甘肽在內的活性氧物質具有保護作用的抗氧化代謝產物的產生，減少了線粒體中的蛋白質氧化，并保持了ATP的產生，這反過來改善了收縮功能，并防止了心臟肥大背景下的心室重塑。而絲氨酸的生物合成有助于進入檸檬酸循環的葡萄糖通量的增加，促進NADPH的產生，以促進線粒體生成、修復及呼吸，并與衰竭心臟卸負后的心肌恢復有關[23]。來自體外吸收和體內糖酵解分支合成的絲氨酸可以轉化為甘氨酸，以供給單碳代謝一碳單位。 絲氨酸是單碳代謝的主要底物。甘氨酸和一碳單位必須在細胞質或線粒體中由絲氨酸經葉酸代謝產生，而一碳單位不僅是NADH和NADPH的主要來源，還參與動脈粥樣硬化和心血管疾病的發展[32, 34-35]。但在缺氧的條件下，細胞呼吸受到抑制，線粒體中的電子傳遞失敗，絲氨酸成為NADH的主要來源，而這種累積的NADH抑制檸檬酸循環，反而存在細胞毒性[35]。
絲氨酸及一碳代謝對心肌細胞的作用可能與能量途徑的改變有關。正常心臟主要消耗脂肪酸，而很少消耗葡萄糖[36]。而MI狀態下能量代謝異常，心臟主要消耗葡萄糖經糖酵解獲得能量[27, 31]。我們不妨提出猜想，由于電子傳遞鏈的阻斷或抑制，心肌細胞可能通過絲氨酸和單碳代謝途徑促進進入檸檬酸循環的葡萄糖通量，以期促進線粒體的恢復，并提供額外的ATP，幫助維持心臟的持續收縮。
這項研究也有一些局限性。首先，只對血清樣本進行了分析，未對心肌細胞進行研究，從而建立代謝物變化的聯系。其次，本研究所用的動物模型只采用了雄性小鼠，但在一些研究中，性別也作為能夠影響MI血清代謝物中變化的因素[13, 15]。因此在未來的研究中，動物模型將包含同等數量的雄性和雌性。前文已述內源性生成的絲氨酸可以經由單碳代謝改善線粒體功能，進而改善心臟收縮功能，但外源性給予絲氨酸對心臟細胞的作用尚不知曉。因此，細胞研究及相關動物研究將在未來進行。
綜上所述，本研究使用靶向的LC-MS/MS方法比較了MI小鼠和假手術對照組的血清代謝特征，反映了MI相關的能量缺乏、離子失衡、氧化應激、酸中毒和心臟損傷的病理生理過程。結果表明，存在由心肌缺血引起的代謝變化。在MI中發現絲氨酸相關代謝途徑中的代謝物在血清中含量降低。根據代謝組學研究，對MI時心肌保護提出新的治療方向。
利益沖突：無。
作者貢獻：尋斯琪主要負責代謝組學數據的采集分析和論文撰寫；干昌平和郭應強主要負責學術指導和論文審核；秦超毅主要負責實驗設計、動物實驗和論文最終審核定稿。
心肌梗死 （myocardial infarction，MI） 是指由于冠狀動脈血流不足和隨后的氧供應減少導致心肌細胞減少[1-2]。MI是全球心血管疾病致殘和死亡的主要原因之一，因此對人類健康構成嚴重威脅，并將在未來成為世界性的嚴重公共衛生問題[3-4]。此外，其經濟負擔巨大，2010年該疾病給全球經濟造成的損失估計為8 630億美元[5]。在過去的幾十年里，隨著包含纖維蛋白溶解、經皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路移植術在內的再灌注策略，包含抗心力衰竭（心衰）、降脂、抗血栓及抗炎在內的藥物治療和標準化護理等方面的進展，MI的預后顯著改善[6-7]。例如，經皮冠狀動脈介入治療能夠顯著改善左室功能，減少心源性死亡、MI復發以及非計劃性血管重建的發生，有效的抗血栓治療也與缺血事件的大幅減少有關，提高了MI患者存活率[6, 8] 。
然而，大面積梗死患者或未及時接受血運重建的患者發生包括急性二尖瓣反流、室間隔缺損、假性動脈瘤和游離壁破裂在內的機械并發癥的風險增加，并導致患者死亡[9]。由此可見，識別有效的代謝標志物和MI治療靶點能在改善預后中發揮關鍵性作用[10] 。因此，充分了解 MI 的代謝特征顯得尤為迫切。
最近幾年中，更具選擇性和靈敏度的質譜儀推動了代謝組學研究的快速擴展，與蛋白質組學和基因組學相比，代謝組學可以研究基因型的最終表達，因此是最接近最終表型的分析技術[11] 。其可用于分析代謝表型和探索代謝重編程，從而能夠鑒定生物標志物并提供對生理和病理機制進行分析研究[12] 。
本研究通過結扎冠狀動脈左前降支建立小鼠急性心肌梗死（acute MI，AMI）模型，對血清進行靶向代謝組學分析，從代謝組學角度探討心肌細胞缺血狀態后的代謝變化，并進一步分析其相關代謝路徑并構建網絡。這些結果進一步闡明了疾病所涉及的生化機制。
1 材料與方法
1.1 小鼠急性心肌梗死模型的建立
取同批次10周齡雄性C57BL/6小鼠15只［體重15～20 g，實驗動物生產許可證號SCXK（川）2020-0030 ］，隨機分為兩組：假手術對照組（n=5）和AMI模型組（n=10）。在沒有通氣的情況下用戊巴比妥鈉（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠。在胸骨左側做一小皮膚切口，并準備了荷包縫合。在第4肋間開一個小孔，用蚊鉗擴張。手法擠壓外側胸腔使跳動的心臟輕輕彈出，在冠狀動脈左前降支心房下方約3 mm處用7-0絲線快速縫合。當左心室前壁變白時，即可確認結扎成功。結扎后，將心臟放回胸腔內，手動排出胸腔內空氣。扎緊之前荷包縫合，在恢復期對小鼠進行監測。假手術對照組小鼠接受相同的手術操作，但未阻斷其冠狀動脈左前降支。
1.2 UHPLC-QqQ/MS的靶向代謝組學分析
所有小鼠于術后24 h采集血清標本。血清樣本添加了兩個內標的甲醇沉淀。然后收集上清液，干燥后用10 mM醋酸銨在30%水/70%乙酸乙酯+0.2%冰醋酸中重組，其中含有12.6 μM 3C5-15N-L-酪氨酸和34.68 μM 13C1-L-乳酸。將重組樣品分別以正離子和負離子模式加入到UHPLC? MS/MS中，質控樣品采用混合所有血清的混合樣品。
靶向代謝組學分析在Nexera LC-40A UHPLC系統上進行，該系統與AB Sciex三重四極桿（QQQ）5500質譜儀（美國，馬薩諸塞州弗雷明翰）相結合。然后在Waters BEH酰胺柱（2.1×100，1.7 μm，Waters，Milford，MA，USA）上在35℃的溫度下進行色層分離。多反應監測模式用于檢測感興趣的代謝物。本研究從40多條代謝途徑中選擇了238種代謝物進行靶向分析。用Analyst 1.6.3軟件采集數據，用Multiquant 3.0.2軟件（AB Sciex，Framingham，MA）進行分析。
1.3 統計學分析
所有數據已在SPSS驗證正態性分布。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較使用SPSSV21軟件 （Chicago，IL，USA）進行非配對t檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。用代謝組學途徑分析（MetaboAnalyst 5.0， http://www.metaboanalyst.ca/）對數據進行自動篩選，并對改變的代謝物進行分析，并與潛在的代謝途徑相關。KEGG數據庫（http://www.kegg.jp/）用于進一步確定這些改變的代謝物在各種代謝途徑中的位置和功能。
1.4 倫理審查
此研究經四川大學華西醫院動物倫理委員會批準，批準號為20220221020。
2 結果
2.1 兩組代謝譜分析
2.1.1 與心肌缺血相關的代謝物
129種代謝物中的50種與心肌缺血相關［fold change（FC）<0.5或>2，P的閾值被設定為0.05，且經偽發現率（FDR）矯正］；見圖1。其包括11種氨基酸（絲氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、D-亮氨酸、胱氨酸、肌氨酸、鳥氨酸、高絲氨酸）、2種甲基化氨基酸（二甲基甘氨酸、1/3-甲基組氨酸）、1種乙酰化氨基酸（N-乙酰甘氨酸）、2種堿基（胞嘧啶、腺嘌呤）、6種核苷（2'-脫氧尿苷、胞苷、腺苷、肌苷、1-甲基鳥苷、黃嘌呤核苷）、9種其他有機酸（杏仁酸、甘油酸、草乙酸、檸康酸、牛磺酸、壬二酸、2-氨基己二酸、2-羥基異戊酸、OH-苯基丙酮酸）、4種有機酸酯（胍基乙酸酯、腺苷酸琥珀酸酯、琥珀酸甲酯、丙二酸甲酯）、2種膽堿類及其相關產物（乙酰膽堿、三甲胺-N-氧化物），1種維生素（煙酸）、3種生物堿（色胺、脫氧肉堿、甜菜堿）及其他9種有機化合物；見表1。
圖1
血清代謝物的總體趨勢火山圖
每個點代表一個血清代謝物，模型組中明顯較高（FC>2）為紅色，較低（FC＜0.5）為藍色；不變的代謝物為灰色
表1
血清中的主要差異代謝物數據分析結果
在129種代謝的火山圖中，位于中央的代謝物代表模型組和對照組的樣本之間豐度相比只有較小的變化，紅點顯著表達上調的代謝物（共14種）。藍點是顯著表達下調的代謝物（共36種），灰點是無顯著差異的代謝物。腺苷在MI模型組的血清樣本中高出202.91倍，而2'-脫氧尿苷（FC=0.046051）、腺苷琥珀酸酯（FC=0.047406）、胞嘧啶（FC=0.047183）在MI模型組的血清樣本的含量最低。
2.1.2 129種代謝物在樣本中的變異系數
變異系數（CV）表示代謝物濃度的個體變異性的度量，從LC-MS數據中獲得每種血清代謝物的濃度，隨后計算CVs。根據其CV的大小分為7個亞組。在50種與心肌缺血相關的血清代謝物中，只有2種—色胺和2-氨基己二酸酯，屬于可變性較小的組（共17種，CV 0.3～0.4）。14種化合物在下一個變異最小的組中（共22 種，CV 0.4～0.5）。27種代謝物的變異性相對較大，CV的范圍為0.5～1.0。7種代謝物—1/3-甲基組氨酸、腺苷琥珀酸酯、甲基丙二酸、2'-脫氧尿苷、胞嘧啶、肌氨酸、黃嘌呤核苷，屬于最不穩定的亞組（共12種，CV>1.0）（圖2）。因此，超過一半的與心肌缺血相關的代謝物（27/50）的CV相對可變（CV 0.5～1.0）。
圖2
129種代謝物根據CV大小可分為7個亞組
紅色代表MI模型組相比對照組顯著上調（FC＞2）的代謝物；藍色代表MI模型組相比對照組顯著下調（FC＜0.5）的代謝物；MI：心肌梗死
2.1.3 主成分分析及建立PLS-DA和OPLS模型
采用主成分分析來降低血清代謝物豐度數據的維數。主成分分析結果顯示，兩組的血清代謝物圖標可以分開，提示在心肌缺血時代謝產物與正常狀態明顯不同（圖3a）。由于樣本量遠遠小于變量，故又建立了PLS-DA模型及OPLS-DA模型并進行了驗證。 圖3b 和圖3c分別清晰展示了PLS-DA評分圖及OPLS-DA評分圖，可以清晰地分離MI模型組和假手術對照組血清樣本的不同。圖3d及圖3e顯示了兩個模型的驗證參數及用CV-ANOVA檢驗的P值，OPLS-DA模型的Q2和R2都>0.5，所有模型的P值均≤0.05，表明模型有效。
圖3
兩組血清代謝物的主成分分析
a：PCA評分圖；b：PLS-DA評分圖；c：OPLS-DA評分圖；a～c評分圖揭示了兩組樣本的聚類性強，組內差異不大；d：PLS-DA模型；e：OPLS-DA模型；d和e的
2.2 與心肌缺血相關的代謝物改變
以驗證的OPLS-DA模型中的vip≥1、FDR≤0.05、組內CV＜0.2差異代謝物的篩選條件。假手術對照組、MI模型組血清中代謝產物變化的統計分析結果見表1。血清中共發現27種代謝物變化，包含氨基酸及其衍生物、有機酸、酯類。這些代謝產物在MI模型組和假手術對照組之間有較大差異。
2.3 心肌缺血相關代謝通路的改變
探索生物途徑可能有助于闡明心肌缺血時的代謝變化。結果表明代謝產物和代謝生物網絡發生了顯著變化；見圖4和表2。基于京都基因和基因組百科全書（KEGG）基于代謝物（impact value>0.2，FDR<0.05）的信號通路分析，篩選出影響最顯著的代謝途徑：（1）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；（2）甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；（3）乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝。為了探討心肌缺血時代謝變化，我們更多關注與特定代謝途徑相關的代謝物。參與氨基酸代謝途徑的代謝物在心肌缺血處理后顯著減低；見圖5。
圖4
心肌缺血時血清代謝物的通路分析概覽
每個圓圈的大小和顏色分別以Impact值和
表2
心肌缺血時涉及的代謝途徑總覽
圖5
在代謝途徑中定位相關代謝物
心肌梗死涉及3個代謝途徑：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝及乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝，檸檬酸循環可能溝通了這3個通路；紅色表示顯著增加，藍色表示減少，綠色表示不變，灰色表示非差異代謝物或未涉及
3 討論
本研究對急性MI小鼠血清進行了基于LC-MS/MS的代謝組學分析。提示在模型組的血清中存在明顯的代謝途徑紊亂和代謝產物改變。進一步分析發現絲氨酸相關代謝途徑參與了AMI的發病過程，并探討了其參與機制。
代謝組學作為一門新興的技術，多在AMI患者或AMI動物模型上開展[13-14]。當在動物模型中誘導MI時，不同方法誘導的MI之間的病理生理學差異有時會被忽視。在評估新的治療策略或評估實驗室之間的比較研究時，這種缺乏區分可能會導致混亂。并且因為代謝組學的高度敏感性，在人類研究中的組內一致性是困難的[4, 13]。而大型動物模型雖然可以更好地概括心臟重構和心律失常導致的缺血性損傷的臨床表現，但嚙齒動物模型，特別是小鼠，可以更深入地剖析MI的細胞和分子機制，尤其適用于高通量分析[15]。故而本研究選擇了C57BL/6小鼠品系，在基因組穩定的背景上，通過改良的快速冠狀動脈結扎手術，使用微創肋間（第4肋間）開胸，不涉及肋骨的切割。與最初的經胸骨切開，切開大約3根肋骨，進入心臟，然后結扎左冠狀動脈的手術入路相比，本研究采用的術式能夠防止因手術引起過度炎癥的發生，最大化避免了掩蓋早期MI引起的炎癥問題[15]。同時對照組小鼠也接受了相同的手術操作，以消除因手術導致的兩組血清代謝物變化不一致。采集血清標本的時間是術后24 h。此外，使用血清樣本而非心臟組織樣本，規避因難以識別的梗死區域導致的正常心臟組織混入樣本，從而影響代謝組學結果的問題。
本研究中，差異代謝物中大部分屬于氨基酸及其衍生物，這些血清代謝物可能是心肌細胞的特異性降解過程的指示物或者是與心肌缺血相關的系統性組織改變。與假手術對照組相比，2種代謝物（色氨、2-氨基己二酸酯）在MI模型組的血清中的含量顯著升高。色胺在MI模型組小鼠血清中的濃度升高了2.1816倍。色胺是一種微量胺類的神經遞質，在血清中的濃度與前體色氨酸的濃度相關，后者被芳香族L-胺基酸類脫羧基酶（aromatic L-amino acid decarboxylase，AADC）代謝成色胺。色胺能夠通過直接刺激α腎上腺素受體和5-羥色胺受體升高血壓[16]。2-氨基己二酸則是線粒體代謝產物，由必需氨基酸賴氨酸的分解代謝產生，具有能夠拮抗由谷氨酸的離子通道型受體，即N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）調節的神經興奮的特性[17-18]。在AMI期間，該受體經D絲氨酸內源性激活后，允許谷氨酸打開陽離子通道，增加交感神經的放電，從而進一步影響心臟功能[2, 19-20]。研究[1]表明，NMDAR受體阻劑美金剛（msemantine）能在MI模型中發揮心臟保護作用，這可能歸因于促炎和氧化應激因子的減少以及隨后心臟重塑的減少。此外，還有研究[21]表明，2-氨基己二酸血清水平的高低與線粒體功能障礙有關，并且與高密度脂蛋白負相關，而膽固醇的代謝在動脈粥樣硬化中起著至關重要的作用，個體中2-氨基己二酸的升高可能通過調節高密度脂蛋白和膽固醇水平而導致心臟代謝風險[17]。在心衰后的心室重構中，它與左室舒張期末內徑有關。
與之呈現相反趨勢的代謝物有13種，其中有3種氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸），這表明其利用增加或消耗增加。氨基酸影響細胞信號傳導、募集和增殖，并且在各種代謝物和相關途徑的生物合成中也具有重要作用[22]。例如，絲氨酸是一種非必需氨基酸，可以經甘氨酸轉化產生，并為單碳代謝提供碳單元，參與多種生理過程和生物途徑[23]。根據旋光度的不同，分為L-絲氨酸和D-絲氨酸，D-絲氨酸是由L-絲氨酸通過一種特定的消旋酶（serine racemase，SR）消旋產生的[20]。在神經系統中，它作為一種自分泌調節劑，由突觸后神經元釋放，可以與自己的NMDAR結合，從而“啟動”受體對突觸處的谷氨酸作出即時反應，促進神經元去極化和興奮[19-20]。蘇氨酸是必需氨基酸的一種，在調節營養代謝、大分子生物合成（參與形成腸黏膜蛋白和分泌的糖蛋白）和維持腸道穩態中起著至關重要的作用[24-26]。酪氨酸有β-腎上腺素受體（ESBAR）內源性敏化的作用，通過與β-腎上腺素受體位點結合，提高腎上腺素激活受體的效率，能對心衰患者心臟起正性肌力的作用[27]。
對生物途徑改變的研究可以進一步探討MI的發病機制。與假手術對照組相比，MI模型小鼠共有幾種常見的代謝紊亂途徑，如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝。而檸檬酸循環（citrate cycle）可能溝通了上述3個通路，而甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝是最受影響的通路。后者為前者提供了重要的能量代謝前體；見圖5[28]。前者不僅是3大營養素（碳水化合物、脂質、氨基酸）的最終代謝途徑，也是碳水化合物、脂質和氨基酸之間代謝聯系的重要樞紐[29]，其在心肌的氧化磷酸化中起核心作用。因此，缺血后的心臟循環活動下降，腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）產生減少，心臟收縮效率降低[30-31]。甘氨酸和絲氨酸可以通過激活心肌細胞中的甘氨酸受體來減少心中肌炎癥，間接抑制心臟成纖維細胞中膠原蛋白的產生，從而改善心肌纖維化，而蘇氨酸則與缺血-再灌注誘導的心肌損傷的改善有關[28-29]。另有研究[32]提到，穩定型心絞痛患者血漿甘氨酸水平與AMI風險呈負相關。
我們認為絲氨酸相關生物途徑可能成為改善AMI患者預后的一個治療靶點。絲氨酸的生物合成更是與線粒體功能和ATP的生產直接相關。有研究[33]表明，鈣調神經磷酸酶Aβ1（Calcineurin，CnAβ1）依賴于通過雷帕霉素靶蛋白途徑（mechanistic target of rapamycin pathway，mTOR）增強了絲氨酸和單碳代謝，從而促使了對包括谷胱甘肽在內的活性氧物質具有保護作用的抗氧化代謝產物的產生，減少了線粒體中的蛋白質氧化，并保持了ATP的產生，這反過來改善了收縮功能，并防止了心臟肥大背景下的心室重塑。而絲氨酸的生物合成有助于進入檸檬酸循環的葡萄糖通量的增加，促進NADPH的產生，以促進線粒體生成、修復及呼吸，并與衰竭心臟卸負后的心肌恢復有關[23]。來自體外吸收和體內糖酵解分支合成的絲氨酸可以轉化為甘氨酸，以供給單碳代謝一碳單位。 絲氨酸是單碳代謝的主要底物。甘氨酸和一碳單位必須在細胞質或線粒體中由絲氨酸經葉酸代謝產生，而一碳單位不僅是NADH和NADPH的主要來源，還參與動脈粥樣硬化和心血管疾病的發展[32, 34-35]。但在缺氧的條件下，細胞呼吸受到抑制，線粒體中的電子傳遞失敗，絲氨酸成為NADH的主要來源，而這種累積的NADH抑制檸檬酸循環，反而存在細胞毒性[35]。
絲氨酸及一碳代謝對心肌細胞的作用可能與能量途徑的改變有關。正常心臟主要消耗脂肪酸，而很少消耗葡萄糖[36]。而MI狀態下能量代謝異常，心臟主要消耗葡萄糖經糖酵解獲得能量[27, 31]。我們不妨提出猜想，由于電子傳遞鏈的阻斷或抑制，心肌細胞可能通過絲氨酸和單碳代謝途徑促進進入檸檬酸循環的葡萄糖通量，以期促進線粒體的恢復，并提供額外的ATP，幫助維持心臟的持續收縮。
這項研究也有一些局限性。首先，只對血清樣本進行了分析，未對心肌細胞進行研究，從而建立代謝物變化的聯系。其次，本研究所用的動物模型只采用了雄性小鼠，但在一些研究中，性別也作為能夠影響MI血清代謝物中變化的因素[13, 15]。因此在未來的研究中，動物模型將包含同等數量的雄性和雌性。前文已述內源性生成的絲氨酸可以經由單碳代謝改善線粒體功能，進而改善心臟收縮功能，但外源性給予絲氨酸對心臟細胞的作用尚不知曉。因此，細胞研究及相關動物研究將在未來進行。
綜上所述，本研究使用靶向的LC-MS/MS方法比較了MI小鼠和假手術對照組的血清代謝特征，反映了MI相關的能量缺乏、離子失衡、氧化應激、酸中毒和心臟損傷的病理生理過程。結果表明，存在由心肌缺血引起的代謝變化。在MI中發現絲氨酸相關代謝途徑中的代謝物在血清中含量降低。根據代謝組學研究，對MI時心肌保護提出新的治療方向。
利益沖突：無。
作者貢獻：尋斯琪主要負責代謝組學數據的采集分析和論文撰寫；干昌平和郭應強主要負責學術指導和論文審核；秦超毅主要負責實驗設計、動物實驗和論文最終審核定稿。
