心肌梗死（myocardial infarction，MI）是全世界范圍內冠狀動脈心臟病導致死亡的最常見的疾病之一，約占冠狀動脈心臟病的1/3[1]。MI在病理上定義為冠狀動脈閉塞引起心臟供血急劇減少、中斷或長期缺血，從而導致心肌細胞死亡或組織損傷[2]。MI區的心肌細胞凋亡主要由氧化應激、缺氧損傷、缺血/再灌注引起[3]，而缺氧介導的線粒體功能障礙與心肌細胞的凋亡密切相關，其中B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、caspase-3等蛋白直接參與細胞凋亡過程[4]。心肌細胞是一類終末分化細胞，保護受損心肌細胞與MI患者的預后密切相關。因此，抑制MI后心肌細胞的凋亡，成為治療MI的關鍵。
微小RNA（microRNA，miRNA）是一組長約21～23個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，已被證明通過與3’非翻譯區（3’ untranslated regions，3'-UTR）結合，在轉錄后調節靶基因的表達，從而參與心肌細胞增殖、分化和心臟功能的調控[5-6]。大量研究[7–10]證明，多種miRNA參與并調控MI的病理生理過程，如細胞凋亡、炎癥反應和氧化應激、血管生成等。miR-466c-3p靶向抑制SLC8A1緩解MI后心肌細胞的凋亡[11]，BC002059/ABHD10軸通過調節MiR-19b-3p促進MI的細胞凋亡[12]。其中miR-31a-5p與細胞增殖、衰老、凋亡、焦亡有關[13]。一項研究[14]表明，miR-31a-5p可通過RhoBTB1促進新生心肌細胞增殖。然而miR-31a-5p與MI的關系尚不清楚。
HIF-1α是一種轉錄因子，通過調節葡萄糖代謝、氧化還原動態平衡、血管生成和血管重塑、控制氧的遞送、細胞凋亡等，進而在MI的病理生理學中發揮著關鍵作用[15]。HIF-1α通過多種途徑調節細胞凋亡，包括誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、心肌營養素（cardiotrophin-1，CT-1）、線粒體氧化代謝，減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生等[16]。也有研究[17]報道，HIF-1α過表達增加HO-1誘導的抗氧化反應來減少MI后心肌細胞凋亡。本研究探究miR-31a-5p是否通過靶向調控HIF-1α促進MI中的心肌細胞凋亡。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
雄性C57BL/6J小鼠12只，SPF級，6～8周齡，體重18～20 g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物許可證號：SYXK（滬）2016-0009。大鼠心肌細胞系H9c2購自上海酶研生物科技有限公司。
1.1.2 主要試劑及儀器
試劑：氯化鈷（CoCl2）購自賽導通生物科技（上海）有限公司；胎牛血清、改良伊格爾培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；miR-31a-5p mimic、miR-31a-5p inhibitor、miR-NC、HIF-1α-3'-UTR 野生型（wild-type，WT）質粒、HIF-1α-3'-UTR 突變型（mutant，MUT）質粒均購自上海百易基因有限公司；Lipofectamine? 3000、Pierce? BCA Protein Assay Kit購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；EZ-press RNA Purification Kit購自美國EZBioscience公司；PrimeScript? RT reagent Kit、TB Green? Premix Ex Taq?購自日本TAKARA公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （by stem-loop）、Dual Luciferase Reporter Assay Kit、高敏型ECL化學發光檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，miR-31a-5p逆轉錄引物、qPCR引物、HIF-1α及內參基因GAPDH、U6引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；RIPA裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物購自上海碧云天生物技術有限公司；硝酸纖維素（PVDF）膜購自美國Millipore公司；HIF-1α、cleaved-caspase 3、bcl-2、β-actin抗體、辣根過氧化物酶偶聯的二抗均購自英國Abcam公司。
儀器：高速冷凍離心機（Eppendorf Centrifuge 5424R，德國）、超微量紫外分光光度儀（Thermo NANODROP ONE，美國）、梯度PCR儀（BIO-RAD T100? Thermal Cycler，美國）、實時熒光定量PCR儀（Roche LightCycler 480，美國）、化學發光成像儀（BIO-RAD ChemiDoc? Imaging System，美國）、全功能酶標儀（Biotek Synergy H1，美國）。
1.2 方法
1.2.1 生物信息學分析
miRNA 測序數據集來自Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/），數據集系列號：GSE208159（物種：Rattus norvegicus）。所有樣本均采用 GPL22760 Agilent-070154 Rat miRNA Microarray （miRNA ID version version）平臺檢測。使用R語言的limma包對miRNA數據進行標準化，并篩選差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）（|logFC|>1，P<0.05）。使用Hiplot（https://hiplot.com.cn/）繪制DEGs的火山圖，并篩選出16個差異顯著的miRNA作聚類熱圖。
1.2.2 預測miRNA靶基因
候選miRNA的靶基因通過TargetScan、miRDB、miRWalk、PicTar在線預測工具獲得，預測的靶基因通過使用Hiplot 繪制Venn圖，之后根據基因預測結果繪制mRNA和miRNA的結合位點。
1.2.3 構建小鼠MI模型
根據Gao等[18]報道的方法，結扎C57BL/6J小鼠冠狀動脈前降支構建MI模型（n=6）。術前12 h禁食、4 h禁水。小鼠使用氣體麻醉劑（2%異氟烷）麻醉，沿左側胸大肌下緣作一斜向小鼠左上肢的皮膚小切口（1.2 cm），并作一荷包縫合，鈍性分離和牽拉開胸大肌和胸小肌后，暴露第3肋間隙，使用血管鉗分開肋間隙，同時開始擠壓胸壁，心臟即可從打開的肋間隙跳出，在距離前降支起點3 mm的位置使用7-0 Proline絲線結扎，進針時注意不要穿透心室，結扎后，立即將心臟放回胸腔內，然后擠壓胸腔排氣，收緊預先放置的荷包縫合線以閉合皮膚切口。即刻測量小鼠心電圖，心電圖ST段抬高，結扎后左心室前壁變白時，認為造模成功。離開體麻醉，小鼠3～5 min內蘇醒。假手術組組予以相同手術處理但不結扎（n=6）。4周后，取小鼠心臟，部分組織凍于-80℃用于后續實驗，部分組織用于染色切片。
1.2.4 Masson染色
將小鼠石蠟切片用二甲苯，乙醇脫蠟至水，Weigert鐵蘇木素染10 min，流水下稍沖洗，1%鹽酸酒精分化，流水下沖洗5 min，酸性復紅-麗春紅染色5～10 min，流水下稍沖洗，0.2%醋酸水略洗，磷鉬酸液分化染3～5 min，在鏡下觀察組織分化成不同程度的紅色即可，0.2%醋酸水略洗，苯胺藍液染1～5 min，0.2%醋酸水略洗，95%酒精略洗。無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，置于顯微鏡下觀察。使用Image J處理，藍色的纖維化面積除以心肌總面積為纖維化占比。
1.2.5 細胞培養及處理
H9c2心肌細胞使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素（100 U /mL青霉素，100 μg/ mL鏈霉素）的DMEM培養基，在37°C含5％的CO2培養箱中培養。H9c2細胞接種于6孔板上生長直至達到70%～80%融合，設對照組，模型組（CoCl2組）、miR-31a-5p mimic組、NC組、miR-31a-5p inhibitor組，每組設3個復孔。miR-31a-5p mimic組、NC組、miR-31a-5p inhibitor組按照Lipofectamine? 3000轉染試劑盒操作說明書轉染，48 h后換液同模型組一并加入CoCl2至濃度為800 μmol/L誘導H9c2缺氧細胞模型，24 h后換液并收集細胞進行下一步實驗。
1.2.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-31a-5p及HIF-1α表達量
按照EZ-press RNA Purification Kit RNA抽提試劑盒操作說明書提取動物梗死區域心肌組織及各組H9c2心肌細胞總RNA，使用超微量紫外分光光度儀測定所提RNA的濃度和純度。
將總RNA按照PrimeScript? RT reagent Kit逆轉錄試劑盒說明書操作要求，將RNA逆轉錄成cDNA；需要檢測miR-31a-5p表達量的RNA按照miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）莖環法逆轉錄試劑盒操作說明書，將RNA逆轉錄成特異cDNA。實時熒光定量PCR：按照TB Green? Premix Ex Taq?試劑盒說明書進行PCR反應，進行40個循環，以GAPDH、U6為內參，目的基因HIF-1α、miR-31a-5p的相對表達水平用2–△△CT表示,每個樣本獨立重復3次。實時熒光定量PCR及miR-31a-5p莖環法逆轉錄引物序列見表1。
表1
RT-qPCR 引物序列
1.2.7 雙熒光素酶報告基因測定
利用HIF-1α中含有miR-31a-5p結合位點的3'-UTR片段構建HIF-1α-3'-UTR WT質粒。同時，通過將HIF-1α 序列中 UCUUGCC 替換為互補序列 AGAACGG構建HIF-1α-3'-UTR MUT 質粒。然后，將 H9c2接種到 24 孔板中培養 24 h，然后使用 Lipofectamine 3000共轉染 HIF-1α-3'-UTR WT、HIF-1α-3'-UTR MUT和 miR-31a-5p mimic/陰性對照 （NC）48 h后，棄去培養基，用PBS沖洗細胞兩次。然后，根據Dual Luciferase Reporter Assay Kit使用說明書，測定螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶。
1.2.8 Western blot法檢測蛋白表達水平
通過添加含蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物的RIPA裂解液收集動物梗死區心肌組織和H9c2細胞，并通過Pierce? BCA Protein Assay Kit測量蛋白濃度。通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白（20 μg），然后轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，將膜與一抗在4°C下孵育過夜。隨后，用辣根過氧化物酶偶聯的二抗室溫孵育1 h。滴加高敏型ECL化學發光檢測液，使用化學發光成像儀顯影，并使用Image J軟件對圖像進行灰度值分析。
1.3 統計學分析
采用GraphPad Prism 9.2進行了統計分析。所有數據均以均數±標準差（
±s）描述，兩組比較采用t檢驗。采用單因素方差分析或雙因素方差分析進行多組間比較。P≤0.05為差異有統計學意義。
1.4 倫理審查
本研究已通過上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院實驗動物倫理與使用委員會批準，批準號：A2020124。
2 結果
2.1 DEGs的篩選結果
從GEO數據庫下載的數據集GSE208159，以P≤0.05和|log2FC|>1為閾值標準，篩選結果顯示有16個DEGs，其中上調13個，下調3個。使用Hiplot繪制DEG的火山圖和聚類熱圖（圖1）。其中，發現miR-31a-5p在MI大鼠中表達差異顯著，且在大鼠和小鼠中序列一致。
圖1
與 MI 相關的 DEGs 的篩選
a：來自數據集GSE208159的DEGs的火山圖；b：DEGs的聚類熱圖
2.2 MI后小鼠心肌組織纖維化程度
取假手術組和MI后4周小鼠作Masson染色，結果表明MI后小鼠心肌細胞間隙增寬，大量纖維組織（藍色）替代正常心肌組織，纖維化程度較假手術組顯著升高，提示MI后心肌膠原沉積，纖維化加重（圖2）。
圖2
小鼠心肌組織Masson染色和纖維化程度
a～b：分別為假手術組、MI組小鼠心肌組織Masson染色切片（×20）；c：為小鼠心肌纖維化面積占比；****：
2.3 MI后小鼠心肌組織中miR-31a-5p的表達量和細胞凋亡情況
RT-qPCR結果表明MI后小鼠心肌組織miR-31a-5p表達較假手術組顯著上調（1.01±0.18 vs. 1.80±0.30，P<0.05）。同時，Western blot法檢測小鼠心肌組織中Bcl-2、cleaved-caspase 3蛋白表達水平，結果表明與假手術組相比，MI小鼠Bcl-2表達量顯著降低（1.39±0.08 vs. 0.95±0.15，P<0.05），cleaved-caspase 3顯著升高（0.86±0.21 vs. 1.44±0.17，P<0.05）（圖3）。以上結果提示MI后心肌細胞凋亡，且miR-31a-5p于MI區域心肌組織中高表達。
圖3
小鼠心肌組織中miR-31a-5p的表達量和細胞凋亡情況
a：MI小鼠心肌中miR-31a-5p的表達情況；b～d：MI小鼠心肌組織凋亡蛋白表達情況；*：
2.4 CoCl2化學誘導H9c2缺氧細胞模型中miR-31a-5p的表達量和細胞凋亡情況
RT-qPCR結果表明CoCl2組相較于對照組，miR-31a-5p的表達量顯著上調（1.08±0.54 vs. 3.66±0.60，P<0.01）。Western blot結果表明CoCl2組相較于對照組，Bcl-2表達量顯著降低（1.23±0.13 vs. 0.80±0.04，P<0.01），cleaved-caspase 3顯著升高（0.61±0.02 vs. 1.14±0.08，P<0.001）（圖4）。以上結果提示，CoCl2誘導H9c2細胞凋亡，miR-31a-5p在CoCl2誘導H9c2細胞中高表達。
圖4
H9c2缺氧細胞模型中miR-31a-5p的表達量和細胞凋亡情況
a：CoCl2組與對照組H9c2細胞中miR-31a-5p的表達情況；b～d：CoCl2組與對照組H9c2細胞凋亡蛋白表達情況；*：
2.5 miR-31a-5p靶基因的篩選與驗證
為了確定miR-31a-5p的靶基因，我們使用TargetScan、miRDB、miRWalk和PicTar靶基因在線預測工具，將獲得的預測靶基因繪制Venn圖（圖5a），我們研究發現HIF-1α是最有潛力的候選靶基因。如圖5b所示，顯示了miR-31a-5p與HIF-1α 3'-UTR的結合位點。為了進一步證實HIF-1α是miR-31a-5p的直接靶基因，我們進行了雙熒光素酶報告基因測定，結果表明與NC組相比，miR-31a-5p mimic與HIF-1α-3'-UTR WT質粒共轉染的相對熒光素酶活性降低（1.00±0.072 vs. 0.47±0.011，P<0.000 1），而共轉染HIF-1α-3'-UTR MUT和 miR-31a-5p mimic/NC 的相對熒光素酶活性沒有顯著變化（P>0.05，圖5c），表明 HIF-1α 是 miR-31a-5p 的直接靶基因。
圖5
miR-31a-5p靶基因的篩選與驗證
a：根據TargetScan、miRDB、miRWalk和PicTar靶基因在線預測工具預測結果所繪制的Venn圖；b：miR-31a-5p與人類、大鼠、小鼠HIF-1α基因3'-UTR的序列比對；c：利用與HIF-1α-3'-UTR WT或HIF-1α-3'-UTR MUT融合的pGL3報告載體，在H9c2細胞中進行了雙熒光素酶報告基因的檢測；****：
2.6 miR-31a-5p通過HIF-1α促進細胞凋亡
為了確認miR-31a-5p通過HIF-1α在H9c2細胞凋亡中的作用，我們首先驗證了miR-31a-5p在H9c2中對HIF-1α表達情況的影響。在轉錄水平上，RT-qPCR結果表明，與miR-NC相比，miR-31a-5p mimic顯著降低了HIF-1α mRNA的表達（5.35±0.88 vs. 2.79±0.37，P<0.001），而miR-31a-5p inhibitor則相反（4.23±0.60 vs. 6.32±0.53，P<0.01，圖6a～b）。在翻譯水平上，Western blot結果表明與miR-NC相比，miR-31a-5p mimic顯著降低了HIF-1α的表達（1.51±0.29 vs. 0.99±0.10，P<0.05），miR-31a-5p inhibitor升高了HIF-1α的表達（0.67±0.03 vs. 0.90±0.07，P<0.05，圖6 c～d、g、h），與PCR結果一致，進一步證實了HIF-1α是miR-31a-5p的靶基因。接著采用 Western blot法檢測細胞內凋亡蛋白水平，與miR-NC相比，miR-31a-5p mimic組Bcl-2表達量顯著降低（0.83±0.06 vs. 0.64±0.03，P<0.01），cleaved-caspase 3顯著升高（0.89±0.02 vs. 1.12±0.09，P<0.05），而miR-31a-5p inhibitor則相反， Bcl-2表達量升高（0.72±0.06 vs. 0.91±0.05，P<0.05），cleaved-caspase 3降低（0.88±0.01 vs. 0.55±0.03，P<0.000 1，圖6 c～j）。以上數據表明，在CoCl2誘導的H9c2缺氧模型中，miR-31a-5p 可以通過靶向HIF-1α 促進H9c2 心肌凋亡。
圖6
miR-31a-5p通過HIF-1α促進細胞凋亡
a～b：分別為RT-qPCR檢測CoCl2+mimic組和CoCl2+inhibitor組中HIF-1α mRNA的表達情況；c～f：Western blot法檢測CoCl2+mimic組中HIF-1α及細胞凋亡蛋白的表達情況；g～j：Western blot法檢測CoCl2+inhibitor組中HIF-1α及細胞凋亡蛋白的表達情況；*：
3 討論
心肌細胞凋亡是MI病理過程中的重要組成部分，是導致心力衰竭和心室重塑的主要危險因素，對心肌細胞凋亡的潛在分子機制進行研究有助于確定MI治療的潛在靶點。研究[13]表明，miR-31a-5p參與一系列疾病的病理生理過程，例如，抑制miR-31a-5p 可防止骨質流失并降低老年大鼠的破骨細胞活性；miR-31a-5p可調節內皮祖細胞增殖、遷移和血管生成等，對動脈瘤的修復、糖尿病傷口愈合具備積極作用[19-20]； 在膀胱癌、結直腸癌、腎細胞癌等癌癥中，miR-31a-5p均發揮重要作用[21–23]。miR-31a-5p除心肌細胞外還調控多種細胞的細胞凋亡，如miR-31a-5p通過靶向TP53加速肺動脈平滑肌細胞增殖、抑制動脈平滑肌細胞的凋亡參與高血壓的發生[24]；miR-31-5p 的過表達促進髓核細胞增殖，抑制細胞凋亡，進而在椎間盤病變中起保護作用[25]。既往研究證實了miR-31a-5p在疾病中的重要作用，但其在MI中的作用尚未見報道。我們發現miR-31a-5p在MI后心臟和CoCl2誘導的H9c2缺氧細胞模型顯著上調，同時miR-31a-5p inhibitor可有效緩解CoCl2誘導的心肌細胞凋亡，而miR-31a-5p mimic加重心肌細胞凋亡，這些結果表明miR-31a-5p惡化了MI的進展。
HIF-1α是HIF-1的α亞基，生理情況下，HIF-1α亞基在翻譯后即被泛素—蛋白酶水解復合體降解。而當缺氧發生時，這種降解途徑受到抑制，HIF-1α與HIF-1β形成有活性的HIF-1，進而影響靶基因的轉錄[26]。最近的研究表明，microRNA 可以作為HIF-1α 的直接調節劑并控制人類疾病的發展，miR-3662通過靶向HIF-1α參與胰腺癌的發生[27]；抑制miR -19a-3p通過靶向HIF -1α 促進血管生成并改善MI小鼠的心臟功能[8]；miR-939-5p通過靶向HIF-1α抑制PM2.5導致的內皮細胞損傷[28]。在本研究中，我們發現HIF-1α為miR-31a-5p的直接靶基因，miR-31a-5p inhibitor可以顯著促進HIF-1α在體外CoCl2處理的H9c2細胞中的表達，而miR-31a-5p mimic顯著降低了HIF-1α在H9c2細胞中的表達，同時雙熒光素酶報告基因測定也證實了HIF-1α是miR-31a-5p的直接靶基因。但由于HIF-1α也可以調控microRNA的表達，其間關系有待進一步的研究。
在本研究中，我們發現MI和CoCl2處理可以在體內和體外促進cleaved-caspase 3 的表達，并降低Bcl-2的表達。同時，miR-31a-5p inhibitor可以有效逆轉CoCl2誘導的細胞凋亡相關蛋白cleaved-caspase 3和Bcl-2的表達，這些研究結果都表明miR-31a-5p通過靶向HIF-1α促進心肌細胞凋亡。但HIF-1α如何參與調控心肌細胞凋亡是一個相對復雜的過程，其具體機制有待深入探討，且CoCl2誘導缺氧細胞模型與體內MI模型存在差異，因此，進一步探究miR-31a-5p在體內的作用及HIF-1α調控心肌細胞凋亡的具體機制具有重要意義。
利益沖突：無。
作者貢獻：盧孔利實施研究，包括數據庫分析、動物模型建立、細胞培養及處理、RT-qPCR、Western blot等，撰寫文章；李雪晴進行收集，整理數據、圖片，細胞培養等；杜凌負責細胞培養，收集、數據整理等；薛松設計課題及相關技術指導；連鋒設計課題及相關技術指導，對文章進行核對修改等。
心肌梗死（myocardial infarction，MI）是全世界范圍內冠狀動脈心臟病導致死亡的最常見的疾病之一，約占冠狀動脈心臟病的1/3[1]。MI在病理上定義為冠狀動脈閉塞引起心臟供血急劇減少、中斷或長期缺血，從而導致心肌細胞死亡或組織損傷[2]。MI區的心肌細胞凋亡主要由氧化應激、缺氧損傷、缺血/再灌注引起[3]，而缺氧介導的線粒體功能障礙與心肌細胞的凋亡密切相關，其中B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、caspase-3等蛋白直接參與細胞凋亡過程[4]。心肌細胞是一類終末分化細胞，保護受損心肌細胞與MI患者的預后密切相關。因此，抑制MI后心肌細胞的凋亡，成為治療MI的關鍵。
微小RNA（microRNA，miRNA）是一組長約21～23個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，已被證明通過與3’非翻譯區（3’ untranslated regions，3'-UTR）結合，在轉錄后調節靶基因的表達，從而參與心肌細胞增殖、分化和心臟功能的調控[5-6]。大量研究[7–10]證明，多種miRNA參與并調控MI的病理生理過程，如細胞凋亡、炎癥反應和氧化應激、血管生成等。miR-466c-3p靶向抑制SLC8A1緩解MI后心肌細胞的凋亡[11]，BC002059/ABHD10軸通過調節MiR-19b-3p促進MI的細胞凋亡[12]。其中miR-31a-5p與細胞增殖、衰老、凋亡、焦亡有關[13]。一項研究[14]表明，miR-31a-5p可通過RhoBTB1促進新生心肌細胞增殖。然而miR-31a-5p與MI的關系尚不清楚。
HIF-1α是一種轉錄因子，通過調節葡萄糖代謝、氧化還原動態平衡、血管生成和血管重塑、控制氧的遞送、細胞凋亡等，進而在MI的病理生理學中發揮著關鍵作用[15]。HIF-1α通過多種途徑調節細胞凋亡，包括誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、心肌營養素（cardiotrophin-1，CT-1）、線粒體氧化代謝，減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生等[16]。也有研究[17]報道，HIF-1α過表達增加HO-1誘導的抗氧化反應來減少MI后心肌細胞凋亡。本研究探究miR-31a-5p是否通過靶向調控HIF-1α促進MI中的心肌細胞凋亡。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
雄性C57BL/6J小鼠12只，SPF級，6～8周齡，體重18～20 g，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物許可證號：SYXK（滬）2016-0009。大鼠心肌細胞系H9c2購自上海酶研生物科技有限公司。
1.1.2 主要試劑及儀器
試劑：氯化鈷（CoCl2）購自賽導通生物科技（上海）有限公司；胎牛血清、改良伊格爾培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；miR-31a-5p mimic、miR-31a-5p inhibitor、miR-NC、HIF-1α-3'-UTR 野生型（wild-type，WT）質粒、HIF-1α-3'-UTR 突變型（mutant，MUT）質粒均購自上海百易基因有限公司；Lipofectamine? 3000、Pierce? BCA Protein Assay Kit購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；EZ-press RNA Purification Kit購自美國EZBioscience公司；PrimeScript? RT reagent Kit、TB Green? Premix Ex Taq?購自日本TAKARA公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （by stem-loop）、Dual Luciferase Reporter Assay Kit、高敏型ECL化學發光檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，miR-31a-5p逆轉錄引物、qPCR引物、HIF-1α及內參基因GAPDH、U6引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；RIPA裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物購自上海碧云天生物技術有限公司；硝酸纖維素（PVDF）膜購自美國Millipore公司；HIF-1α、cleaved-caspase 3、bcl-2、β-actin抗體、辣根過氧化物酶偶聯的二抗均購自英國Abcam公司。
儀器：高速冷凍離心機（Eppendorf Centrifuge 5424R，德國）、超微量紫外分光光度儀（Thermo NANODROP ONE，美國）、梯度PCR儀（BIO-RAD T100? Thermal Cycler，美國）、實時熒光定量PCR儀（Roche LightCycler 480，美國）、化學發光成像儀（BIO-RAD ChemiDoc? Imaging System，美國）、全功能酶標儀（Biotek Synergy H1，美國）。
1.2 方法
1.2.1 生物信息學分析
miRNA 測序數據集來自Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/），數據集系列號：GSE208159（物種：Rattus norvegicus）。所有樣本均采用 GPL22760 Agilent-070154 Rat miRNA Microarray （miRNA ID version version）平臺檢測。使用R語言的limma包對miRNA數據進行標準化，并篩選差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）（|logFC|>1，P<0.05）。使用Hiplot（https://hiplot.com.cn/）繪制DEGs的火山圖，并篩選出16個差異顯著的miRNA作聚類熱圖。
1.2.2 預測miRNA靶基因
候選miRNA的靶基因通過TargetScan、miRDB、miRWalk、PicTar在線預測工具獲得，預測的靶基因通過使用Hiplot 繪制Venn圖，之后根據基因預測結果繪制mRNA和miRNA的結合位點。
1.2.3 構建小鼠MI模型
根據Gao等[18]報道的方法，結扎C57BL/6J小鼠冠狀動脈前降支構建MI模型（n=6）。術前12 h禁食、4 h禁水。小鼠使用氣體麻醉劑（2%異氟烷）麻醉，沿左側胸大肌下緣作一斜向小鼠左上肢的皮膚小切口（1.2 cm），并作一荷包縫合，鈍性分離和牽拉開胸大肌和胸小肌后，暴露第3肋間隙，使用血管鉗分開肋間隙，同時開始擠壓胸壁，心臟即可從打開的肋間隙跳出，在距離前降支起點3 mm的位置使用7-0 Proline絲線結扎，進針時注意不要穿透心室，結扎后，立即將心臟放回胸腔內，然后擠壓胸腔排氣，收緊預先放置的荷包縫合線以閉合皮膚切口。即刻測量小鼠心電圖，心電圖ST段抬高，結扎后左心室前壁變白時，認為造模成功。離開體麻醉，小鼠3～5 min內蘇醒。假手術組組予以相同手術處理但不結扎（n=6）。4周后，取小鼠心臟，部分組織凍于-80℃用于后續實驗，部分組織用于染色切片。
1.2.4 Masson染色
將小鼠石蠟切片用二甲苯，乙醇脫蠟至水，Weigert鐵蘇木素染10 min，流水下稍沖洗，1%鹽酸酒精分化，流水下沖洗5 min，酸性復紅-麗春紅染色5～10 min，流水下稍沖洗，0.2%醋酸水略洗，磷鉬酸液分化染3～5 min，在鏡下觀察組織分化成不同程度的紅色即可，0.2%醋酸水略洗，苯胺藍液染1～5 min，0.2%醋酸水略洗，95%酒精略洗。無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，置于顯微鏡下觀察。使用Image J處理，藍色的纖維化面積除以心肌總面積為纖維化占比。
1.2.5 細胞培養及處理
H9c2心肌細胞使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素（100 U /mL青霉素，100 μg/ mL鏈霉素）的DMEM培養基，在37°C含5％的CO2培養箱中培養。H9c2細胞接種于6孔板上生長直至達到70%～80%融合，設對照組，模型組（CoCl2組）、miR-31a-5p mimic組、NC組、miR-31a-5p inhibitor組，每組設3個復孔。miR-31a-5p mimic組、NC組、miR-31a-5p inhibitor組按照Lipofectamine? 3000轉染試劑盒操作說明書轉染，48 h后換液同模型組一并加入CoCl2至濃度為800 μmol/L誘導H9c2缺氧細胞模型，24 h后換液并收集細胞進行下一步實驗。
1.2.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-31a-5p及HIF-1α表達量
按照EZ-press RNA Purification Kit RNA抽提試劑盒操作說明書提取動物梗死區域心肌組織及各組H9c2心肌細胞總RNA，使用超微量紫外分光光度儀測定所提RNA的濃度和純度。
將總RNA按照PrimeScript? RT reagent Kit逆轉錄試劑盒說明書操作要求，將RNA逆轉錄成cDNA；需要檢測miR-31a-5p表達量的RNA按照miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）莖環法逆轉錄試劑盒操作說明書，將RNA逆轉錄成特異cDNA。實時熒光定量PCR：按照TB Green? Premix Ex Taq?試劑盒說明書進行PCR反應，進行40個循環，以GAPDH、U6為內參，目的基因HIF-1α、miR-31a-5p的相對表達水平用2–△△CT表示,每個樣本獨立重復3次。實時熒光定量PCR及miR-31a-5p莖環法逆轉錄引物序列見表1。
表1
RT-qPCR 引物序列
1.2.7 雙熒光素酶報告基因測定
利用HIF-1α中含有miR-31a-5p結合位點的3'-UTR片段構建HIF-1α-3'-UTR WT質粒。同時，通過將HIF-1α 序列中 UCUUGCC 替換為互補序列 AGAACGG構建HIF-1α-3'-UTR MUT 質粒。然后，將 H9c2接種到 24 孔板中培養 24 h，然后使用 Lipofectamine 3000共轉染 HIF-1α-3'-UTR WT、HIF-1α-3'-UTR MUT和 miR-31a-5p mimic/陰性對照 （NC）48 h后，棄去培養基，用PBS沖洗細胞兩次。然后，根據Dual Luciferase Reporter Assay Kit使用說明書，測定螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶。
1.2.8 Western blot法檢測蛋白表達水平
通過添加含蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物的RIPA裂解液收集動物梗死區心肌組織和H9c2細胞，并通過Pierce? BCA Protein Assay Kit測量蛋白濃度。通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白（20 μg），然后轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，將膜與一抗在4°C下孵育過夜。隨后，用辣根過氧化物酶偶聯的二抗室溫孵育1 h。滴加高敏型ECL化學發光檢測液，使用化學發光成像儀顯影，并使用Image J軟件對圖像進行灰度值分析。
1.3 統計學分析
采用GraphPad Prism 9.2進行了統計分析。所有數據均以均數±標準差（±s）描述，兩組比較采用t檢驗。采用單因素方差分析或雙因素方差分析進行多組間比較。P≤0.05為差異有統計學意義。
1.4 倫理審查
本研究已通過上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院實驗動物倫理與使用委員會批準，批準號：A2020124。
2 結果
2.1 DEGs的篩選結果
從GEO數據庫下載的數據集GSE208159，以P≤0.05和|log2FC|>1為閾值標準，篩選結果顯示有16個DEGs，其中上調13個，下調3個。使用Hiplot繪制DEG的火山圖和聚類熱圖（圖1）。其中，發現miR-31a-5p在MI大鼠中表達差異顯著，且在大鼠和小鼠中序列一致。
圖1
與 MI 相關的 DEGs 的篩選
a：來自數據集GSE208159的DEGs的火山圖；b：DEGs的聚類熱圖
2.2 MI后小鼠心肌組織纖維化程度
取假手術組和MI后4周小鼠作Masson染色，結果表明MI后小鼠心肌細胞間隙增寬，大量纖維組織（藍色）替代正常心肌組織，纖維化程度較假手術組顯著升高，提示MI后心肌膠原沉積，纖維化加重（圖2）。
圖2
小鼠心肌組織Masson染色和纖維化程度
a～b：分別為假手術組、MI組小鼠心肌組織Masson染色切片（×20）；c：為小鼠心肌纖維化面積占比；****：
2.3 MI后小鼠心肌組織中miR-31a-5p的表達量和細胞凋亡情況
RT-qPCR結果表明MI后小鼠心肌組織miR-31a-5p表達較假手術組顯著上調（1.01±0.18 vs. 1.80±0.30，P<0.05）。同時，Western blot法檢測小鼠心肌組織中Bcl-2、cleaved-caspase 3蛋白表達水平，結果表明與假手術組相比，MI小鼠Bcl-2表達量顯著降低（1.39±0.08 vs. 0.95±0.15，P<0.05），cleaved-caspase 3顯著升高（0.86±0.21 vs. 1.44±0.17，P<0.05）（圖3）。以上結果提示MI后心肌細胞凋亡，且miR-31a-5p于MI區域心肌組織中高表達。
圖3
小鼠心肌組織中miR-31a-5p的表達量和細胞凋亡情況
a：MI小鼠心肌中miR-31a-5p的表達情況；b～d：MI小鼠心肌組織凋亡蛋白表達情況；*：
2.4 CoCl2化學誘導H9c2缺氧細胞模型中miR-31a-5p的表達量和細胞凋亡情況
RT-qPCR結果表明CoCl2組相較于對照組，miR-31a-5p的表達量顯著上調（1.08±0.54 vs. 3.66±0.60，P<0.01）。Western blot結果表明CoCl2組相較于對照組，Bcl-2表達量顯著降低（1.23±0.13 vs. 0.80±0.04，P<0.01），cleaved-caspase 3顯著升高（0.61±0.02 vs. 1.14±0.08，P<0.001）（圖4）。以上結果提示，CoCl2誘導H9c2細胞凋亡，miR-31a-5p在CoCl2誘導H9c2細胞中高表達。
圖4
H9c2缺氧細胞模型中miR-31a-5p的表達量和細胞凋亡情況
a：CoCl2組與對照組H9c2細胞中miR-31a-5p的表達情況；b～d：CoCl2組與對照組H9c2細胞凋亡蛋白表達情況；*：
2.5 miR-31a-5p靶基因的篩選與驗證
為了確定miR-31a-5p的靶基因，我們使用TargetScan、miRDB、miRWalk和PicTar靶基因在線預測工具，將獲得的預測靶基因繪制Venn圖（圖5a），我們研究發現HIF-1α是最有潛力的候選靶基因。如圖5b所示，顯示了miR-31a-5p與HIF-1α 3'-UTR的結合位點。為了進一步證實HIF-1α是miR-31a-5p的直接靶基因，我們進行了雙熒光素酶報告基因測定，結果表明與NC組相比，miR-31a-5p mimic與HIF-1α-3'-UTR WT質粒共轉染的相對熒光素酶活性降低（1.00±0.072 vs. 0.47±0.011，P<0.000 1），而共轉染HIF-1α-3'-UTR MUT和 miR-31a-5p mimic/NC 的相對熒光素酶活性沒有顯著變化（P>0.05，圖5c），表明 HIF-1α 是 miR-31a-5p 的直接靶基因。
圖5
miR-31a-5p靶基因的篩選與驗證
a：根據TargetScan、miRDB、miRWalk和PicTar靶基因在線預測工具預測結果所繪制的Venn圖；b：miR-31a-5p與人類、大鼠、小鼠HIF-1α基因3'-UTR的序列比對；c：利用與HIF-1α-3'-UTR WT或HIF-1α-3'-UTR MUT融合的pGL3報告載體，在H9c2細胞中進行了雙熒光素酶報告基因的檢測；****：
2.6 miR-31a-5p通過HIF-1α促進細胞凋亡
為了確認miR-31a-5p通過HIF-1α在H9c2細胞凋亡中的作用，我們首先驗證了miR-31a-5p在H9c2中對HIF-1α表達情況的影響。在轉錄水平上，RT-qPCR結果表明，與miR-NC相比，miR-31a-5p mimic顯著降低了HIF-1α mRNA的表達（5.35±0.88 vs. 2.79±0.37，P<0.001），而miR-31a-5p inhibitor則相反（4.23±0.60 vs. 6.32±0.53，P<0.01，圖6a～b）。在翻譯水平上，Western blot結果表明與miR-NC相比，miR-31a-5p mimic顯著降低了HIF-1α的表達（1.51±0.29 vs. 0.99±0.10，P<0.05），miR-31a-5p inhibitor升高了HIF-1α的表達（0.67±0.03 vs. 0.90±0.07，P<0.05，圖6 c～d、g、h），與PCR結果一致，進一步證實了HIF-1α是miR-31a-5p的靶基因。接著采用 Western blot法檢測細胞內凋亡蛋白水平，與miR-NC相比，miR-31a-5p mimic組Bcl-2表達量顯著降低（0.83±0.06 vs. 0.64±0.03，P<0.01），cleaved-caspase 3顯著升高（0.89±0.02 vs. 1.12±0.09，P<0.05），而miR-31a-5p inhibitor則相反， Bcl-2表達量升高（0.72±0.06 vs. 0.91±0.05，P<0.05），cleaved-caspase 3降低（0.88±0.01 vs. 0.55±0.03，P<0.000 1，圖6 c～j）。以上數據表明，在CoCl2誘導的H9c2缺氧模型中，miR-31a-5p 可以通過靶向HIF-1α 促進H9c2 心肌凋亡。
圖6
miR-31a-5p通過HIF-1α促進細胞凋亡
a～b：分別為RT-qPCR檢測CoCl2+mimic組和CoCl2+inhibitor組中HIF-1α mRNA的表達情況；c～f：Western blot法檢測CoCl2+mimic組中HIF-1α及細胞凋亡蛋白的表達情況；g～j：Western blot法檢測CoCl2+inhibitor組中HIF-1α及細胞凋亡蛋白的表達情況；*：
3 討論
心肌細胞凋亡是MI病理過程中的重要組成部分，是導致心力衰竭和心室重塑的主要危險因素，對心肌細胞凋亡的潛在分子機制進行研究有助于確定MI治療的潛在靶點。研究[13]表明，miR-31a-5p參與一系列疾病的病理生理過程，例如，抑制miR-31a-5p 可防止骨質流失并降低老年大鼠的破骨細胞活性；miR-31a-5p可調節內皮祖細胞增殖、遷移和血管生成等，對動脈瘤的修復、糖尿病傷口愈合具備積極作用[19-20]； 在膀胱癌、結直腸癌、腎細胞癌等癌癥中，miR-31a-5p均發揮重要作用[21–23]。miR-31a-5p除心肌細胞外還調控多種細胞的細胞凋亡，如miR-31a-5p通過靶向TP53加速肺動脈平滑肌細胞增殖、抑制動脈平滑肌細胞的凋亡參與高血壓的發生[24]；miR-31-5p 的過表達促進髓核細胞增殖，抑制細胞凋亡，進而在椎間盤病變中起保護作用[25]。既往研究證實了miR-31a-5p在疾病中的重要作用，但其在MI中的作用尚未見報道。我們發現miR-31a-5p在MI后心臟和CoCl2誘導的H9c2缺氧細胞模型顯著上調，同時miR-31a-5p inhibitor可有效緩解CoCl2誘導的心肌細胞凋亡，而miR-31a-5p mimic加重心肌細胞凋亡，這些結果表明miR-31a-5p惡化了MI的進展。
HIF-1α是HIF-1的α亞基，生理情況下，HIF-1α亞基在翻譯后即被泛素—蛋白酶水解復合體降解。而當缺氧發生時，這種降解途徑受到抑制，HIF-1α與HIF-1β形成有活性的HIF-1，進而影響靶基因的轉錄[26]。最近的研究表明，microRNA 可以作為HIF-1α 的直接調節劑并控制人類疾病的發展，miR-3662通過靶向HIF-1α參與胰腺癌的發生[27]；抑制miR -19a-3p通過靶向HIF -1α 促進血管生成并改善MI小鼠的心臟功能[8]；miR-939-5p通過靶向HIF-1α抑制PM2.5導致的內皮細胞損傷[28]。在本研究中，我們發現HIF-1α為miR-31a-5p的直接靶基因，miR-31a-5p inhibitor可以顯著促進HIF-1α在體外CoCl2處理的H9c2細胞中的表達，而miR-31a-5p mimic顯著降低了HIF-1α在H9c2細胞中的表達，同時雙熒光素酶報告基因測定也證實了HIF-1α是miR-31a-5p的直接靶基因。但由于HIF-1α也可以調控microRNA的表達，其間關系有待進一步的研究。
在本研究中，我們發現MI和CoCl2處理可以在體內和體外促進cleaved-caspase 3 的表達，并降低Bcl-2的表達。同時，miR-31a-5p inhibitor可以有效逆轉CoCl2誘導的細胞凋亡相關蛋白cleaved-caspase 3和Bcl-2的表達，這些研究結果都表明miR-31a-5p通過靶向HIF-1α促進心肌細胞凋亡。但HIF-1α如何參與調控心肌細胞凋亡是一個相對復雜的過程，其具體機制有待深入探討，且CoCl2誘導缺氧細胞模型與體內MI模型存在差異，因此，進一步探究miR-31a-5p在體內的作用及HIF-1α調控心肌細胞凋亡的具體機制具有重要意義。
利益沖突：無。
作者貢獻：盧孔利實施研究，包括數據庫分析、動物模型建立、細胞培養及處理、RT-qPCR、Western blot等，撰寫文章；李雪晴進行收集，整理數據、圖片，細胞培養等；杜凌負責細胞培養，收集、數據整理等；薛松設計課題及相關技術指導；連鋒設計課題及相關技術指導，對文章進行核對修改等。
