肺癌是全世界死亡率最高的惡性腫瘤，其早期診斷評估對患者綜合治療有至關重要的作用。肺癌的術前早期診斷依賴于多種影像及腫瘤標志物指標，但因其假陽性率高而無法精準評估。液體活檢生物標志物可通過非侵入式方法對外周血中循環腫瘤細胞及DNA進行檢測，正逐漸成為腫瘤精準醫療領域強有力的診斷工具。本文就液體活檢類生物標志物及其聯合臨床影像學特征在肺癌早期診斷中的研究進展作一綜述。
引用本文： 孫碩, 王鋒, 何立, 楊文文, 韓彪, 趙蒙蒙, 陳昶, 馬敏杰. 液體活檢生物標志物及其聯合影像學在肺癌早期診斷中應用的研究進展. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2023, 30(2): 313-319. doi: 10.7507/1007-4848.202205044 復制
肺癌是世界癌癥相關死亡的主要原因[1]，其中非小細胞癌約占全部肺癌的85%，5年生存率只有16%。肺癌死亡率高的重要原因之一是早期缺乏特異性臨床癥狀，大多數肺癌患者首次診斷時已處于晚期。早期診斷可預防、阻斷或者延遲疾病進程，是改善肺癌預后的關鍵。近年來，低劑量螺旋CT（low-dose computed tomography，LDCT）掃描在肺癌高危人群篩查中的假陽性率升高，對疑似病例的明確診斷提出了挑戰[2]，且目前臨床常用的血清標志物靈敏度、特異度均不理想[3]。因此，亟需開發更有效的檢測手段對肺癌高危人群進行明確診斷。
液體活檢為肺癌的早期診斷開辟了一條新途徑，各種癌基因、抑癌基因、信號通路成分和其它細胞過程都參與了肺癌的分子發病機制[4]。檢測方法標準化、檢測成本降低加速了液體活檢生物標志物的研究進程和臨床轉化。液體活檢包括非編碼RNA（non-coding RNA）、DNA甲基化、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）、肺癌相關蛋白和自身抗體，這些標本很容易獲得，具有非侵入性和可重復的優點。由于肺小結節難以進行組織活檢，液體活檢已成為一種很有前景的臨床策略。
新的研究[5]發現，在CT圖像上分析肺結節的影像學特征同樣可以預測肺癌，但鑒于肺癌發生過程中腫瘤異質性和克隆選擇，單獨使用液體活檢或影像學特征無法為肺癌診斷提供足夠的證據，聯合液體活檢生物標志物與臨床影像學特征的肺癌臨床診斷模型往往表現出較高的敏感度[6]。在這篇綜述中，我們將討論液體活檢類生物標志物及其聯合臨床影像學特征在肺癌早期診斷中的研究進展。
1 液體活檢診斷肺結節
1.1 非編碼RNA
1.1.1 微小RNA
微小RNA（microRNA，miRNA）在肺癌的早期診斷中具有潛在價值[7]。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、原位雜交（in situ hybridization，ISH）和新一代測序技術（next generation sequencing，NGS）給miRNA的準確檢測提供了方向[8]。 Lu 等[9]的研究共納入1 132份血液樣本，在723個miRNA中候選出13個，最終在565個樣本中開發了由6個miRNA（miR-17、miR-190b、miR-19a、miR-19b、miR-26b 和 miR-375）組成的基因檢測組套用于肺癌診斷，曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.873，敏感性為0.81，特異性為0.8，并在461個血漿樣本的驗證集中取得了0.868的AUC。此研究進一步發現血液中的miR-17、miR-190b和miR-375可用于肺癌的亞分類，這3種miRNA組成的基因檢測組套在區分小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中AUC為0.878，在驗證集中同樣表現出良好的性能。此外，有研究[10-12]表明miRNA具有早期診斷肺癌的潛力。
1.1.2 長鏈非編碼RNA
長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）與腫瘤的發生、增殖、轉移有關，因此lncRNA具有作為癌癥早期診斷的生物標志物的潛力[13]。Xie等[13]發現NSCLC患者的SOX2與ANRIL明顯上調，后將這兩種lncRNA與當前的腫瘤標志物［癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細胞角蛋白19的可溶性片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）和血清鱗狀細胞癌抗原］結合構建了NSCLC基因檢測組套，此組套在260例樣本組成的訓練集中AUC為0.853，在驗證集中AUC為0.883。
1.2 DNA甲基化
DNA的表觀遺傳修飾通過在染色體結構和組織水平上調節基因表達，是癌癥發生和發展的標志[14]。研究[15]證實了SHOX2和PTGER4的DNA甲基化可以區分肺癌和良性疾病，AUC為0.88，并可降低LDCT篩查的假陽性率。通過全基因組篩查得到的DNA甲基化用于區分肺癌與對照組，區分的敏感性和特異性分別為0.878和0.902[16]。Liang等[17]開發了PulmoSeek模型用于診斷肺結節，此模型的AUC為0.843。Chen等[18]使用超順磁性納米珠作為DNA載體檢測血漿中CDO1、TAC1、SOX17和HOXA7的甲基化，其中聯合CDO1、SOX17、HOXA7的模型在肺癌診斷中獲得最佳的敏感性和特異性，分別為0.9和0.71，AUC為0.88。因此基于液體活檢的DNA甲基化診斷模型可能有助于早期肺結節的診斷并指導臨床決策。
1.3 循環腫瘤DNA
ctDNA是血漿中來源于腫瘤細胞的核酸[19]。隨著靈敏檢測突變的分子技術進展，應用靶向NGS可評估數百個基因[20]，ctDNA作為非侵入性癌癥早期診斷的生物標志物受到廣泛關注。Leung等[21]的研究證實了基于液體活檢的ctDNA基因特征分析在肺癌診斷中表現良好，研究使用具有高分辨率的COLD-PCR（co-amplification at lower denaturation temperature-PCR）檢測癌癥相關單核苷酸的變異，在192例參與者中診斷肺癌的敏感性為0.75，特異性為0.89。目前的研究表明在早期肺癌患者的血液中可能檢測到突變的ctDNA，增加了ctDNA作為肺癌診斷的實用證據。
1.4 循環腫瘤細胞
CTCs是血漿中源于腫瘤組織的細胞[22]，在外周血中分離檢測CTCs可能有助于惡性肺結節的早期診斷[23-24]。一項前瞻性多中心研究[25-26]在第一次篩查（T0）中使用LDCT診斷肺結節的良惡性，得到的敏感性和特異性分別為0.826和0.731，同時使用上皮腫瘤細胞大小分離法檢測到的CTCs診斷早期肺癌的敏感性僅為0.263［95%CI（11.8，48.8）］，這表明使用該方法進行CTCs檢測不適合作為肺癌早期診斷的手段。處理標本CTCs時的技術困難阻礙了多中心臨床試驗的進展，然而近年來的技術進步讓CTCs在肺癌早期診斷中取得重大進展。上海肺科醫院用免疫磁珠法針對葉酸受體陽性的CTCs進行肺癌診斷，敏感性為0.875[27]。CANpatrol技術檢測NSCLC外周血CTCs的敏感性和特異性分別為0.816和0.868[28]。上皮細胞黏附分子和葉酸受體的聯合在檢測NSCLC時具有更好的診斷性能[29]。這可能是液體活檢用于肺癌早期診斷的未來研究方向。
CTCs在肺癌預后中同樣具有一定的價值。有研究[30]表明，在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變和ALK重排NSCLC患者中，CTCs計數具有預后預測價值。腫瘤細胞在血液中的轉移與侵襲和上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）有關，腫瘤細胞在EMT異常激活期間會產生波形蛋白（vimentin，Vim）。 Lindsay等[31]納入了125例晚期NSCLC患者，檢測了患者基線時的CTCs、Vim+CTCs（波形蛋白陽性CTCs），Vim+CTCs結果發現CTCs是總生存期的獨立預測指標，在CTCs基因水平表達檢測中發現，EGFR突變的肺癌患者Vim+CTCs水平顯著上升，KRAS突變患者的Vim+CTCs水平急劇降低，ALK重排的患者無差異，說明EGFR突變的NSCLC患者的CTCs具有EMT特征。近來研究[32]表明α-微管蛋白（alpha-tubulin，TUB）、去酪氨酸化微管蛋白（detyrosinated tubulin，GLU）、Vim 和程序性死亡配體-1在 NSCLC 患者的 CTCs 中高表達，這些生物標志物可能是肺癌的潛在預后因素，CTCs基因表達檢測或比CTCs計數更加影響患者的預后。在NSCLC患者中程序性死亡受體-1高表達CTCs會導致更差的臨床結果[33]。
1.5 肺癌相關蛋白
以往研究[34]表明肺癌相關蛋白不足以單獨作為早期診斷肺癌的生物標志物。一項研究[35]聯合12種生物標志物建立了早期肺癌診斷模型，此模型的敏感性為0.91，特異性為0.84，但外部驗證效果較差。匹茨堡大學研究[36]證明蛋白標記面板（pro-SFTPB、CEA、CYFRA21-1和CA125蛋白標記物）在區分肺癌患者組與健康組的AUC達0.76，具有一定的肺癌早期診斷潛力。以往研究中的肺癌相關腫瘤標志物往往特異性較低，且診斷效能沒有在大規模的臨床試驗中得到驗證。
1.6 肺癌相關自身抗體
自身抗體可能是早期診斷肺癌的潛在生物標志物[37]。研究[38]使用酶聯免疫吸附測定的7種自身抗體（p53、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGEA1、PGP9.5和CAGE）聯合構成了早期肺癌診斷面板，敏感性為0.478，特異性為0.814，AUC為0.764。血漿中anti-TIF1γ-IgA和anti-TIF1γ-IgG對早期肺癌具有診斷價值，兩者聯合診斷的AUC為0.734[39]。Lastwika等[40]的研究證實了血漿中來源于腫瘤的特異性抗體的組合早期診斷肺癌的AUC達0.78。由此可見肺癌相關自身抗體不能單作為肺癌早期診斷的生物標志物，血漿中的正常抗體對檢測結果干擾較大，因此有必要開發新的檢測技術進行精準的量化。
1.7 肺癌相關外泌體
Jin等[41]使用二代測序技術驗證了外泌體let-7b-5p、let-7e-5p、miR-23a-3p和miR-486-5p用于診斷早期肺癌的AUC為0.899。miR-146-5p和miR-486-5p診斷肺癌的AUC分別為0.813和0.886，再結合4種血清miRNA（miR-21-5p、miR-141-3p、miR-222-3p、miR-486-5p）后AUC提高至0.96[42]。Li等[43]報道了外泌體生長停滯特異性轉錄物-5可用于肺癌早期診斷，其AUC為0.822。Sandfeld-Paulsen等[44]應用細胞外囊泡陣列（extracellular vesicle array，EV陣列）測量的10個外泌體蛋白質生物標志物來診斷早期肺癌，其AUC為0.74。Jakobsen等[45]使用EV陣列分析了外泌體表型，聯合30種外泌體蛋白質構建了肺癌診斷模型，AUC為0.83，敏感性為0.75，特異性為0.76。Niu等[46]的研究證實了外泌體α-2-HS-糖蛋白和細胞外基質蛋白-1聯合診斷的AUC分別為0.795和0.739。
2 液體活檢聯合臨床影像學診斷肺結節
2.1 液體活檢聯合臨床CT特征
已有大量研究聯合生物標志物與臨床CT特征診斷早期肺癌，在現有的診斷方式中，基于生物標志物和臨床CT特征的肺癌診斷模型往往表現出更好的準確性和穩定性，可能有巨大的臨床意義。
2.1.1 液體活檢聯合單一臨床CT特征
Lin等[6]開發了一種整合miRNA（miR-205-5p和miR-126-3p）和結節直徑的分類器用于早期診斷肺結節，進行微滴式數字PCR分析以定量血漿miRNA，此分類器在359例訓練集中AUC為0.95。Ma等[47]聯合miRNA（miR-19b-3p、miR-29b-3p）與毛刺征開發了區分肺結節良惡性的模型，AUC為0.91，優于單獨使用生物標志物。Xing等[48]開發了一個基于液體活檢DNA甲基化（PTGER4、RASSF1A和SHOX2）和結節直徑的診斷肺結節的預測模型，此模型在210例受試者中的AUC為0.951，顯著高于單獨使用3個甲基化生物標志物和Mayo Clinic模型。Wei等[49]建立了基于血清白蛋白聯合臨床CT特征（邊界是否清晰）的NSCLC的新診斷模型，在142例受試者中獲得了0.74的AUC，證實了此模型在肺癌診斷中優于PKUPH模型（AUC=0.717）與Mayo Clinic模型（AUC=0.652）。
2.1.2 液體活檢聯合多個臨床CT特征
Zhang等[50]對120例受試者進行CT、CTCs獨立評價和聯合評價，其結果顯示單獨CTCs的AUC為0.843，CT聯合CTCs的AUC為0.918。孔德志等[51]建立了聯合液體活檢CTCs與臨床影像學特征（胸膜牽拉征、毛刺征和結節中實性成分比值）早期肺結節診斷模型，納入了1 277例患者，模型的敏感性為0.829，特異性為0.866，AUC為0.91，高于此前應用CTCs診斷早期肺癌的模型結果。Yonemori等[52]開發了聯合CEA、C反應蛋白與臨床CT特征（鈣化征、毛刺征、支氣管征）的孤立肺結節診斷模型，訓練集與驗證集的AUC分別為0.966和0.84。Pecot等[53]報道了血清蛋白組學特征聯合臨床CT特征（結節大小、毛刺征、分葉征、是否累及肺門）在肺癌早期診斷中具有附加價值。He等[54]同樣建立了一個區分肺結節良惡性的臨床模型，聯合了血清液體標志物（CEA、NSE）與臨床CT特征，此模型的AUC為0.768。Du等[55]將自身抗體（p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGEA1 和 CAGE）與CT聯合將診斷特異性由單獨應用自身抗體的0.916提升至0.958。
2.2 液體活檢聯合影像組學
影像組學近年來發展迅速，在肺結節早期診斷中展現出較高的敏感性。影像組學作為無創、高效率、連續監測患者肺結節狀態的方法，可以預測肺腺癌早期的生長速度[56]，能夠建立預測肺結節良惡性的模型[57]，還可用于肺癌放療的預后準確判斷[58]，影像組學展現出了在臨床工作中管理肺結節性質的重要能力[59]。Kammer等[60]將CYFRA21-1與影像組學特征結合在170例患者中建立了肺癌診斷模型，并在3個隊列中進行了驗證，最終發現此模型的診斷效能相較Mayo Clinic模型提高了0.124。這項研究改善了肺癌患者的無創診斷，縮短了癌癥診斷時間，潛在性地降低了不必要的侵入性操作發生率。
2.3 液體活檢聯合PET/CT參數
PET/CT是NSCLC診斷和分期的重要工具[61]，在早期肺癌的診斷、淋巴結及遠處轉移的檢測中均具有巨大潛力[62]。Albano等[63]的研究證實了PET/CT參數在肺癌診斷中準確度較高。Paez等[64]發現肺結節和轉移灶的PET/CT最大標準攝取值，在肺癌診斷中的準確度較高。Zhang等[65]比較了液體活檢CTCs和PET/CT參數在肺癌早期診斷中的價值，PET/CT參數與CTCs在肺癌診斷中的敏感性分別為0.964和0.757，對于早期肺癌診斷兩者的敏感性分別為0.917和0.65。這表明PET/CT參數和CTCs均存在肺癌早期診斷價值，但目前尚無更多PET/CT參數聯合液體活檢生物標志物用于肺癌早期診斷中的研究。
3 展望
LDCT 顯著增加了不確定肺結節的數量，然而，miRNA、cfDNA、肺癌相關蛋白與自身抗體等作為診斷肺結節的生物標志物，敏感性和特異性還不夠高，無法供臨床使用，這可能因為肺癌患者血液內這些生物標志物微量不易被檢測到，不能涵蓋所有腫瘤相關變化。肺腫瘤的不同病理類型具有不同的表觀遺傳改變，因此開發能夠安全且經濟高效地準確識別惡性結節的新方法具有臨床意義。第二代測序技術的發展使人們發現了更多可能有助于肺癌診斷的DNA甲基化位點、miRNA與特異性基因突變。另外，僅通過影像學很難診斷肺結節，尤其是早期肺磨玻璃結節（<10 mm）。
一些基于液體活檢和臨床影像學的模型已經顯示出早期診斷肺癌的潛力，聯合液體活檢生物標志物與臨床影像學特征可能在肺癌早期診斷中具有附加價值。液體活檢、臨床影像學聯合診斷肺結節具有很好的前景，提高了診斷的準確率，減少了有創診斷對患者的傷害，甚至可以術前評估手術切除范圍，評估治療效果，連續監測患者的預后，給患者帶來益處。對于肺癌，我們應該期待在臨床工作中使用這些工具可以縮短肺癌的識別和治療時間、提高患者生存率、減少對良性病變進行無效穿刺所產生的危害，以及合理減少應用病理活檢。綜上所述，我們認為聯合液體活檢生物標志物與影像學最終可以通過改善早期診斷來更好地管理肺癌治療。
目前將非侵入性檢查液體活檢聯合臨床影像學特征診斷肺結節仍然存在局限性：新的液體活檢標志物的成本與費用，液體活檢的微量精確性、敏感性、適用性，都將決定它們在臨床中的應用。最后，需要前瞻性臨床研究驗證其準確性，以調查對患者的實際臨床效用。
利益沖突：無。
作者貢獻：孫碩負責論文初稿撰寫與修改；陳昶進行文章的整體構思；趙蒙蒙負責修改后審校；王鋒、何立、楊文文負責文獻檢索；韓彪、馬敏杰進行數據整理與分析。
肺癌是世界癌癥相關死亡的主要原因[1]，其中非小細胞癌約占全部肺癌的85%，5年生存率只有16%。肺癌死亡率高的重要原因之一是早期缺乏特異性臨床癥狀，大多數肺癌患者首次診斷時已處于晚期。早期診斷可預防、阻斷或者延遲疾病進程，是改善肺癌預后的關鍵。近年來，低劑量螺旋CT（low-dose computed tomography，LDCT）掃描在肺癌高危人群篩查中的假陽性率升高，對疑似病例的明確診斷提出了挑戰[2]，且目前臨床常用的血清標志物靈敏度、特異度均不理想[3]。因此，亟需開發更有效的檢測手段對肺癌高危人群進行明確診斷。
液體活檢為肺癌的早期診斷開辟了一條新途徑，各種癌基因、抑癌基因、信號通路成分和其它細胞過程都參與了肺癌的分子發病機制[4]。檢測方法標準化、檢測成本降低加速了液體活檢生物標志物的研究進程和臨床轉化。液體活檢包括非編碼RNA（non-coding RNA）、DNA甲基化、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）、肺癌相關蛋白和自身抗體，這些標本很容易獲得，具有非侵入性和可重復的優點。由于肺小結節難以進行組織活檢，液體活檢已成為一種很有前景的臨床策略。
新的研究[5]發現，在CT圖像上分析肺結節的影像學特征同樣可以預測肺癌，但鑒于肺癌發生過程中腫瘤異質性和克隆選擇，單獨使用液體活檢或影像學特征無法為肺癌診斷提供足夠的證據，聯合液體活檢生物標志物與臨床影像學特征的肺癌臨床診斷模型往往表現出較高的敏感度[6]。在這篇綜述中，我們將討論液體活檢類生物標志物及其聯合臨床影像學特征在肺癌早期診斷中的研究進展。
1 液體活檢診斷肺結節
1.1 非編碼RNA
1.1.1 微小RNA
微小RNA（microRNA，miRNA）在肺癌的早期診斷中具有潛在價值[7]。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、原位雜交（in situ hybridization，ISH）和新一代測序技術（next generation sequencing，NGS）給miRNA的準確檢測提供了方向[8]。 Lu 等[9]的研究共納入1 132份血液樣本，在723個miRNA中候選出13個，最終在565個樣本中開發了由6個miRNA（miR-17、miR-190b、miR-19a、miR-19b、miR-26b 和 miR-375）組成的基因檢測組套用于肺癌診斷，曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.873，敏感性為0.81，特異性為0.8，并在461個血漿樣本的驗證集中取得了0.868的AUC。此研究進一步發現血液中的miR-17、miR-190b和miR-375可用于肺癌的亞分類，這3種miRNA組成的基因檢測組套在區分小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中AUC為0.878，在驗證集中同樣表現出良好的性能。此外，有研究[10-12]表明miRNA具有早期診斷肺癌的潛力。
1.1.2 長鏈非編碼RNA
長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）與腫瘤的發生、增殖、轉移有關，因此lncRNA具有作為癌癥早期診斷的生物標志物的潛力[13]。Xie等[13]發現NSCLC患者的SOX2與ANRIL明顯上調，后將這兩種lncRNA與當前的腫瘤標志物［癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細胞角蛋白19的可溶性片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）和血清鱗狀細胞癌抗原］結合構建了NSCLC基因檢測組套，此組套在260例樣本組成的訓練集中AUC為0.853，在驗證集中AUC為0.883。
1.2 DNA甲基化
DNA的表觀遺傳修飾通過在染色體結構和組織水平上調節基因表達，是癌癥發生和發展的標志[14]。研究[15]證實了SHOX2和PTGER4的DNA甲基化可以區分肺癌和良性疾病，AUC為0.88，并可降低LDCT篩查的假陽性率。通過全基因組篩查得到的DNA甲基化用于區分肺癌與對照組，區分的敏感性和特異性分別為0.878和0.902[16]。Liang等[17]開發了PulmoSeek模型用于診斷肺結節，此模型的AUC為0.843。Chen等[18]使用超順磁性納米珠作為DNA載體檢測血漿中CDO1、TAC1、SOX17和HOXA7的甲基化，其中聯合CDO1、SOX17、HOXA7的模型在肺癌診斷中獲得最佳的敏感性和特異性，分別為0.9和0.71，AUC為0.88。因此基于液體活檢的DNA甲基化診斷模型可能有助于早期肺結節的診斷并指導臨床決策。
1.3 循環腫瘤DNA
ctDNA是血漿中來源于腫瘤細胞的核酸[19]。隨著靈敏檢測突變的分子技術進展，應用靶向NGS可評估數百個基因[20]，ctDNA作為非侵入性癌癥早期診斷的生物標志物受到廣泛關注。Leung等[21]的研究證實了基于液體活檢的ctDNA基因特征分析在肺癌診斷中表現良好，研究使用具有高分辨率的COLD-PCR（co-amplification at lower denaturation temperature-PCR）檢測癌癥相關單核苷酸的變異，在192例參與者中診斷肺癌的敏感性為0.75，特異性為0.89。目前的研究表明在早期肺癌患者的血液中可能檢測到突變的ctDNA，增加了ctDNA作為肺癌診斷的實用證據。
1.4 循環腫瘤細胞
CTCs是血漿中源于腫瘤組織的細胞[22]，在外周血中分離檢測CTCs可能有助于惡性肺結節的早期診斷[23-24]。一項前瞻性多中心研究[25-26]在第一次篩查（T0）中使用LDCT診斷肺結節的良惡性，得到的敏感性和特異性分別為0.826和0.731，同時使用上皮腫瘤細胞大小分離法檢測到的CTCs診斷早期肺癌的敏感性僅為0.263［95%CI（11.8，48.8）］，這表明使用該方法進行CTCs檢測不適合作為肺癌早期診斷的手段。處理標本CTCs時的技術困難阻礙了多中心臨床試驗的進展，然而近年來的技術進步讓CTCs在肺癌早期診斷中取得重大進展。上海肺科醫院用免疫磁珠法針對葉酸受體陽性的CTCs進行肺癌診斷，敏感性為0.875[27]。CANpatrol技術檢測NSCLC外周血CTCs的敏感性和特異性分別為0.816和0.868[28]。上皮細胞黏附分子和葉酸受體的聯合在檢測NSCLC時具有更好的診斷性能[29]。這可能是液體活檢用于肺癌早期診斷的未來研究方向。
CTCs在肺癌預后中同樣具有一定的價值。有研究[30]表明，在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變和ALK重排NSCLC患者中，CTCs計數具有預后預測價值。腫瘤細胞在血液中的轉移與侵襲和上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）有關，腫瘤細胞在EMT異常激活期間會產生波形蛋白（vimentin，Vim）。 Lindsay等[31]納入了125例晚期NSCLC患者，檢測了患者基線時的CTCs、Vim+CTCs（波形蛋白陽性CTCs），Vim+CTCs結果發現CTCs是總生存期的獨立預測指標，在CTCs基因水平表達檢測中發現，EGFR突變的肺癌患者Vim+CTCs水平顯著上升，KRAS突變患者的Vim+CTCs水平急劇降低，ALK重排的患者無差異，說明EGFR突變的NSCLC患者的CTCs具有EMT特征。近來研究[32]表明α-微管蛋白（alpha-tubulin，TUB）、去酪氨酸化微管蛋白（detyrosinated tubulin，GLU）、Vim 和程序性死亡配體-1在 NSCLC 患者的 CTCs 中高表達，這些生物標志物可能是肺癌的潛在預后因素，CTCs基因表達檢測或比CTCs計數更加影響患者的預后。在NSCLC患者中程序性死亡受體-1高表達CTCs會導致更差的臨床結果[33]。
1.5 肺癌相關蛋白
以往研究[34]表明肺癌相關蛋白不足以單獨作為早期診斷肺癌的生物標志物。一項研究[35]聯合12種生物標志物建立了早期肺癌診斷模型，此模型的敏感性為0.91，特異性為0.84，但外部驗證效果較差。匹茨堡大學研究[36]證明蛋白標記面板（pro-SFTPB、CEA、CYFRA21-1和CA125蛋白標記物）在區分肺癌患者組與健康組的AUC達0.76，具有一定的肺癌早期診斷潛力。以往研究中的肺癌相關腫瘤標志物往往特異性較低，且診斷效能沒有在大規模的臨床試驗中得到驗證。
1.6 肺癌相關自身抗體
自身抗體可能是早期診斷肺癌的潛在生物標志物[37]。研究[38]使用酶聯免疫吸附測定的7種自身抗體（p53、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGEA1、PGP9.5和CAGE）聯合構成了早期肺癌診斷面板，敏感性為0.478，特異性為0.814，AUC為0.764。血漿中anti-TIF1γ-IgA和anti-TIF1γ-IgG對早期肺癌具有診斷價值，兩者聯合診斷的AUC為0.734[39]。Lastwika等[40]的研究證實了血漿中來源于腫瘤的特異性抗體的組合早期診斷肺癌的AUC達0.78。由此可見肺癌相關自身抗體不能單作為肺癌早期診斷的生物標志物，血漿中的正常抗體對檢測結果干擾較大，因此有必要開發新的檢測技術進行精準的量化。
1.7 肺癌相關外泌體
Jin等[41]使用二代測序技術驗證了外泌體let-7b-5p、let-7e-5p、miR-23a-3p和miR-486-5p用于診斷早期肺癌的AUC為0.899。miR-146-5p和miR-486-5p診斷肺癌的AUC分別為0.813和0.886，再結合4種血清miRNA（miR-21-5p、miR-141-3p、miR-222-3p、miR-486-5p）后AUC提高至0.96[42]。Li等[43]報道了外泌體生長停滯特異性轉錄物-5可用于肺癌早期診斷，其AUC為0.822。Sandfeld-Paulsen等[44]應用細胞外囊泡陣列（extracellular vesicle array，EV陣列）測量的10個外泌體蛋白質生物標志物來診斷早期肺癌，其AUC為0.74。Jakobsen等[45]使用EV陣列分析了外泌體表型，聯合30種外泌體蛋白質構建了肺癌診斷模型，AUC為0.83，敏感性為0.75，特異性為0.76。Niu等[46]的研究證實了外泌體α-2-HS-糖蛋白和細胞外基質蛋白-1聯合診斷的AUC分別為0.795和0.739。
2 液體活檢聯合臨床影像學診斷肺結節
2.1 液體活檢聯合臨床CT特征
已有大量研究聯合生物標志物與臨床CT特征診斷早期肺癌，在現有的診斷方式中，基于生物標志物和臨床CT特征的肺癌診斷模型往往表現出更好的準確性和穩定性，可能有巨大的臨床意義。
2.1.1 液體活檢聯合單一臨床CT特征
Lin等[6]開發了一種整合miRNA（miR-205-5p和miR-126-3p）和結節直徑的分類器用于早期診斷肺結節，進行微滴式數字PCR分析以定量血漿miRNA，此分類器在359例訓練集中AUC為0.95。Ma等[47]聯合miRNA（miR-19b-3p、miR-29b-3p）與毛刺征開發了區分肺結節良惡性的模型，AUC為0.91，優于單獨使用生物標志物。Xing等[48]開發了一個基于液體活檢DNA甲基化（PTGER4、RASSF1A和SHOX2）和結節直徑的診斷肺結節的預測模型，此模型在210例受試者中的AUC為0.951，顯著高于單獨使用3個甲基化生物標志物和Mayo Clinic模型。Wei等[49]建立了基于血清白蛋白聯合臨床CT特征（邊界是否清晰）的NSCLC的新診斷模型，在142例受試者中獲得了0.74的AUC，證實了此模型在肺癌診斷中優于PKUPH模型（AUC=0.717）與Mayo Clinic模型（AUC=0.652）。
2.1.2 液體活檢聯合多個臨床CT特征
Zhang等[50]對120例受試者進行CT、CTCs獨立評價和聯合評價，其結果顯示單獨CTCs的AUC為0.843，CT聯合CTCs的AUC為0.918。孔德志等[51]建立了聯合液體活檢CTCs與臨床影像學特征（胸膜牽拉征、毛刺征和結節中實性成分比值）早期肺結節診斷模型，納入了1 277例患者，模型的敏感性為0.829，特異性為0.866，AUC為0.91，高于此前應用CTCs診斷早期肺癌的模型結果。Yonemori等[52]開發了聯合CEA、C反應蛋白與臨床CT特征（鈣化征、毛刺征、支氣管征）的孤立肺結節診斷模型，訓練集與驗證集的AUC分別為0.966和0.84。Pecot等[53]報道了血清蛋白組學特征聯合臨床CT特征（結節大小、毛刺征、分葉征、是否累及肺門）在肺癌早期診斷中具有附加價值。He等[54]同樣建立了一個區分肺結節良惡性的臨床模型，聯合了血清液體標志物（CEA、NSE）與臨床CT特征，此模型的AUC為0.768。Du等[55]將自身抗體（p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGEA1 和 CAGE）與CT聯合將診斷特異性由單獨應用自身抗體的0.916提升至0.958。
2.2 液體活檢聯合影像組學
影像組學近年來發展迅速，在肺結節早期診斷中展現出較高的敏感性。影像組學作為無創、高效率、連續監測患者肺結節狀態的方法，可以預測肺腺癌早期的生長速度[56]，能夠建立預測肺結節良惡性的模型[57]，還可用于肺癌放療的預后準確判斷[58]，影像組學展現出了在臨床工作中管理肺結節性質的重要能力[59]。Kammer等[60]將CYFRA21-1與影像組學特征結合在170例患者中建立了肺癌診斷模型，并在3個隊列中進行了驗證，最終發現此模型的診斷效能相較Mayo Clinic模型提高了0.124。這項研究改善了肺癌患者的無創診斷，縮短了癌癥診斷時間，潛在性地降低了不必要的侵入性操作發生率。
2.3 液體活檢聯合PET/CT參數
PET/CT是NSCLC診斷和分期的重要工具[61]，在早期肺癌的診斷、淋巴結及遠處轉移的檢測中均具有巨大潛力[62]。Albano等[63]的研究證實了PET/CT參數在肺癌診斷中準確度較高。Paez等[64]發現肺結節和轉移灶的PET/CT最大標準攝取值，在肺癌診斷中的準確度較高。Zhang等[65]比較了液體活檢CTCs和PET/CT參數在肺癌早期診斷中的價值，PET/CT參數與CTCs在肺癌診斷中的敏感性分別為0.964和0.757，對于早期肺癌診斷兩者的敏感性分別為0.917和0.65。這表明PET/CT參數和CTCs均存在肺癌早期診斷價值，但目前尚無更多PET/CT參數聯合液體活檢生物標志物用于肺癌早期診斷中的研究。
3 展望
LDCT 顯著增加了不確定肺結節的數量，然而，miRNA、cfDNA、肺癌相關蛋白與自身抗體等作為診斷肺結節的生物標志物，敏感性和特異性還不夠高，無法供臨床使用，這可能因為肺癌患者血液內這些生物標志物微量不易被檢測到，不能涵蓋所有腫瘤相關變化。肺腫瘤的不同病理類型具有不同的表觀遺傳改變，因此開發能夠安全且經濟高效地準確識別惡性結節的新方法具有臨床意義。第二代測序技術的發展使人們發現了更多可能有助于肺癌診斷的DNA甲基化位點、miRNA與特異性基因突變。另外，僅通過影像學很難診斷肺結節，尤其是早期肺磨玻璃結節（<10 mm）。
一些基于液體活檢和臨床影像學的模型已經顯示出早期診斷肺癌的潛力，聯合液體活檢生物標志物與臨床影像學特征可能在肺癌早期診斷中具有附加價值。液體活檢、臨床影像學聯合診斷肺結節具有很好的前景，提高了診斷的準確率，減少了有創診斷對患者的傷害，甚至可以術前評估手術切除范圍，評估治療效果，連續監測患者的預后，給患者帶來益處。對于肺癌，我們應該期待在臨床工作中使用這些工具可以縮短肺癌的識別和治療時間、提高患者生存率、減少對良性病變進行無效穿刺所產生的危害，以及合理減少應用病理活檢。綜上所述，我們認為聯合液體活檢生物標志物與影像學最終可以通過改善早期診斷來更好地管理肺癌治療。
目前將非侵入性檢查液體活檢聯合臨床影像學特征診斷肺結節仍然存在局限性：新的液體活檢標志物的成本與費用，液體活檢的微量精確性、敏感性、適用性，都將決定它們在臨床中的應用。最后，需要前瞻性臨床研究驗證其準確性，以調查對患者的實際臨床效用。
利益沖突：無。
作者貢獻：孫碩負責論文初稿撰寫與修改；陳昶進行文章的整體構思；趙蒙蒙負責修改后審校；王鋒、何立、楊文文負責文獻檢索；韓彪、馬敏杰進行數據整理與分析。