慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于心肌梗死、炎癥、血流動力學負荷過重等引起心臟結構、功能異常，進而導致心室充盈、射血功能下降，無法將靜脈回流的血液排出心臟，動脈血液供應不足，引發心力衰竭[1]。據調查，中國CHF患病率達0.9%，而且在逐年增加，5年生存率與惡性腫瘤相似[2]。近年來，與CHF相關的發病率和死亡率仍在上升[3-4]。因此，需要鑒定針對該病癥的新型治療靶標。據報道，炎癥與CHF發生發展密切相關[5]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是心臟發育和心臟疾病的強大調節因子[6]。已知lncRNA H19在胚胎組織中大量表達，與心臟發育和血管形成有關[7]，并且已有研究[8]表明lncRNA H19可作為肺動脈高血壓右心衰竭的一種新的生物標志物和治療靶點；然而lncRNA H19是否參與CHF的病理進展及其潛在功能仍不清楚。另有研究[9]發現CHF患者外周血中微小RNA-214（microRNA-214，miR-214）水平顯著低于健康受試者，卡維地洛發揮心臟保護作用的機制之一可能是通過增加miR-214表達；miR-214過表達可抑制心肌細胞凋亡、氧化應激反應和炎癥反應，減輕腦缺血-再灌注大鼠的心肌損傷[10]，表明miR-214是一種重要的心臟保護因子。筆者通過starbase數據庫預測到lncRNA H19包含miR-214的結合位點，miR-214可能是lncRNA H19的靶基因。因此，本研究擬以CHF大鼠為對象，通過沉默lncRNA H19、沉默miR-214探究lncRNA H19對CHF的影響及可能的作用機制，為CHF的診斷及治療提供新的思路與參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SPF級健康SD雄性大鼠，體重（300±10）g，10周齡，由北京維通利華動物中心提供，許可證號：SCXK（京）2019-0011。所有動物均嚴格按照動物飼養規則喂養，環境溫度為（24±2）℃，濕度為50%～60%，12 h明暗交替，自由飲水和攝食。飼養1周充分適應環境后開始實驗。
1.2 基因、試劑與儀器
大鼠lncRNA H19小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、lncRNA H19 siRNA陰性對照、miR-214 siRNA、miR-214 siRNA陰性對照的重組腺病毒及PCR引物均由上海吉瑪基因公司合成。肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）（批號RA20038）、心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）（批號RA20647）、B型腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）（批號RA20446）、N末端B型鈉尿肽前體（N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP）（批號RA20318）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）（批號RA20020）、白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）（批號RA20058）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）（批號RA20607）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（批號RA20035）酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑（批號C0137）、RIPA裂解液（批號P0018K）和BCA試劑盒（批號P0012S）均購自上海碧云天生物技術有限公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（批號SL-50237）、TRIzol提取試劑盒（批號SL-10673）、反轉錄試劑盒（批號SP-20792）及PCR試劑盒（SYBR? Premix Ex TaqTM）（批號SP-70018）均購自上海滬震生物科技有限公司；兔抗鼠B淋巴細胞瘤-2蛋白（B lymphocytoma-2 protein，Bcl-2）（批號ab196495）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）（批號ab53154）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）（批號ab238972）、β-肌動蛋白（β-actin）（批號ab8227）單克隆抗體、羊抗鼠二抗（批號ab205718）均購自美國Abcam公司。超高分辨率小動物超聲影像系統（型號Vevo 2100）購自加拿大VisualSonics公司；多功能酶標儀（型號iMark680）、流式細胞儀（型號C6）、熒光顯微鏡（型號XD-202）均購自中生（蘇州）醫療科技有限公司；熒光定量PCR儀（型號SLAN-48P）、凝膠成像儀（型號JY02G）均購自上海透景生命科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 動物模型制備
參照文獻[11-12]采用腹主動脈縮窄術建立CHF大鼠模型。大鼠于造模前禁食不禁水12 h，腹腔注射40 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，連接肢體心電圖電極和小動物呼吸機，腹部脫毛備皮，碘伏消毒，沿腹中線打開腹腔，撥開腸道，暴露腹主動脈，用4-0號縫合線將腹主動脈與6號鈍不銹鋼針結扎，扎緊后取出不銹鋼針，結扎處明顯縮窄，心電圖示ST段明顯抬高為結扎成功，縫合肌肉、皮膚；術后腹腔注射青霉素20萬單位/kg預防感染。飼養5周后用超高分辨率小動物超聲影像系統檢測左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF），若LVEF<60%即為模型成功[11]。造模大鼠出現射血分數保留型心力衰竭，共93只大鼠參與造模，成功造模84只。
1.3.2 分組和腺病毒轉染
將84只造模成功大鼠隨機分為模型組、si-NC組（轉染lncRNA H19 siRNA陰性對照）、si-H19組（轉染lncRNA H19 siRNA）、si-miR-NC組（轉染miR-214 siRNA陰性對照）、si-miR-214組（轉染miR-214 siRNA）、si-H19+si-miR-NC組（lncRNA H19 siRNA和miR-214 siRNA陰性對照共轉染）、si-H19+si-miR-214組（lncRNA H19 siRNA和miR-214 siRNA共轉染），每組12只。另設假手術組12只（大鼠只穿線不結扎，其余操作同模型組）。各轉染組大鼠使用微量注射器將100 μL相應的腺病毒溶液（1×109 PFU）經尾靜脈注入，假手術組和模型組大鼠注射等量生理鹽水，每周1次，連續4周。
1.3.3 心功能檢測
干預4周后，麻醉大鼠，采用超高分辨率小動物超聲影像系統測量大鼠左心室收縮末期內徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、LVEF、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。
1.3.4 血清指標檢測
心功能檢測完成后，腹主動脈取血，并在高速冷凍離心機中以3 000 r/min離心10 min，取上清。根據試劑盒說明書，通過ELISA法檢測大鼠的CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP、IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平。
1.3.5 心肌組織保存及HE染色
取血完成后，處死大鼠，打開胸腔，取出心臟，并用預冷的生理鹽水洗滌殘留血液。將大鼠心臟分為三部分，一部分液氮速凍后，?80℃冰箱保存待測；一部分心肌組織剪碎后胰酶消化，用于流式細胞術；另一部分心肌組織用4%多聚甲醛溶液固定，4℃過夜，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察心肌組織病理變化。
1.3.6 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡
心肌組織在充分剪碎后，加入適量的胰酶消化液，37℃混合裂解30 min，70 μm濾網過濾后，1 000 r/min離心10 min，棄去上清，重懸細胞，制成單細胞懸液。將100 μL細胞懸液加入5 mL流式管中，然后加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，避光孵育15 min后，用流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡。
1.3.7 實時熒光定量PCR檢測心肌組織lncRNA H19、miR-214表達
取?80℃冰箱保存的心肌組織，用TRIzol試劑盒提取心肌組織的總RNA，紫外分光光度法檢測總RNA的濃度和純度，使用反轉錄試劑盒進行反轉錄，收集cDNA用于PCR擴增。擴增體系：cDNA 1 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM 10 μL，加入無核酸酶的純水使最終體積為20 μL。擴增條件：95℃孵育10 min；95℃預變性5 s，60℃退火并延伸30 s，總共40個循環。每個樣品設置3個重復孔，并且實驗進行3次。引物序列見表1，GAPDH用作lncRNA H19的內源性對照，而U6用作miR-214的內源性對照，并使用2-Δ?Ct方法分析lncRNA H19、miR-214表達水平。
表1
引物序列
1.3.8 蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-1表達
取?80℃冰箱保存的心肌組織，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，靜置后離心，提取上清液為總蛋白溶液。用BCA法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品（30 μg/孔），凝膠電泳，濕轉法轉膜，使用5%脫脂奶粉阻斷與膜的非特異性結合，然后將膜與Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）一抗孵育過夜，然后與羊抗鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL顯色，以β-actin為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。
1.3.9 雙熒光素酶報告基因檢測
生物信息學分析預測，lncRNA H19包含針對miR-214的結合位點。為了驗證它們是否可以直接相互作用，我們構建了重組質粒pmirGLO-H19-WT和pmirGLO-H19-Mut。大鼠H19野生型序列（H19-WT）和缺少miR-214結合位點的突變體衍生物（H19-Mut）被亞克隆到熒光素酶基因編碼區的下游。將HEK293T細胞接種到24孔板中，使用Lipofectamine 2000試劑與熒光素酶報道質粒和miR-214模擬物或miR-NC共轉染。轉染后48 h，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統（Promega）檢查每組中的熒光素酶活性。
1.4 統計學分析
所有統計分析均使用SPSS 25.0軟件進行，計量資料服從正態分布，以均數±標準差（
±s）描述，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。
1.5 倫理審查
本研究經六盤水市人民醫院倫理委員會批準，批準編號：LSZ-2021-004。
2 結果
2.1 各組大鼠心肌組織lncRNA H19、miR-214水平比較
與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織lncRNA H19水平明顯升高，miR-214水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組大鼠心肌組織lncRNA H19、miR-214水平無明顯變化（P＞0.05），si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠心肌組織lncRNA H19水平明顯降低，miR-214水平明顯升高（P＜0.05），si-miR-214組大鼠心肌組織miR-214水平明顯降低（P＜0.05）；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠miR-214水平明顯降低（P＜0.05）；見表2。
表2
各組大鼠心肌組織lncRNA H19、miR-214水平比較（
，n=12）
2.2 各組大鼠的心功能比較
與假手術組相比，模型組大鼠LVESD、LVEDD明顯增加，LVEF、LVFS明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組心功能無明顯變化（P＞0.05），si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠LVESD、LVEDD明顯減小，LVEF、LVFS明顯升高（P＜0.05），si-miR-214組大鼠LVESD、LVEDD明顯增加，LVEF、LVFS明顯降低（P＜0.05）；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠LVESD、LVEDD明顯增加，LVEF、LVFS明顯降低（P＜0.05）；見圖1、表3。
圖1
各組大鼠心臟超聲代表性圖像
表3
各組大鼠心功能比較（
，n=12）
2.3 各組大鼠血清心肌損傷標志物和心力衰竭標志物水平比較
與假手術組相比，模型組大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平無明顯變化（P＞0.05），si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平明顯降低（P＜0.05），si-miR-214組大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平明顯升高（P＜0.05）；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平明顯升高（P＜0.05）；見表4。
表4
各組大鼠血清心肌損傷標志物和心力衰竭標志物水平比較（
，n=12）
2.4 各組大鼠血清炎性相關因子水平比較
與假手術組相比，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平無明顯變化（P＞0.05），si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平明顯降低（P＜0.05），si-miR-214組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平明顯升高（P＜0.05）；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平明顯升高（P＜0.05）；見表5。
表5
各組大鼠血清炎性相關因子水平比較（
，n=12，pg/mL）
2.5 各組大鼠心肌組織病理學觀察
HE染色結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞形態規則、排列整齊、心肌纖維完整，未見心肌細胞水腫、壞死；模型組大鼠心肌嚴重受損，細胞形態不規則、排列紊亂、局部肌纖維橫紋消失，心肌細胞水腫變性，大量炎性細胞浸潤，受損嚴重的心肌細胞可見小灶狀或片狀壞死；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組大鼠心肌損傷并未發生明顯改善，si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠心肌損傷明顯減輕，可見輕度心肌細胞水腫、肥大，少量炎性細胞浸潤，而si-miR-214組大鼠心肌損傷明顯加重；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠心肌損傷加重；見圖2。
圖2
各組大鼠心肌組織HE染色（黑色箭頭指示炎性細胞浸潤，200×）
2.6 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較
與假手術組相比，模型組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組大鼠心肌細胞凋亡率無明顯變化（P＞0.05），si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），si-miR-214組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；見表6、圖3。
表6
各組大鼠心肌細胞凋亡率比較（
，n=12，%）
圖3
各組大鼠心肌細胞凋亡流式細胞檢測圖
2.7 各組大鼠心肌組織凋亡相關蛋白水平比較
與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-1蛋白水平明顯升高，Bcl-2/Bax比值明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-1蛋白水平和Bcl-2/Bax比值無明顯變化（P＞0.05），si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比值明顯升高，Bax、Caspase-1蛋白水平明顯降低（P＜0.05），si-miR-214組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比值明顯降低，Bax、Caspase-1蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比值明顯降低，Bax、Caspase-1蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；見表7、圖4。
表7
各組大鼠心肌組織凋亡相關蛋白水平比較（
，n=12）
圖4
各組大鼠心肌組織凋亡相關蛋白表達
2.8 雙熒光素酶報告基因檢測結果
通過starbase數據庫預測lncRNA H19包含miR-214的結合位點；見圖5a。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，miR-214高表達明顯抑制了pmirGLO-H19-WT質粒的熒光素酶活性（P＜0.05），對pmirGLO-H19-Mut質粒的熒光素酶活性無顯著影響；見圖5b。
圖5
靶基因預測及H19-WT與H19-Mut的熒光素酶活性
a：靶基因預測；b：H19-WT與H19-Mut的熒光素酶活性；*：與miR-NC相比，
3 討論
CHF不是獨立的疾病，而是各種心臟病發展的最后階段，嚴重威脅人類健康[13]。研究[14]表明，lncRNA可作為miRNA的競爭內源性RNA，在CHF進展中發揮至關重要的作用，是一類有前途的診斷生物標志物。已證實lncRNA H19參與調控心肌肥厚、心肌纖維化發生與發展，可以作為治療心肌梗死的新靶點[15]。lncRNA H19在CHF中的作用與機制值得進一步研究。
炎癥和細胞凋亡是導致CHF和隨后的心臟重塑的兩個關鍵因素。BNP和NT-proBNP是確定心力衰竭診斷和預后的黃金標志物[16]。TNF-α和IL-6是重要的炎癥介質，在心力衰竭中起致病作用[17]。NLRP3炎癥小體在導致心力衰竭進展的各種病理條件下被激活，是心力衰竭期間心臟炎癥的關鍵介質[18]。IL-1β、IL-18是NLRP3炎癥小體激活的細胞因子，已有研究[19]顯示，阻斷IL-1β可降低心力衰竭患者的住院率和死亡率。lncRNA H19是參與心肌炎癥反應和細胞凋亡的關鍵介質[20]。本研究發現，CHF模型大鼠心肌組織中lncRNA H19水平明顯高于假手術組，提示lncRNA H19可能參與CHF的病理過程。為了鑒定lncRNA H19在體內的作用，大鼠尾靜脈注射si-H19穩定地下調lncRNA H19水平，結果顯示CHF模型大鼠心功能明顯好轉，血清心肌損傷標志物（CK-MB、cTnI）和心力衰竭標志物（BNP、NT-proBNP）[21]以及炎癥相關因子（IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6）水平明顯降低，心肌損傷明顯減輕，心肌細胞凋亡明顯減少，心肌組織Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比值明顯升高，Bax、Caspase-1蛋白水平明顯降低；進一步證實下調lncRNA H19可降低炎癥因子水平，減少心肌細胞凋亡，改善CHF。
此外，本研究還發現在CHF模型大鼠心肌組織中miR-214水平明顯低于假手術組大鼠，而在下調lncRNA H19后，miR-214水平呈升高趨勢。已有研究[10]表明，miR-214的過表達可抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應，減輕腦缺血-再灌注大鼠的心肌損傷。我們推測miR-214也可能參與CHF的病理過程，為了驗證此猜想，我們通過尾靜脈注射si-miR-214的重組腺病毒沉默miR-214，發現miR-214沉默后CHF模型大鼠心肌損傷、炎癥反應和心肌細胞凋亡較模型組明顯加重，而采用si-H19和si-miR-214共轉染后，si-miR-214可逆轉si-H19對CHF大鼠的心臟保護作用。我們通過starbase數據庫預測lncRNA H19包含針對miR-214的結合位點。隨后采用雙熒光素酶報告法，用miR-214 mimic與pmirGLO-H19-WT共轉染HEK293T細胞，結果顯示其熒光素酶活性明顯下降，說明lncRNA H19可靶向負調控miR-214；下調lncRNA H19的表達，可上調miR-214水平，減輕CHF大鼠心肌損傷。
細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，是一種高度調節的細胞死亡過程，焦亡不僅會引起局部炎癥，還會導致炎癥反應的放大；通過藥理學或基因干預抑制這一過程在許多情況下具有心臟保護作用[22]。因此，該過程是心血管疾病治療干預的潛在目標。細胞焦亡由兩種主要的信號通路驅動，一種由Caspase-1介導，另一種由Caspase-4/5/11介導。Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑是經典的信號轉導途徑，NLRP3炎性小體被多種外源性或內源性刺激物激活后，活化Caspase-1裂解為具有活性的P20及P10，促進促炎細胞因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放，誘導細胞發生焦亡[23]。據文獻[24]報道，通過激活NLRP3/Caspase-1信號通路可觸發細胞焦亡和心臟肥大。已有生物信息學分析和雙熒光素酶測定法顯示，Caspase-1是miR-214的靶基因，miR-214降低可激活Caspase-1，促進下游細胞因子如IL-1β和IL-18的裂解為成熟形式，參與心肌細胞凋亡和成纖維細胞活化[25]。Yang等[26]發現，沉默LncRNA KCNQ1OT1可通過上調miR-214、下調Caspase-1表達，抑制高糖誘導的心肌細胞凋亡。本研究結果顯示，在CHF模型大鼠中IL-1β、IL-18和Caspase-1的表達均明顯高于假手術組，這提示CHF大鼠心肌細胞中可能存在細胞焦亡。下調lncRNA H19表達后，miR-214的表達水平升高，同時Caspase-1、IL-1β、IL-18水平降低，而miR-214沉默后，IL-1β、IL-18和Caspase-1的表達進一步升高；采用si-H19和si-miR-214共轉染后，si-miR-214可逆轉si-H19對Caspase-1、IL-1β、IL-18表達的抑制作用，這提示沉默lncRNA H19表達可能通過調控miR-214/Caspase-1軸參與CHF的病理過程。
綜上所述，沉默lncRNA H19可通過靶向上調miR-214的表達，抑制Caspase-1的表達，并抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應，減輕CHF大鼠的心肌損傷。因條件限制本研究僅從動物水平進行了探究，后續可考慮采用心肌細胞，從體外細胞水平進行深入研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：張苡榕、鄧永蘭負責實驗設計和實施、數據整理分析以及論文初稿撰寫；楊琳、唐一鋒負責實驗指導、論文設計和審閱；李勇軍、柳麗負責論文審閱與修改。
慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于心肌梗死、炎癥、血流動力學負荷過重等引起心臟結構、功能異常，進而導致心室充盈、射血功能下降，無法將靜脈回流的血液排出心臟，動脈血液供應不足，引發心力衰竭[1]。據調查，中國CHF患病率達0.9%，而且在逐年增加，5年生存率與惡性腫瘤相似[2]。近年來，與CHF相關的發病率和死亡率仍在上升[3-4]。因此，需要鑒定針對該病癥的新型治療靶標。據報道，炎癥與CHF發生發展密切相關[5]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是心臟發育和心臟疾病的強大調節因子[6]。已知lncRNA H19在胚胎組織中大量表達，與心臟發育和血管形成有關[7]，并且已有研究[8]表明lncRNA H19可作為肺動脈高血壓右心衰竭的一種新的生物標志物和治療靶點；然而lncRNA H19是否參與CHF的病理進展及其潛在功能仍不清楚。另有研究[9]發現CHF患者外周血中微小RNA-214（microRNA-214，miR-214）水平顯著低于健康受試者，卡維地洛發揮心臟保護作用的機制之一可能是通過增加miR-214表達；miR-214過表達可抑制心肌細胞凋亡、氧化應激反應和炎癥反應，減輕腦缺血-再灌注大鼠的心肌損傷[10]，表明miR-214是一種重要的心臟保護因子。筆者通過starbase數據庫預測到lncRNA H19包含miR-214的結合位點，miR-214可能是lncRNA H19的靶基因。因此，本研究擬以CHF大鼠為對象，通過沉默lncRNA H19、沉默miR-214探究lncRNA H19對CHF的影響及可能的作用機制，為CHF的診斷及治療提供新的思路與參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SPF級健康SD雄性大鼠，體重（300±10）g，10周齡，由北京維通利華動物中心提供，許可證號：SCXK（京）2019-0011。所有動物均嚴格按照動物飼養規則喂養，環境溫度為（24±2）℃，濕度為50%～60%，12 h明暗交替，自由飲水和攝食。飼養1周充分適應環境后開始實驗。
1.2 基因、試劑與儀器
大鼠lncRNA H19小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、lncRNA H19 siRNA陰性對照、miR-214 siRNA、miR-214 siRNA陰性對照的重組腺病毒及PCR引物均由上海吉瑪基因公司合成。肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）（批號RA20038）、心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）（批號RA20647）、B型腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）（批號RA20446）、N末端B型鈉尿肽前體（N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP）（批號RA20318）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）（批號RA20020）、白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）（批號RA20058）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）（批號RA20607）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（批號RA20035）酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑（批號C0137）、RIPA裂解液（批號P0018K）和BCA試劑盒（批號P0012S）均購自上海碧云天生物技術有限公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（批號SL-50237）、TRIzol提取試劑盒（批號SL-10673）、反轉錄試劑盒（批號SP-20792）及PCR試劑盒（SYBR? Premix Ex TaqTM）（批號SP-70018）均購自上海滬震生物科技有限公司；兔抗鼠B淋巴細胞瘤-2蛋白（B lymphocytoma-2 protein，Bcl-2）（批號ab196495）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）（批號ab53154）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）（批號ab238972）、β-肌動蛋白（β-actin）（批號ab8227）單克隆抗體、羊抗鼠二抗（批號ab205718）均購自美國Abcam公司。超高分辨率小動物超聲影像系統（型號Vevo 2100）購自加拿大VisualSonics公司；多功能酶標儀（型號iMark680）、流式細胞儀（型號C6）、熒光顯微鏡（型號XD-202）均購自中生（蘇州）醫療科技有限公司；熒光定量PCR儀（型號SLAN-48P）、凝膠成像儀（型號JY02G）均購自上海透景生命科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 動物模型制備
參照文獻[11-12]采用腹主動脈縮窄術建立CHF大鼠模型。大鼠于造模前禁食不禁水12 h，腹腔注射40 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，連接肢體心電圖電極和小動物呼吸機，腹部脫毛備皮，碘伏消毒，沿腹中線打開腹腔，撥開腸道，暴露腹主動脈，用4-0號縫合線將腹主動脈與6號鈍不銹鋼針結扎，扎緊后取出不銹鋼針，結扎處明顯縮窄，心電圖示ST段明顯抬高為結扎成功，縫合肌肉、皮膚；術后腹腔注射青霉素20萬單位/kg預防感染。飼養5周后用超高分辨率小動物超聲影像系統檢測左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF），若LVEF<60%即為模型成功[11]。造模大鼠出現射血分數保留型心力衰竭，共93只大鼠參與造模，成功造模84只。
1.3.2 分組和腺病毒轉染
將84只造模成功大鼠隨機分為模型組、si-NC組（轉染lncRNA H19 siRNA陰性對照）、si-H19組（轉染lncRNA H19 siRNA）、si-miR-NC組（轉染miR-214 siRNA陰性對照）、si-miR-214組（轉染miR-214 siRNA）、si-H19+si-miR-NC組（lncRNA H19 siRNA和miR-214 siRNA陰性對照共轉染）、si-H19+si-miR-214組（lncRNA H19 siRNA和miR-214 siRNA共轉染），每組12只。另設假手術組12只（大鼠只穿線不結扎，其余操作同模型組）。各轉染組大鼠使用微量注射器將100 μL相應的腺病毒溶液（1×109 PFU）經尾靜脈注入，假手術組和模型組大鼠注射等量生理鹽水，每周1次，連續4周。
1.3.3 心功能檢測
干預4周后，麻醉大鼠，采用超高分辨率小動物超聲影像系統測量大鼠左心室收縮末期內徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、LVEF、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。
1.3.4 血清指標檢測
心功能檢測完成后，腹主動脈取血，并在高速冷凍離心機中以3 000 r/min離心10 min，取上清。根據試劑盒說明書，通過ELISA法檢測大鼠的CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP、IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平。
1.3.5 心肌組織保存及HE染色
取血完成后，處死大鼠，打開胸腔，取出心臟，并用預冷的生理鹽水洗滌殘留血液。將大鼠心臟分為三部分，一部分液氮速凍后，?80℃冰箱保存待測；一部分心肌組織剪碎后胰酶消化，用于流式細胞術；另一部分心肌組織用4%多聚甲醛溶液固定，4℃過夜，梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察心肌組織病理變化。
1.3.6 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡
心肌組織在充分剪碎后，加入適量的胰酶消化液，37℃混合裂解30 min，70 μm濾網過濾后，1 000 r/min離心10 min，棄去上清，重懸細胞，制成單細胞懸液。將100 μL細胞懸液加入5 mL流式管中，然后加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，避光孵育15 min后，用流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡。
1.3.7 實時熒光定量PCR檢測心肌組織lncRNA H19、miR-214表達
取?80℃冰箱保存的心肌組織，用TRIzol試劑盒提取心肌組織的總RNA，紫外分光光度法檢測總RNA的濃度和純度，使用反轉錄試劑盒進行反轉錄，收集cDNA用于PCR擴增。擴增體系：cDNA 1 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM 10 μL，加入無核酸酶的純水使最終體積為20 μL。擴增條件：95℃孵育10 min；95℃預變性5 s，60℃退火并延伸30 s，總共40個循環。每個樣品設置3個重復孔，并且實驗進行3次。引物序列見表1，GAPDH用作lncRNA H19的內源性對照，而U6用作miR-214的內源性對照，并使用2-Δ?Ct方法分析lncRNA H19、miR-214表達水平。
表1
引物序列
1.3.8 蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-1表達
取?80℃冰箱保存的心肌組織，加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，靜置后離心，提取上清液為總蛋白溶液。用BCA法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品（30 μg/孔），凝膠電泳，濕轉法轉膜，使用5%脫脂奶粉阻斷與膜的非特異性結合，然后將膜與Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）一抗孵育過夜，然后與羊抗鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL顯色，以β-actin為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。
1.3.9 雙熒光素酶報告基因檢測
生物信息學分析預測，lncRNA H19包含針對miR-214的結合位點。為了驗證它們是否可以直接相互作用，我們構建了重組質粒pmirGLO-H19-WT和pmirGLO-H19-Mut。大鼠H19野生型序列（H19-WT）和缺少miR-214結合位點的突變體衍生物（H19-Mut）被亞克隆到熒光素酶基因編碼區的下游。將HEK293T細胞接種到24孔板中，使用Lipofectamine 2000試劑與熒光素酶報道質粒和miR-214模擬物或miR-NC共轉染。轉染后48 h，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統（Promega）檢查每組中的熒光素酶活性。
1.4 統計學分析
所有統計分析均使用SPSS 25.0軟件進行，計量資料服從正態分布，以均數±標準差（±s）描述，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。
1.5 倫理審查
本研究經六盤水市人民醫院倫理委員會批準，批準編號：LSZ-2021-004。
2 結果
2.1 各組大鼠心肌組織lncRNA H19、miR-214水平比較
與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織lncRNA H19水平明顯升高，miR-214水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組大鼠心肌組織lncRNA H19、miR-214水平無明顯變化（P＞0.05），si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠心肌組織lncRNA H19水平明顯降低，miR-214水平明顯升高（P＜0.05），si-miR-214組大鼠心肌組織miR-214水平明顯降低（P＜0.05）；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠miR-214水平明顯降低（P＜0.05）；見表2。
表2
各組大鼠心肌組織lncRNA H19、miR-214水平比較（，n=12）
2.2 各組大鼠的心功能比較
與假手術組相比，模型組大鼠LVESD、LVEDD明顯增加，LVEF、LVFS明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組心功能無明顯變化（P＞0.05），si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠LVESD、LVEDD明顯減小，LVEF、LVFS明顯升高（P＜0.05），si-miR-214組大鼠LVESD、LVEDD明顯增加，LVEF、LVFS明顯降低（P＜0.05）；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠LVESD、LVEDD明顯增加，LVEF、LVFS明顯降低（P＜0.05）；見圖1、表3。
圖1
各組大鼠心臟超聲代表性圖像
表3
各組大鼠心功能比較（，n=12）
2.3 各組大鼠血清心肌損傷標志物和心力衰竭標志物水平比較
與假手術組相比，模型組大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平無明顯變化（P＞0.05），si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平明顯降低（P＜0.05），si-miR-214組大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平明顯升高（P＜0.05）；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠血清CK-MB、cTnI、BNP、NT-proBNP水平明顯升高（P＜0.05）；見表4。
表4
各組大鼠血清心肌損傷標志物和心力衰竭標志物水平比較（，n=12）
2.4 各組大鼠血清炎性相關因子水平比較
與假手術組相比，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平無明顯變化（P＞0.05），si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平明顯降低（P＜0.05），si-miR-214組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平明顯升高（P＜0.05）；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6水平明顯升高（P＜0.05）；見表5。
表5
各組大鼠血清炎性相關因子水平比較（，n=12，pg/mL）
2.5 各組大鼠心肌組織病理學觀察
HE染色結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞形態規則、排列整齊、心肌纖維完整，未見心肌細胞水腫、壞死；模型組大鼠心肌嚴重受損，細胞形態不規則、排列紊亂、局部肌纖維橫紋消失，心肌細胞水腫變性，大量炎性細胞浸潤，受損嚴重的心肌細胞可見小灶狀或片狀壞死；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組大鼠心肌損傷并未發生明顯改善，si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠心肌損傷明顯減輕，可見輕度心肌細胞水腫、肥大，少量炎性細胞浸潤，而si-miR-214組大鼠心肌損傷明顯加重；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠心肌損傷加重；見圖2。
圖2
各組大鼠心肌組織HE染色（黑色箭頭指示炎性細胞浸潤，200×）
2.6 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較
與假手術組相比，模型組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組大鼠心肌細胞凋亡率無明顯變化（P＞0.05），si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），si-miR-214組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；見表6、圖3。
表6
各組大鼠心肌細胞凋亡率比較（，n=12，%）
圖3
各組大鼠心肌細胞凋亡流式細胞檢測圖
2.7 各組大鼠心肌組織凋亡相關蛋白水平比較
與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-1蛋白水平明顯升高，Bcl-2/Bax比值明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，si-NC組和si-miR-NC組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-1蛋白水平和Bcl-2/Bax比值無明顯變化（P＞0.05），si-H19組和si-H19+si-miR-NC組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比值明顯升高，Bax、Caspase-1蛋白水平明顯降低（P＜0.05），si-miR-214組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比值明顯降低，Bax、Caspase-1蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；與si-H19+si-miR-NC組相比，si-H19+si-miR-214組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比值明顯降低，Bax、Caspase-1蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；見表7、圖4。
表7
各組大鼠心肌組織凋亡相關蛋白水平比較（，n=12）
圖4
各組大鼠心肌組織凋亡相關蛋白表達
2.8 雙熒光素酶報告基因檢測結果
通過starbase數據庫預測lncRNA H19包含miR-214的結合位點；見圖5a。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，miR-214高表達明顯抑制了pmirGLO-H19-WT質粒的熒光素酶活性（P＜0.05），對pmirGLO-H19-Mut質粒的熒光素酶活性無顯著影響；見圖5b。
圖5
靶基因預測及H19-WT與H19-Mut的熒光素酶活性
a：靶基因預測；b：H19-WT與H19-Mut的熒光素酶活性；*：與miR-NC相比，
3 討論
CHF不是獨立的疾病，而是各種心臟病發展的最后階段，嚴重威脅人類健康[13]。研究[14]表明，lncRNA可作為miRNA的競爭內源性RNA，在CHF進展中發揮至關重要的作用，是一類有前途的診斷生物標志物。已證實lncRNA H19參與調控心肌肥厚、心肌纖維化發生與發展，可以作為治療心肌梗死的新靶點[15]。lncRNA H19在CHF中的作用與機制值得進一步研究。
炎癥和細胞凋亡是導致CHF和隨后的心臟重塑的兩個關鍵因素。BNP和NT-proBNP是確定心力衰竭診斷和預后的黃金標志物[16]。TNF-α和IL-6是重要的炎癥介質，在心力衰竭中起致病作用[17]。NLRP3炎癥小體在導致心力衰竭進展的各種病理條件下被激活，是心力衰竭期間心臟炎癥的關鍵介質[18]。IL-1β、IL-18是NLRP3炎癥小體激活的細胞因子，已有研究[19]顯示，阻斷IL-1β可降低心力衰竭患者的住院率和死亡率。lncRNA H19是參與心肌炎癥反應和細胞凋亡的關鍵介質[20]。本研究發現，CHF模型大鼠心肌組織中lncRNA H19水平明顯高于假手術組，提示lncRNA H19可能參與CHF的病理過程。為了鑒定lncRNA H19在體內的作用，大鼠尾靜脈注射si-H19穩定地下調lncRNA H19水平，結果顯示CHF模型大鼠心功能明顯好轉，血清心肌損傷標志物（CK-MB、cTnI）和心力衰竭標志物（BNP、NT-proBNP）[21]以及炎癥相關因子（IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6）水平明顯降低，心肌損傷明顯減輕，心肌細胞凋亡明顯減少，心肌組織Bcl-2蛋白水平、Bcl-2/Bax比值明顯升高，Bax、Caspase-1蛋白水平明顯降低；進一步證實下調lncRNA H19可降低炎癥因子水平，減少心肌細胞凋亡，改善CHF。
此外，本研究還發現在CHF模型大鼠心肌組織中miR-214水平明顯低于假手術組大鼠，而在下調lncRNA H19后，miR-214水平呈升高趨勢。已有研究[10]表明，miR-214的過表達可抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應，減輕腦缺血-再灌注大鼠的心肌損傷。我們推測miR-214也可能參與CHF的病理過程，為了驗證此猜想，我們通過尾靜脈注射si-miR-214的重組腺病毒沉默miR-214，發現miR-214沉默后CHF模型大鼠心肌損傷、炎癥反應和心肌細胞凋亡較模型組明顯加重，而采用si-H19和si-miR-214共轉染后，si-miR-214可逆轉si-H19對CHF大鼠的心臟保護作用。我們通過starbase數據庫預測lncRNA H19包含針對miR-214的結合位點。隨后采用雙熒光素酶報告法，用miR-214 mimic與pmirGLO-H19-WT共轉染HEK293T細胞，結果顯示其熒光素酶活性明顯下降，說明lncRNA H19可靶向負調控miR-214；下調lncRNA H19的表達，可上調miR-214水平，減輕CHF大鼠心肌損傷。
細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，是一種高度調節的細胞死亡過程，焦亡不僅會引起局部炎癥，還會導致炎癥反應的放大；通過藥理學或基因干預抑制這一過程在許多情況下具有心臟保護作用[22]。因此，該過程是心血管疾病治療干預的潛在目標。細胞焦亡由兩種主要的信號通路驅動，一種由Caspase-1介導，另一種由Caspase-4/5/11介導。Caspase-1依賴的細胞焦亡途徑是經典的信號轉導途徑，NLRP3炎性小體被多種外源性或內源性刺激物激活后，活化Caspase-1裂解為具有活性的P20及P10，促進促炎細胞因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放，誘導細胞發生焦亡[23]。據文獻[24]報道，通過激活NLRP3/Caspase-1信號通路可觸發細胞焦亡和心臟肥大。已有生物信息學分析和雙熒光素酶測定法顯示，Caspase-1是miR-214的靶基因，miR-214降低可激活Caspase-1，促進下游細胞因子如IL-1β和IL-18的裂解為成熟形式，參與心肌細胞凋亡和成纖維細胞活化[25]。Yang等[26]發現，沉默LncRNA KCNQ1OT1可通過上調miR-214、下調Caspase-1表達，抑制高糖誘導的心肌細胞凋亡。本研究結果顯示，在CHF模型大鼠中IL-1β、IL-18和Caspase-1的表達均明顯高于假手術組，這提示CHF大鼠心肌細胞中可能存在細胞焦亡。下調lncRNA H19表達后，miR-214的表達水平升高，同時Caspase-1、IL-1β、IL-18水平降低，而miR-214沉默后，IL-1β、IL-18和Caspase-1的表達進一步升高；采用si-H19和si-miR-214共轉染后，si-miR-214可逆轉si-H19對Caspase-1、IL-1β、IL-18表達的抑制作用，這提示沉默lncRNA H19表達可能通過調控miR-214/Caspase-1軸參與CHF的病理過程。
綜上所述，沉默lncRNA H19可通過靶向上調miR-214的表達，抑制Caspase-1的表達，并抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應，減輕CHF大鼠的心肌損傷。因條件限制本研究僅從動物水平進行了探究，后續可考慮采用心肌細胞，從體外細胞水平進行深入研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：張苡榕、鄧永蘭負責實驗設計和實施、數據整理分析以及論文初稿撰寫；楊琳、唐一鋒負責實驗指導、論文設計和審閱；李勇軍、柳麗負責論文審閱與修改。
